Extracto
Los estudios previos de nuestro grupo han demostrado que los niveles de expresión de Orc6 fueron muy elevados en las muestras de pacientes de cáncer colorrectal y la inducción de Orc6 se asoció con 5-fluorouracilo (5-FU) de tratamiento. El objetivo de este estudio fue investigar los efectos moleculares y celulares de cáncer de colon en Orc6. En este estudio, utilizamos HCT116 (wt-p53) y HCT116 (null-p53) líneas celulares de cáncer de colon como un sistema modelo para investigar el impacto de Orc6 sobre la proliferación celular, la quimiosensibilidad y vías implicadas con Orc6. Hemos demostrado que la regulación a la baja de Orc6 sensibiliza a las células de cáncer de colon a ambos 5-FU y el tratamiento con cisplatino (cis-pt). Disminución de la expresión Orc6 en las células HCT-116 (peso-p53) por la interferencia de ARN provocó la detención del ciclo celular en la fase G1. la inhibición de la expresión prolongada Orc6 dado lugar a células multinucleadas en HCT-116 (peso-p53) línea celular. análisis de inmunotransferencia Western demostró que la regulación negativa de la expresión de p21 inducida Orc6 en las células HCT-116 (peso-p53). La inducción de p21 fue mediada por aumento del nivel de p53 fosforilada en Ser-15. Por el contrario, no hay elevada expresión de p21 en las células HCT-116 (null-p53). Orc6 regulación a la baja también aumentó la expresión de la proteína de reparación del ADN perjudiciales GADD45β y redujo el nivel de expresión de JNK1. Orc6 puede ser una diana potencial para el desarrollo terapéutico contra el cáncer en el futuro en el cáncer de colon
Visto:. Gavin EJ, Song B, Wang Y, Xi Y, Ju J (2008) Reducción de la Expresión Orc6 sensibiliza cáncer de colon humano Las células a 5-fluorouracilo y cisplatino. PLoS ONE 3 (12): e4054. doi: 10.1371 /journal.pone.0004054
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Investigaciones Ordway, Estados Unidos de América
Recibido: November 26, 2008; Aceptado: 1 de diciembre de 2008; Publicado: December 29, 2008
Derechos de Autor © 2008 Gavin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la genómica del cáncer de laboratorio fondo de la puesta en marcha del Instituto del cáncer de Mitchell (J. Ju) y NIH CA114043 (J. Ju). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Orc6 es uno de la proteína de complejo de seis reconocimiento origen en células humanas. Funciona como la plataforma de montaje inicial que se requiere para la replicación del ADN. Las funciones de Orc6 en la replicación del ADN se han investigado ampliamente tanto en levaduras como Drosophila [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Sin embargo, hay información limitada sobre el cáncer humano [7], [8]. Se ha informado de que, además de su función como una proteína iniciadora de la replicación del ADN, sino que también desempeña un papel clave en el silenciamiento de genes de la transcripción y la formación de heterocromatina [8]. Sin embargo, no está claro durante el montaje complejo de iniciación en el que el paso que Orc6 participa [9]. Se ha demostrado elegantemente por Prasanth
et al.
La dinámica de Orc6 localización durante todo el ciclo celular, incluyendo la replicación del ADN, regregation cromosoma, y la citocinesis. También sugieren Orc6 puede funcionar en la señalización de control del ciclo celular [8]. Nuestro interés en Orc6 derivó de nuestros estudios anteriores con un análisis exhaustivo genómica reveló que Orc6 se asocia con 5-FU resistencia asociada en líneas celulares de cáncer de colon humano [10]. Nuestro estudio de seguimiento con muestras de pacientes colorrectales confirmó además que la expresión de Orc6 es muy elevada en los tejidos tumorales colorrectales humanos en comparación con muestras normales apareadas [11]. Estos resultados confirman la relevancia clínica de Orc6 que conduce a nuestra hipótesis de que Orc6 puede ser un jugador clave que está implicada en el cáncer colorrectal. Su nivel más elevado también puede ser un importante contribuyente a la quimio-resistencia. p53 es uno de los supresores de tumores más frecuentemente alterado en el cáncer colorrectal y debido a su función crítica en el control del ciclo [12], [13]. En este estudio, utilizamos un par de líneas celulares de cáncer de colon, ya sea con p53 de tipo salvaje o p53 nulo como nuestro modelo de sistema.
En este estudio, proporcionar evidencia experimental de que la disminución de la expresión Orc6 de interferencia por ARN puede sensibilizar de colon líneas celulares de cáncer a dos de los principales agentes quimioterapéuticos 5-FU y el tratamiento con cisplatino. La disminución de la expresión Orc6 de siRNA knock-down provocó la detención del ciclo celular y la disminución de la proliferación celular en las células HCT-116 (peso-p53). Por el contrario, este efecto se vio afectada de manera significativa en las células HCT-116 (null-p53). Alteración de control del ciclo celular por disminución de la expresión Orc6 era debido a la inducción de p21, un gen mayor control del ciclo celular. La inducción de p21 era debido al aumento del nivel de phosphorylatd de p53 en la Ser-15 provocada por knock-down de expresión Orc6. Orc6 puede ser una diana potencial para el desarrollo de nuevos antitumoral terapéutica.
Resultados y Discusión
La disminución de la expresión Orc6 en las células HCT-116 (peso-p53) inhibe la proliferación de células
el aumento de los niveles de Orc6 en muestras de cáncer de colon humano nos llevó a investigar los papeles de Orc6 en el control del ciclo celular y la sensibilidad a los fármacos. Utilizando un enfoque de knock-down siRNA, que primero confirmó que los niveles de proteína de Orc6 se redujo usando el análisis de inmunotransferencia Western en tanto HCT (wt-p53) células (Figura 1A, carril 1, siRNA de control no específica; carril 2, siRNA contra células Orc6) y HCT-116 (null-p53) (Figura 1A, carril 3, siRNA de control no específica; carril 4, siRNA contra Orc6). La expresión de la proteína Orc6 se redujo en más de 5 veces en las células HCT (wt-p53) y las células HCT-116 (null-p53).
α-tubulina se utilizó como control (A). El aumento de multinucleación en silenciamiento de Orc6 en las células por siRNA HCT-116 (wt-p53). panel de la izquierda, imagen de luz; Panel derecho, DAPI nuclear (B).
Se ha demostrado previamente que polypoidy Orc6 en células Hela knock-down inducida [8]. Nuestros resultados confirmaron esta transfección en células de cáncer de colon, después de repetidas cada 3 días, HCT-116 (wt-p53) células con expresión reducida Orc6 convirtió multinucleados (Figura 1B). Esta población aumentó con el tiempo. La cromatina se tiñó con 4 ', 6'-diamino-2-fenilindol (DAPI) para mostrar las células multinucleadas después Orc6 desmontables de siRNA sostenidos (imagen Célula de dispersión de la luz panel de la izquierda, la derecha, el panel; DAPI imagen tinción nuclear en la Figura 1B). tasa de proliferación celular se redujo en más del 50% (barra libre) con Orc6 knock-down (Figura 2). Sin embargo, la reducción de la expresión en células Orc6 reducción en la proliferación de células HCT-116 (null-p53) por sólo el 23% (línea discontinua). Para investigar el impacto de la disminución de Orc6 en el control del ciclo celular, las células HCT-116 (peso-p53) y HCT-116 (null-p53) se transfectaron en primer lugar con 100 nM Orc6 siRNA. Las células transfectadas se expusieron a 10 mM 5-FU durante 12 hrs. Se observó que 12 horas más tarde, los dos (WT-p53) las células HCT-116 de control y las células con la reducción de células que expresan Orc6 eran capaces de permanecer en gran medida en la fase G1 del ciclo celular y sin re-entrada (Figura 3A). Por el contrario, se re-introducen HCT-116 (null-p53) células control y células Orc6 reducidos en la fase S del ciclo celular a pesar del daño del ADN por 5-FU y la reducción de Orc6 (Figura 3B). Estos resultados sugieren que el control del ciclo celular después del daño en el ADN es en función de la presencia de p53 de tipo salvaje.
Efecto de Orc6 en quimiosensibilidad al 5-FU y cis-pt
para investigar el impacto potencial de Orc6 en quimiosensibilidad a algunos de los primeros compuestos línea quimioterapéuticos como el 5-FU y cis-pt en el cáncer colorrectal, se utilizaron células HCT-116 (peso-p53) como nuestro sistema modelo utilizando células transfectadas con oligofectamine solo, siRNA no específica, y Orc6 siRNA específico. Después, las células tratadas con 5-FU o cisplatino con dilución en serie. Después de 72 horas, la proliferación celular se cuantificó por WST-1 de ensayo. Figura 4A mostró que las células con expresión reducida Orc6 HCT-116 (wt-p53) eran 5 veces más sensibles al tratamiento con 5-FU en comparación con células de control en base a IC
50 valor. células con expresión reducida Orc6 HCT-116 (wt-p53) también eran más sensibles al tratamiento con cisplatino en comparación con las células control (Figura 4B). Este efecto fue en gran medida ausente de HCT116 (null-p53) células (datos no muestran).
Aguas abajo efectuadas por las vías de señalización Orc6
Para comenzar a entender la corriente abajo vías de señalización potencialmente implicados con Orc6, se utilizó un análisis de expresión génica de alto rendimiento para cuantificar los cambios de expresión génica entre las células transfectadas con siRNA Orc6 específica y el control de siRNA no específica HCT-116 (wt-p53). Expresión y análisis GeneOntology mostraron que un número de genes fueron influenciados por la inhibición Orc6 (datos, S1). En base a los resultados, se confirmó un número de genes conocidos de control del ciclo celular mediante análisis de inmunotransferencia Western. Nuestros resultados mostraron que la expresión de p21 fue inducida significativamente en las células HCT-116 (wt-p53) después Orc6 ronda hacia abajo (Figura 5, carril 1, el control oligo no específico; carril 2, siRNA de Orc6). Se confirmó, además, que la expresión de la proteína de reparación del daño en el ADN Gadd45β también fue inducida por disminución de la expresión Orc6 en las células HCT-116 (wt-p53) (Figura 5, carril 1, el control de siRNA no específica; carril 2, Orc6 siRNA específico). Está bien documentado que Gadd45β juega un papel importante en la detención del ciclo celular, reparación del ADN, la inmunidad innata, el mantenimiento de la estabilidad del genoma y la apoptosis [7], [14], [15], [16]. La función de Gadd45β está mediada a través de interacciones con otras proteínas tales como cdc2 mediante la interrupción de la interacción entre ccd2 y ciclina B1 en el desencadenamiento de G2 detención del ciclo celular /M bajo estrés genotóxico [17], [18]. Nuestros resultados mostraron que Gadd45β es al menos, en parte, responsable de la replicación del ADN defecto provocado por la expresión Orc6 reducida en células de cáncer de colon. La expresión de nivel JNK1 se redujo con la expresión Orc6 reducido (Figura 5). Se ha demostrado que las funciones de JNK1 eran bastante complejo debido a su debido papel en ambas vías de apoptosis y la señalización de supervivencia [19], [20]. Fibroblastos con knockouts JNK son más sensibles a la apoptosis inducida por TNF-[21]. Ratón fibroblastos de embrión que carecen de MKK7 (activador ascendente de JNK) se someten a la senescencia celular y el crecimiento de detención G2 /M, apoyar aún más nuestra conclusión de que la reducción de la expresión de JNK1 puede ser uno de los factores que contribuyen para G2 /M detención causados por knock-down de Orc6 expresión [22]. Estos cambios fueron en gran medida ausente de las células HCT-116 (null-p53) (datos no muestran). Esto es consistente con estudios reportados anteriores que p53 tiene un papel clave en el control del ciclo celular en respuesta al daño del ADN. Con la inducción de la expresión de p21, anticipamos que la posterior expresión de p53 puede incrementarse debido a la p21 es un gen de control del ciclo celular puesto de control conocida mediada por p53. Sin embargo, el nivel celular total de la proteína p53 no se ha modificado con el derribo de la expresión de p53 (Figura 6A, carriles 1 y 2). La inducción de p21 estaba ausente en las células HCT-116 (null-p53) con Orc6 knock-down (Figura 6A, carril 3, el control, el carril 4, siRNA de Orc6). Esto indica que la inducción de la expresión p21 tiene que ser p53 dependiente a pesar de la ausencia de en el nivel de expresión de p53. Aunque el nivel de p53 total de no aumentó en las células HCT-116 (wt-p53), se especula que el nivel de p53 en la fracción nuclear se puede aumentar debido al conocido evento p53 translocación. Mediante la separación de los núcleos y citoplasma, hemos demostrado que el nivel de proteína total de p53 en los núcleos no fue elevado en las células con expresión reducida Orc6 tratado por Orc6 siRNA (Figura 6A) HCT-116 (wt-p53). En lugar de ello, el nivel de p53 fosforilada en Ser-15 se aumentó en la fracción nuclear de células con expresión reducida Orc6 (Figura 6B) HCT-116 (wt-p53). Esto es altamente consistente con un mecanismo bien documentado de p53 en respuesta al daño del ADN (14). p53 fosforilada en Ser-15 residuos puede disminuir su interacción con el regulador negativo, la oncoproteína MDM2.
(A) Análisis de inmunotransferencia Western de p53 y p21 expresión después de Orc6 desmontables de siRNA en tanto HCT-116 células y HCT-116 (null-p53) (carril 3, control no específico; carril 4, siRNA específico para Orc6); (wt-p53) células (carril 2, siRNA específico para Orc6 carril 1, el control no específica) . (B) Análisis de inmunotransferencia Western de la expresión de p53 fosforilada en Ser-15, tanto en la fracción citoplasmática y nuclear en el control de las células (carril 1, citoplasmática, el carril 2, nuclear) HCT-116 (peso-p53) y HCT-116 (peso-p53 ) las células tratadas con ARNsi contra Orc6 (carril 3, citoplasmática; carril 4, nuclear). proteína p53 totales niveles de expresión se utilizaron como proteína de control en las fracciones nucleares y α-tubulina se utilizó como control para las fracciones citoplásmicas.
Parece que la respuesta al daño del ADN causado por un nivel disminuido Orc6 está mediada por p53 vía de control del ciclo celular dependiente. Los autores especulan que el alto nivel de Orc6 en el cáncer colorrectal puede contribuir a la inestabilidad del genoma y tal vez por acumulada miss-lanzamiento de la replicación del ADN con deleciones de p53 /mutaciones en más del 50% de los tumores colorrectales. La pérdida de p53 en tumores colorrectales contribuye aún más a la inestabilidad del genoma y las mutaciones acumuladas. Se necesitan más estudios para comprender plenamente el mecanismo molecular y celular de Orc6 en el cáncer colorrectal. A pesar de su papel esencial en la plataforma de montaje inicial requerida para la replicación del ADN, Orc6 puede tener un potencial como una diana novedosa para el cáncer desarrollo terapéutico. La situación tal vez similar a 26S proteasoma como una diana para el fármaco bortezomib anticuerpo. Inicialmente se pensó que la orientación del proteasoma 26S no es una buena estrategia debido a su papel ubicuo en la degradación de proteínas [23]. Lo más reciente informe de Chen
et al.
Sugiere que Orc6 es prescindible en la actividad de unión al ADN de los Orcos en la levadura. Esto apoya aún más nuestra idea de que la orientación Orc6 en el cáncer colorrectal es una estrategia viable para el desarrollo terapéutico futuro [24].
En conclusión, hemos demostrado, en este estudio, que la regulación negativa de Orc6 en células de cáncer de colon sensibilizar a las células a 5-FU y el tratamiento con cisplatino. Junto con nuestros estudios anteriores que Orc6 fue altamente sobreexpresado en pacientes con cáncer colorrectal, creemos que Orc6 puede tener potencial como diana contra el cáncer novedoso para el desarrollo terapéutico antitumoral futuro.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
Las líneas celulares de cáncer de colon humano, las células HCT-116 (peso-p53) y HCT-116 (null-p53) fueron un regalo del profesor Bert Vogelstein (The Johns Hopkins University, Baltimore, MD) , y se mantuvieron en medio 5A de McCoy (Gibco Laboratories). 5-FU y cisplatino se adquirieron de Sigma.
siRNA transfección
HCT-116 (peso-p53) y HCT-116 (null-p53) se sembraron en bandejas de 6 pocillos a 1 × 10
5cells /pocillo y se transfectaron con oligofectamine, no específicos de control de siRNA o siRNA contra Orc6 a una concentración de 100 nM basado en el protocolo del fabricante (Invitrogen Inc.)
Aislamiento de ARN
ARN total fue aislado de las líneas celulares mediante el uso de reactivo Trizol (Invitrogen, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante a 24 h después de la transfección con siRNA.
análisis de inmunotransferencia Western
las células se rasparon y se lisaron en tampón RIPA (Sigma). Cantidades iguales de muestras de proteína (50 mg) se resolvieron mediante SDS-PAGE en geles al 12% por el método de Laemmli, y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad Laboratories). Las membranas fueron bloqueadas por 5% de leche sin grasa en TBS-T (solución salina tamponada con Tris y 0,5% de Tween-20) a temperatura ambiente durante 1 h. Las proteínas se sondaron con anticuerpo de rata anti-orc6 monoclonal (dilución 1:1000, Upstate Technology), ratón anti-α-tubulina (1:1000 dilución; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), ratón anti-p53 (1:1000 , Santa Cruz) seguido de incubación con un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano secundaria (dilución 1:1,000, Bio-Rad, Hercules, CA). Las proteínas se visualizaron con un sistema de detección de quimioluminiscencia utilizando el Super Señal sustrato (Pierce, Rockford, IL)
tiempo real QRT-PCR análisis
síntesis de ADNc se realizó con el kit de síntesis de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems) utilizando 1 g de RNA total como molde. La mezcla maestra de PCR que contiene TaqMan 2 × PCR Universal Master Mix (No AmpErase UNG), 10 × productos de ensayo y RT TaqMan en un volumen de 25 l se procesaron de la siguiente manera: 95 ° C durante 3 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C para 15 seg y 60 ° C durante 35 seg (n = 3). La señal se recogió en el punto final de cada ciclo. Los valores de expresión génica de Orc6 de cada muestra se calcularon mediante la normalización con los valores de cuantificación relativa de GAPDH de control interno y se representaron.
Análisis del ciclo celular por citometría de flujo
HCT-116 (peso-p53) y HCT-116 (null-p53) se sembraron en bandejas de 6 pocillos a 1 x 10
5cells /pocillo y se transfectaron con ARNsi específico oligofectamine, control no específico siRNA o Orc6 gen en una concentración de 100 nM. Las células fueron tratadas con 5-FU (10 M) 12 horas y las células fueron cosechadas por la tripsina, se lavaron y se marcaron con yoduro de propidio, se lavaron y se resuspendieron en tampón modificado de Krisham y se filtraron para citometría de flujo análisis (BD FACS calibre).
Apoyo a la Información
datos S1.
GeneOntology. Expresión de genes y el análisis GeneOntology de los genes expresados diferencialmente en células control y Orc6 HCT116 knock-down (wt-p53)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004054.s001 gratis (2.77 MB TIF)