Extracto
La autofagia es un proceso celular altamente regulado, dependiente de la energía en proteínas, orgánulos y citoplasma son secuestradas en autofagosomas y se digirieron para mantener la homeostasis celular. La hipótesis de que durante la autofagia inducida en las células cancerosas mediante i) la inanición a través de suero y ácido amino privación o ii) tratamiento con PI-103, una clase I PI3K /inhibidor de mTOR, el metabolismo glicolítico se vería afectada, reduciendo el flujo de lactato, y que esta efecto puede ser reversible. Que probaron el metabolismo durante la autofagia en las células HT29 colorrectal y knock-out HCT116 utilizando espectroscopia de Bax hiperpolarizado
13C-resonancia magnética (MRS) y en estado estacionario
1H-MRS. 24 hr PI103 tratos o el hambre causaron una reducción significativa en la aparente constante de velocidad hacia delante (k
PL) de piruvato a cambio de lactato en comparación con los controles en HT29 (100 M PI-103: 82%, p = 0,05) y HCT116 Bax células -ko (10 M PI-103: 53%, p = 0,05; 20 mM PI-103: 42%, p & lt; 0,0001; inanición: 52%, p & lt; 0,001), asociada con una reducción de la excreción de lactato y lactato intracelular en todo casos, y lactato deshidrogenasa actividad sin cambios (LDH) y el aumento de ratio de + /NADH NAD después del tratamiento PI103 o disminución de la actividad de la LDH y la relación de + /NADH NAD sin cambios después de la inanición. Después de 48 recuperación de horas de tratamiento PI103, k
PL mantuvo por debajo de los niveles de control en las células HT29 (74%, p = 0,02), y aumentó por encima de los valores tratados, pero se mantuvo por debajo de los niveles de control tratados con vehículo las 24 horas en HCT116 Bax-ko células (65%, p = 0,004), ambos fueron acompañados por una reducción sostenida en la excreción de lactato, la recuperación de la relación NAD + /NADH y lactato intracelular. Después de la recuperación de la inanición, k
PL fue significativamente mayor que los controles 24 hr tratados con vehículo (140%, p = 0,05), asociados con un aumento de la actividad de LDH y NAD celular total (H). Los cambios en k
PL y lactato celular y se excreta provisto indicadores medibles de los principales procesos metabólicos starvation- y la autofagia inducida por fármacos acompañan. Los cambios son reversibles, volviendo hacia y superando los valores de control en la recuperación celular, lo que potencialmente identifica resistencia. k
PL (hiperpolarizado
13C-MRS) y lactato (
1H-MRS) proporcionar biomarcadores útiles para el proceso de autofagia, permitiendo la monitorización no invasiva del efecto Warburg
Cita.: Lin G, G ANDRĒJEVA, Wong Fong Te AC, colina DK, Orton MR, Parkes HG, et al. (2014) redujo Efecto Warburg en células de cáncer sometidos a autofagia: SteadyForce Estado
1H-MRS y en tiempo real hiperpolarizado
Estudios 13C-MRS. PLoS ONE 9 (3): e92645. doi: 10.1371 /journal.pone.0092645
Editor: Stephanie Filleur, Universidad Tecnológica de Texas Health Sciences Center, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Junio, 2013; Aceptado: February 25, 2014; Publicado: 25 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores reconocer el apoyo recibido del Cancer Research UK y EPSRC cáncer Centro de la Imagen en asociación con el MRC y el Departamento de Salud (Inglaterra) conceder C1060 /A10334, también la financiación del NHS al Centro de Investigación INDH Biomédica, beca financiada por el MRC, también Chang Gung Médico Fundación (Taiwán) concede CMRPG370443 y CMRPG3B1922. MOL es un Investigador Principal INDH. Los autores también agradecen a Alice Warley en el centro de London College del rey por ultraestructural Imaging (CUI) para obtener ayuda con la microscopía electrónica. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La autofagia es un reversible respuesta celular catabólico lisosoma dependiente activado en la inanición o el estrés mediante el cual las proteínas, orgánulos y citoplasma son secuestradas dentro autofagosomas de doble membrana y posteriormente se digieren y se reciclan para mantener el metabolismo celular [1]. La autofagia es fundamental para mantener la homeostasis celular y es un proceso altamente regulado que se pueden reponer las reservas agotadas de energía durante la inanición de la eliminación y la degradación de los componentes citoplasmáticos. Sin embargo, la activación prolongada de las vías autofágicas puede conducir al agotamiento de los orgánulos y proteínas críticas que puede resultar en la muerte celular [2], [3]. La autofagia se ha investigado en muchos campos de investigación, incluyendo el cáncer [2] - [4], la enfermedad cardiovascular [5] y la neurodegeneración [6], ya que por un lado se proporciona un mecanismo de protección biológica en respuesta a las tensiones celulares pero por otro sino que también puede contribuir a la celda mecanismos de muerte. Este proceso podría paradójicamente permitir que las células cancerosas para sobrevivir en ambientes hostiles y recuperación de la ayuda una vez se elimina la tensión, proporcionando un mecanismo potencial de la resistencia a la terapia [4]. Algunas terapias contra el cáncer, como los inhibidores de PI3K /mTOR, se sabe que inducen la autofagia en las células del cáncer [7], y también pueden inducir la autofagia en los tumores, lo que podría prolongar la supervivencia del tumor [4], [8]. Actualmente, la autofagia es mejor evaluada por observación de vacuolas autofágicas de doble membrana por microscopía electrónica (EM) y el Western Blot de la conversión de LC3I proteína semejante a la ubiquitina a LC3II [9]. Actualmente no hay métodos no invasivos para controlar la inducción de la autofagia o subsiguiente recuperación de la autofagia. Además, los cambios metabólicos que acompañan a la autofagia y la recuperación de este proceso son poco conocidos.
Las células cancerosas a menudo muestran mejorada glucólisis aeróbica, también conocido como el efecto Warburg, con aumento de la regulación transcripcional de un número de enzimas glucolíticas incluyendo lactato deshidrogenasa -A (LDH-A). El aumento de efecto Warburg se ha demostrado para accionar tanto el crecimiento del tumor y la propagación de metástasis y se asocia con un mal resultado en el cáncer [10]. La autofagia implica muchos procesos metabólicos importantes, algunos de los cuales están regulados por las vías de señalización oncogénicas. Existe una considerable interacción entre los puntos de control autofágicos y nodos clave en las vías de señalización oncogénicas, lo que lleva a la vía de inhibidores en algunos casos que afectan directamente el proceso de autofagia, o indirectamente a la modulación de las mismas vías metabólicas que son inducidos por la autofagia [11], [12]. Por ejemplo, la inhibición de la mTORC1 es un motor clave de la inducción de la autofagia en las células del cáncer [11], [12]. estrés celular derivada de la escasez de aminoácidos o la inhibición de PI3K directa podría causar la autofagia mediante la inhibición de la mTORC1 con estos dos procesos que causan efectos metabólicos, además de las que se derivan directamente de la autofagia. Estas situaciones también pueden ser encontradas durante el tratamiento del cáncer en los pacientes.
Imagen de Resonancia Magnética (MRI) es ampliamente utilizado para obtener imágenes en la medicina y MR Spectroscopy (MRS) proporciona un análisis químicamente específica de las concentraciones de metabolitos en extractos de células, células completas , biopsias de tejido y
in vivo
[13]. Los recientes avances en hiperpolarizado
espectroscopia de resonancia 13C-magnética (ERM) que emplean dinámico polarización nuclear (DNP) han permitido una mejora significativa de la
señal de 13C-MRS intrínseca en muchos órdenes de magnitud en una serie de metabolitos y ha permitido reales mediciones -Tiempo de la cinética de una variedad de importantes reacciones enzimáticas endógenas tanto
in vitro
en suspensiones de células enteras viables y
in vivo
en tumores [14]. La aparente constante de velocidad de intercambio de piruvato hiperpolarizado [1-
13C] a lactato (k
PL) ofrece un potencial biomarcador para el diagnóstico metabólico [15] y para evaluar la respuesta al tratamiento [16] - [20]. k
PL también se ha demostrado que disminuye después de la muerte celular inducida por fármacos, que se atribuye a la apoptosis con la activación de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y el agotamiento de los cofactores de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD (H)) [14 ].
se espera que el ciclo del TCA a ser más activos durante la autofagia, como los aminoácidos y los ácidos grasos generados por el proceso de autofagia se utilizan para mantener la homeostasis de la energía [21], lo que lleva a la modulación de la glucólisis aeróbica en la autofagia Células. La hipótesis de que estos cambios conducirían a una reducción en el flujo de piruvato a lactato, que podría ser invertida si las células se recuperaron de la autofagia. En este estudio, se midió la aparente [1-
13C] piruvato a lactato tipo de cambio, k
PL, por el DNP y
13C-MRS, con el fin de desarrollar un biomarcador no invasivo de las drogas inducida por la autofagia y la posterior recuperación de la autofagia, y para obtener más conocimientos sobre los cambios metabólicos que acompañan a la autofagia inducida por fármacos. Se investigaron los cambios metabólicos asociados con longitudinales autofagia inducida por fármacos y su recuperación y los compararon con los cambios metabólicos asociados con el modelo establecido de la autofagia, la inducción por inanición. Se han utilizado dos líneas celulares, HT29 de carcinoma de colon HCT116 y Bax-deficiente (HCT116 Bax-ko) [22], en estos estudios. células HCT116 Bax-KO han deteriorado vías de la apoptosis que permitan la evaluación de los cambios metabólicos asociados con la autofagia inducida por el fármaco en ausencia de apoptosis. La autofagia se indujo en estas células, ya sea por el suero y el hambre de aminoácidos con solución salina equilibrada de Hanks medios de comunicación (HBSS), o por tratamiento con PI-103, una clase I PI3K /inhibidor de mTOR [7].
Nuestra estudio confirma nuestras hipótesis, lo que demuestra que las células sometidas a la autofagia habían reducido k
PL medido con DNP y
13C-MRS, junto con la reducción de lactato intracelular y la excreción de lactato medido por
1H-MRS, lo que refleja un efecto Warburg reducida durante los procesos celulares autofágicos starvation- e inducida por drogas. Estos efectos metabólicos importantes se invierten cuando las células se recuperan de starvation- y la autofagia inducida por fármacos, proporcionando un medio potencial de identificación de la resistencia. Los resultados muestran que las mediciones de k
PL por hiperpolarizado
13C-MRS, así como de lactato por
1H-MRS proporcionar biomarcadores sensibles de los efectos metabólicos asociados con la autofagia starvation- y inducida por el fármaco junto con su recuperación, proporcionando información crítica en un aspecto importante del metabolismo de la célula de cáncer.
Materiales y Métodos
cultivo celular
Todos los medios y reactivos para cultivo celular se adquirieron de Life Technologies . células HT29 (de American Type Culture Collection, ATCC) se cultivaron en medio McCoy 5A con glutamina y HEPES. Las células HCT116 Bax-ko (una especie de regalo del doctor Bert Vogelstein, de Johns Hopkins Medical Center, EE.UU., a través del Dr. Paul Clarke, ICR, Sutton, Reino Unido [23]) se cultivaron en la Dulbecco Modificado Medio Eagle con glutamina, y no aminoácidos esenciales. 10% FCS inactivado por calor con 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina se añadieron en todo medio. Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera y medios de crecimiento reponen cada 48 horas. células HT29 fueron tratados con 100 mM PI-103 durante 24 horas. células HCT116 Bax-KO se trataron con medio HBSS para 6 o 24 h, y con 10 mM o 20 mM PI-103 durante 24 horas.
Para el análisis celular y metabólica de las células recuperado de la autofagia, HBSS 24 hr o células HCT116 Bax-KO y células HT29 100 mu M PI-103 tratadas con 20 mM PI-103 tratadas se mantuvieron durante otras 48 h en DMEM normal (con glutamina, ácidos no esenciales aminoácidos, suero de ternera fetal al 10% y penicilina agregado) o medio McCoy 5A (con glutamina y HEPES) medios de cultivo bajo condiciones estándar, respectivamente.
El análisis del ciclo celular
2 × 10
6 células se fijaron con etanol al 70% durante 30 min a 4 ° C, se incubaron con 100 mg /ml de ARNasa y 40 mg /ml PI en solución salina tamponada con fosfato para 301min a 37 ° C. histogramas de ADN fueron generados por el análisis FACS.
análisis
Anexina V /PI
5 × 10
5 células se resuspendieron en tampón de unión, se incubaron a 25 ° C durante 5 minutos en la oscuridad con 5 l de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -annexin-V y 5 l de PI (BioVision), y analizadas por fluorescencia de células activadas (FACS, BD LSRII citómetro de flujo) para determinar la unión y la exclusión PI anexina.
Western Blot
Los lisados celulares se analizaron por Western Blot como se describe anteriormente [22]. proteína de lisado celular se transfirió a membranas Immobilon-P (Millipore; Bedford MA, EE.UU.). Las transferencias se bloquearon en leche desnatada al 5% o albúmina bovina al 5% y después se incubaron con anticuerpo primario durante pS6RP (Señalización Celular), S6RP (Señalización Celular), P4E-BP1 (Señalización Celular), el total de 4E-BP1 (Señalización Celular) , pAkt (Señalización celular), Akt (Señalización celular) en total, PARP escindida (Señalización celular), caspasa 3 (Señalización celular), LC3 (Señalización celular), MCT-1 (Millipore) o MCT-4 (Santa Cruz Biotechnology). Las membranas se incubaron con anti-anticuerpo secundario de conejo (GE Healthcare). Western blots de α-tubulina (Señalización Celular) proporcionan un control de carga. las interacciones proteína-anticuerpo diana de unión específica se detectaron utilizando mayor quimioluminiscencia más reactivos (Amersham Biosciences, Buckingham-shire, Reino Unido) y la exposición a cualquiera Hyperfilm ECL (Amersham) o XOMAT de Kodak (Rochester, Nueva York, EE.UU.) película de autorradiografía.
lactato deshidrogenasa ensayo enzimático
total de las actividades de LDH celular se midieron utilizando métodos espectro-fotométrico estándar [24]. Las células se recogieron por tratamiento tripsina estándar, se lisaron en hielo en tampón de extracción (trietanolamina /HCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl
2 2 mM, mercaptoetanol 26 mM) y se centrifugó a 16.000 g durante 10 min para dar concentraciones de proteína total en los sobrenadantes de aproximadamente 5 mg /ml. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de soluciones de ensayo (trietanolamina /HCl 60 mM, NADH 0,17 mM, piruvato de sodio 0,4 mM, Triton 0,05%), y las actividades de las enzimas LDH se midió espectrofotométricamente a 340 nm, con actividades enzimáticas medidas como nmol /min por millones de células.
NAD + /NADH medición
relaciones totales de NAD + /NADH celulares se midieron usando un kit de NAD + /NADH cuantificación (Biovision, Mountain View, CA, EE.UU.), según el protocolo proporcionado.
microscopía electrónica
Las células fueron cultivadas en 13 mm platos y fijados durante 4 horas en 2,5% fijador de glutaraldehído en tampón fosfato a 4 ° C. Después de la fijación, las monocapas de células se colocaron en solución de lavado glutaraldehído y, a continuación después de la fijada en Millonigs tetróxido de osmio fijador durante 15-30 minutos. Los cultivos se deshidrataron a través de una serie graduada de 10% a 100% de etanol, se infiltró, y luego embebidas en medio TAAB Premix resina. Los cortes ultrafinos se recogieron sobre rejillas de cobre y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las secciones fueron vistos usando un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H7600.
DNP
estudios de 13C-MRS
[1-
13C] ácido pirúvico que contiene el radical mM OX63 15 libre se polarizadas para 1 hora en un polarizador HyperSense DNP (Oxford Instruments Ltd Molecular Biotools, Abingdon, Reino Unido) a 3.35T y 1,4 K como se ha descrito anteriormente [25]. La muestra polarizada se disolvió en una solución tamponada con fosfato que contiene 50 mM de lactato no marcado, EDTA y NaOH para lograr un pH final de 7. 100 l de esta mezcla se añadió a una suspensión de 500 l de células (~40-80 millones de células) en un tubo de NMR de 5 mm. La concentración final de piruvato polarizada era 8 mM, después de lo cual serial
13C-MRS espectros fueron adquiridos en una sonda de BBO cada 2 s con un pulso de 10 ° de radio-frecuencia en un sistema de 500 MHz Bruker NMR (Bruker Biospin, Coventry, REINO UNIDO). Las células se mantuvieron a 37 ° C en todo. Los espectros de serie eran de fase y línea de base corregida, e integrados utilizando el software Topspin (Bruker Biospin, Coventry, Reino Unido). Las integrales de los picos integrados en los experimentos de piruvato /lactato se representaron como una función del tiempo y de los mínimos cuadrados queda a la medida se llevó a cabo en Matlab (The MathWorks Inc, Natick, MA, EE.UU.). Las constantes de velocidad aparentes se obtuvieron mediante la colocación simultánea de piruvato y lactato integrales a las ecuaciones de Bloch modificados utilizando un modelo de intercambio de dos sitios que incorpora la corrección flip-ángulo como se describe anteriormente [25]. Las constantes de velocidad aparente (k
PL) para la reacción directa de la conversión de piruvato a lactato están normalizados al número de células.
1H-MRS ° extractos de células de cultivo de medio y f
Las células se extrajeron mediante procedimientos de extracción de fase dual como se describe anteriormente [26]. extractos solubles en agua se liofilizaron y se reconstituyó en 700 l de agua deuterado (D
2O, Sigma Aldrich) y los extractos (500 l) colocados en tubos de 5 mm de RMN. 50 l de 0,75% de sodio 3-trimetilsilil-2,2,3,3-tetradeuteropropionate (TSP) en D
2O (Sigma Aldrich) se añadió a las muestras para la calibración de desplazamiento químico y de cuantificación. muestras de medio de cultivo de células después de varios regímenes de tratamiento también se analizaron mediante
1H-MRS, recogidos antes se recogieron las células para las extracciones celulares. 500 l de muestra de medios y 50 l de D
2O se coloca en el tubo de RMN con 50 l de 0,75% TSP en D
2O para la calibración del desplazamiento químico y cuantificación. asignaciones espectrales se basan en los valores de la literatura [27].
espectros 1H se obtuvieron con un espectrómetro Bruker 500 MHz (Alemania) con 7500 Hz anchura espectral, 16384 puntos de dominio de tiempo, 128 barridos, 298K temperatura, tiempo de adquisición de aproximadamente 5 minutos. La resonancia del agua se suprimió por irradiación cerrada centrada en la frecuencia de agua. procesamiento espectral se llevó a cabo utilizando el Topspin-2 paquete de software (Bruker Biospin, Coventry, Reino Unido), y se cuantificaron las concentraciones de metabolitos y se normalizó al número de células.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como la media ± error estándar de la media. Para la comparación de flujo metabólico, las concentraciones de metabolitos y proporciones, se utilizó la prueba t de Student no pareado con un valor de p de ≤0.05 consideró estadísticamente significativo. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras.
Resultados
PI-103-tratamiento y el hambre provoca autofagia reversible en células HT29 y HCT116 Bax-ko
se observó inducción de la autofagia
en las células HT29 HCT116 Bax-ko y se trató con PI-103, según lo confirmado por la sobre-expresión de LC3II en transferencias Western (Figura 1a yb). La inducción de la autofagia y la sobre expresión de LC3II también se encontró en las células HCT116 Bax-KO después de 6 y 24 h de inanición en las células HCT116 Bax-KO (Figura 1a). Un mayor nivel de LC3I y LC3II expresión fue visto después de 24 horas de inanición cuando se compara con el hambre de 6 horas. Después de la retirada del tratamiento PI-103 o la reposición de medio de crecimiento normal después de 24 h de tratamiento PI-103 o el hambre, respectivamente, la sobre-expresión de LC3II volvieron a los niveles basales después de 48 h de recuperación (Figura 1b-d). Por lo tanto, se eligió el 48 horas de duración punto siguiente de hambre de 24 horas o el tratamiento PI-103 para el
mediciones de recuperación 1H-MRS y DNP. No hubo indicación de la apoptosis como se muestra por la falta de PARP escindido o cambio en la caspasa 3 en células expresiones-103 tratadas con PI o hambre (Figura 1a-d). Con el fin de obtener un control positivo para la apoptosis, la apoptosis se indujo en las células HCT116 de tipo salvaje (WT) por tratamiento TRAIL, como TRAIL se ha informado de inducir apoptosis en las células HCT116 WT [22]. Como era de esperar, la presencia de PARP escindida y reducción del nivel de la caspasa 3 se observaron en las células HCT116 WT TRAIL tratados en comparación con los controles tratados con vehículo (Figura 1B y C).
(a) Western blots de LC3, PARP escindida, caspasa 3 y α-tubulina en las células HCT116 de control de Bax-ko y en el 10 M o 20 M PI-103-tratada o células HCT116 Bax-ko HBSS tratados con 6 hr y 24 hr. (B) Las transferencias Western de LC3, exfoliados PARP, caspasa 3 y α-tubulina en las células HT29 de control y en 24 horas 100 células HT29 mu M-103-PI tratada y a las 24 horas, 48 horas y 72 horas de su recuperación. células HCT116 WT TRAIL tratados se utilizan como control positivo para la apoptosis, como TRAIL se ha informado de inducir apoptosis en las células HCT116 WT [22]. Como se esperaba, se observaron la presencia de PARP escindida y altamente reducidos caspasa 3 expresiones en las células WT HCT116 TRAIL tratados con 24 hr en comparación con los controles tratados con vehículo. (C) Las transferencias Western de LC3, exfoliados PARP, caspasa 3 y α-tubulina en el control de las células HCT116 Bax-ko y en 24 h 20 células HCT116 Bax-ko tratadas con PI-103 M y a las 24 horas y 48 horas de su recuperación . células HCT116 WT TRAIL tratados se utilizan como control positivo para la apoptosis. (D) transferencias Western de LC3, exfoliados PARP, la caspasa 3 y α-tubulina en el control de células HCT116 Bax-KO y en 24 h de células HCT116 Bax-ko tratados con HBSS y a las 24 y 48 h de su recuperación.
la presencia de vacuolas autofágicos fue confirmada por microscopía electrónica realizada en Starved (como autofagosomas de doble membrana) o tratado con PI-103 (predominantemente como estructuras autolysosomal etapa posterior) células HCT116 Bax-ko, lo que indica la inducción de autofagia (Figura 2). vacuolas autofágicos estaban ausentes en las células control.
imágenes de microscopía electrónica de vacuolas en el control autofágicos, 10 mM o 20 mM PI-103 tratadas o células HCT116 Bax-ko HBSS tratados con 6 hr y 24 hr. Las flechas rojas ilustran algunas de las vacuolas autofágicas en diferentes etapas del proceso de la autofagia.
Los niveles de apoptosis y necrosis en células HT29 y HCT116 Bax-ko bajo inanición y tratamiento PI-103 se evaluaron en células adherentes por anexina V /análisis PI (Figura 3a), demostrando una mayoría de células viables con un pequeño porcentaje de necrótico (HT29 tratado con DMSO (control de vehículo): 6,5 ± 2,2%; 100 M PI-103: 10,7 ± 2,7% (p = 0,29); HCT116 Bax-ko tratado con DMSO (control de vehículo): 1,5 ± 0,1%; 6 hr hambre: 1,9 ± 0,2% (p = 0,06) y 24 hr hambre: 3,0 ± 0,4% (p = 0,01); 10 M PI-103: 4,6 ± 0,4% (p = 0,02) y 20 M PI-103: 6,6 ± 0,4% (p = 0,79)) o células apoptóticas (HT29 tratadas con DMSO: 1,0 ± 0,7%; 100 mM PI- 103: 2,0 ± 1,4% (p = 0,54); HCT116 Bax-ko vehículo de control de: 6,6 ± 0,5%; 6 hr hambre: 10,5 ± 0,8% (p = 0,001) y 24 hr hambre: 13,8 ± 0,8% (p = 0,003); 10 M PI-103: 4,0 ± 0,1% (p = 0,26) y 20 M PI-103: 4,1 ± 0,2% (p = 0,30)) en el control y los grupos tratados. No se observaron células flotantes en cualquiera de los grupos tratados.
(a) Anexina V y yoduro de propidio tinción (PI) de ensayo de medición de la proporción de células que experimentan apoptosis y necrosis en las células HT29 después de 24 h de 100 PI mu M -103 células HCT116 de tratamiento y Bax-ko siguientes 24 h de 10 mM o 20 mM tratamiento con PI-103, o 6 horas o 24 horas de inanición. Los datos se expresan como porcentaje medio de ± s.e.m. (Mínimo
n
= 3 en cada grupo). Estadísticamente se indican cambios significativos (* p & lt; 0,05). (B) El número de células en comparación con los controles tratados con DMSO 24 horas en células HT29 siguientes 24 horas de recuperación tratado con DMSO, 24 h de 100 mM tratamiento con PI-103 y sus controles tratados con vehículo 48 de recuperación hr y 24 hr en HCT116 Bax-ko células después de 24 h de 10 mM o 20 mM tratamiento con PI-103, o 6 horas o 24 horas de hambre y su recuperación de 24 h de 20 mM tratamiento con PI-103 o el hambre. Los datos se expresan como porcentaje medio de ± s.e.m. (Mínimo
n
= 3 en cada grupo). Estadísticamente se indican cambios significativos (* p & lt; 0,05). análisis (c) del ciclo celular. Los datos son medias de porcentaje ± s.e.m. células HT29 de control las 24 horas tratado con DMSO, control de DMSO-recuperado 24 h, 24 h PI-103-tratada 100 mM, 24 hr PI-103-recuperado, 48 h-103-PI se recuperó, (
n
= 3 en cada grupo); HCT116 Bax-ko células de control tratado con DMSO 24 horas, control de DMSO-recuperado 24 h, 24 h PI-103-tratada 20 M, 24 hr PI-103 se recuperó-48 hr-103 se recuperó-PI, (
n
= 3 en cada grupo); Las células HCT116 Bax-ko de control de 6 horas de almacenamiento llena, 6 horas de hambre (HBSS), los medios de control completo de 24 horas, 24 horas de hambre (HBSS), 48 hr HBSS-recuperado (
n
= 3 en cada grupo) . * P & lt;. 0,01
A redujo fue encontrado número de células adherentes en todos los grupos de tratamiento después de 24 h de 100 tratamientos M en células HT29 (78 ± 2%, p & lt; 0,01), 6 horas y se 24 h de inanición (46 ± 0,1% y 36 ± 0,4%, respectivamente, p & lt; 0,01) o 24 h de 10 mM y 20 mM PI-103 de tratamiento (65 ± 0,1% y 58 ± 0,1%, respectivamente, p & lt; 0,01 ) en las células HCT116 Bax-KO en comparación con los controles (Figura 3b). inducida por PI-103 Se observó un aumento en el número de células adherentes por encima de los niveles de control tratados con vehículo 24 h en (170 ± 8%, p & lt; 0,05 (HCT116 Bax-ko); 303 ± 16%, p & lt; 0,01 ( HT29)) y la inanición inducida (117 ± 7%, p & lt; 0,05 células) y autofágicas siguiente 48 h de recuperación (Figura 3b), indicando que la población de células aumentó por encima de los niveles de control después de la recuperación de la autofagia. Se utilizaron las células tratadas con vehículo las 24 horas como controles para los grupos de tratamiento y recuperación, ya que las células de control serían demasiado confluentes en un 48 horas de recuperación.
Se realizó un análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo en cada grupo de tratamiento y después de 24 horas y 48 horas de recuperación (Figura 3c). A 24 hr de recuperación de punto de tiempo para los controles tratados con DMSO se incluyó también para cada experimento PI-103 como el número de células de estos grupos son similares a los números de células de las células tratadas con PI-103 siguiente 48 h de recuperación. se observó detención en G1 en células HT29 y HCT116 Bax-KO después del tratamiento con PI-103, volviendo al nivel tratado con DMSO 24 h por 48 h de recuperación (Figura 3c). Aumento de la fase G1 también se encontró en 24 hr recuperó DMSO tratados con HT29 (9 ± 3%, p = 0,01) y HCT116 Bax-ko (11 ± 1%, p = 0,004), las células en comparación con las células tratadas con DMSO 24 hr. Los porcentajes de 24 hr recuperaron las células tratados con DMSO en cada fase del ciclo celular son muy similares a la 48 hr recuperó PI-103-tratada punto de tiempo tanto en las células HCT116 Bax-KO (Figura 3c) HT29 y. Esto puede ser
debido al control recuperado (DMSO tratos) y las células tratadas con PI-103 son más confluente en estos puntos de tiempo, que es coherente con sus números de células comparables.
Sin cambio en el ciclo celular se observó el perfil de las células HCT116 Bax-KO después de 6 o 24 horas de inanición (Figura 3c). Una disminución en la G1 (12 ± 4%, p = 0,04) y un aumento en la fase G2 (5 ± 1%, p = 0,003) se encontraron en 48 hr recuperaron las células HCT116 Bax-KO en comparación con el control de los medios de comunicación tratado con 24 hr las células y el número de células son similares entre los dos grupos (Figura 3C). No se observó ningún cambio significativo en el tamaño celular en ninguno de los grupos de tratamiento en comparación con los controles.
tratamiento PI-103 reduce la activación de AKT y mTOR en células HT29 y HCT116 Bax-KO y este proceso es reversible
los efectos del tratamiento PI-103 en la AKT y vías mTORC se examinaron en las células HT29 y HCT116 Bax-KO durante el tratamiento y durante 24 y 48 h de recuperación. La disminución de la expresión de pAkt y P4E-BP1 se observó en las células HT29 y HCT116 Bax-ko tras 24 horas de tratamiento con PI-103 con la expresión de estas proteínas que vuelven a los niveles previos al tratamiento después de 48 h de recuperación (Figura 4A y B). expresión PS6 reducido también se encontró en las células HCT116 Bax-ko tratadas con PI-103 y su nivel se recuperó de 24 h de recuperación (Figura 4b). Tomados en conjunto, estos datos indican que el tratamiento con PI-103 inhibe la ruta AKT y mTOR en ambas líneas celulares y este proceso es reversible cuando el fármaco se retira y se deja que las células se recuperaran.
transferencias Western de PS6 proteína ribosomal, proteínas totales ribsomal S6, P4E-BP1, el total de 4E-BP1, pAkt, Akt total y α-tubulina (control de carga) en PI-103-tratada y su recuperación en células HT29 y HCT116 Bax-ko.
en tiempo real aparente
13C-piruvato a lactato tipos de cambio se reducen en PI-103-y la autofagia inducida por el hambre, que queda reducida tras recuperarse de la PI-103, pero el aumento de la recuperación de hambre
hiperpolarizado [1-
13C] piruvato a lactato de cambio fue monitoreada en tiempo real por
13C-MRS para medir la cinética de intercambio en las células autofágicos. La figura 5a muestra la media
13C-MR espectros calculados para cada grupo sumando largo de toda la serie de tiempo dinámico para las suspensiones de células HCT116 Bax-ko después de la adición de piruvato hiperpolarizado [1-
13C] en el control, 24 horas inanición y 48 h de recuperación de la autofagia. La figura 5b muestra la correspondiente serie de tiempo de la integral de pico normalizada de la señal de lactato en los mismos grupos. tipo de cambio constante aparente k
PL se midieron por mínimos cuadrados no lineales ajustados a los datos dinámicos en cada grupo y los datos se presentan como proporciones (tratadas control del vehículo /24 h) en la figura 5c.
(a) hiperpolarizado
13C-espectro de un ensayo de células HCT116 Bax-ko que muestra la suma sobre toda la serie de tiempo dinámico de un experimento de células de control, siguiendo la inanición 6 horas, 24 inanición h con medios HBSS y después de la hambruna de 24 horas seguidas por 48 la recuperación de células hr. El espectro muestra picos de piruvato (Pyr), lactato (Lac) y piruvato hidrato (Pyr H). (B) Plot del pico de lactato integral como una función del tiempo, normalizado para el pico piruvato integral en el tiempo t = 0 s y normalizado por millón de células adquiridas de las células de control HCT116 Bax-ko, el hambre 24 hr con medio de HBSS y el hambre 24 hr seguido por 48 hr recuperación. (C) Las relaciones medias (tratado /24 hr vehículo de control) de la velocidad de reacción hacia adelante aparente de piruvato a lactato de cambio k
PL (derivado de ajuste de los datos experimentales y se normalizó al número de células) (± SEM) de 24 horas de recuperación tratado con DMSO, 100 M PI-103 tratada y de recuperación de 48 horas después de 100 mM tratamiento con PI-103 en las células HT29; para 10 M PI-103 tratado, 20 M PI-103 tratada y de recuperación de 48 horas después del tratamiento 20 M PI-103 en las células HCT116 Bax-ko; y durante 6 horas HBSS el hambre, las 24 horas HBSS el hambre y la inanición de 24 horas seguido de 48 horas de recuperación en las células HCT116 Bax-ko. Mínimo
n
= 3 en cada grupo. Estadísticamente se indican cambios significativos (* p = 0.05)
Disminución k
PL se observaron en las células HT29 tratadas con PI-103. (82 ± 7% de control; p = 0,05) ( Figura 5c). No hay diferencia significativa en k
PL se encontró entre el grupo tratado 24 hr vehículo DMSO y el 24 hr recuperó DMSO-vehículo grupo tratado (Figura 5c) en células HT29, a pesar del número de células y la población de células en la fase G1 siendo más alta en el 24 hr recuperaron grupo tratado con DMSO (Figura 3b y c). Por lo tanto, k
PL en los grupos de recuperación se comparó con sus respectivos controles tratados con vehículo las 24 horas. k
PL se mantuvo más baja en las células HT29 después de 48 h de recuperación de tratamiento PI-103 (74 ± 4% de control; p = 0,02)., en comparación con los controles tratados con DMSO 24 hr (Figura 5C)
k Reducción
PL se encuentra en las células HCT116 Bax-ko tratados con 10 M (52,5 ± 9,4% del control; p = 0,05) y 20 M PI-103 (41,1 ± 5,3% del control; p & lt; 0,0001 ) en comparación con los controles DMSO-vehículo (Figura 5c). Después de 48 h de recuperación de la constante de velocidad aparente fue elevado en comparación con las tasas de tratamiento, pero no volvió a tasas de control tratados con vehículo las 24 horas (65 ± 7% del control, p = 0,004). (Figura 5c)