Extracto
Sobre regulación del gen de la apoptosis-regulatorio
MCL-1 gratis (células de leucemia mieloide-1) ocurre en diferentes tipos de cáncer y está relacionado con la resistencia a fármacos para terapias contra el cáncer. Es bien sabido que MCL-1 pre-mRNA se somete a eventos de empalme alternativos para producir dos proteínas funcionalmente distintas, MCL-1
S (pro-apoptótica) y MCL-l
L (anti-apoptótica); este último isoforma predominante en diferentes tipos de cáncer como el de mama y las células de cáncer de ovario. En el presente estudio se reporta que la proteína de unión al ARN (RBP) y SRSF1 proto-oncogén (serina y arginina ricos en factor de empalme 1) influye en el empalme de MCL-1 en ambos-231 MDA-MB células de cáncer de mama MCF-7 y y células JAR coriocarcinoma; también muestran por primera vez que otro RBP SRSF5 afecta de empalme de MCL-1 en las células MCF-7. Por otra parte, informamos que SRSF1 está involucrado en otros aspectos de la regulación MCL-1, con la eliminación de SRSF1, por RNAi, lo que resulta en una disminución significativa en los niveles de proteína MCL-1 en células MCF-7, pero un aumento en las células JAR, respectivamente, por que puedan afectar a la estabilidad de proteínas y la traducción de MCL-l. Las principales conclusiones de este estudio destacan la importancia del contexto celular de las células cancerosas diferentes para la función de las prácticas comerciales restrictivas multifuncionales como SRSF1 y tienen implicaciones para los enfoques terapéuticos empleados para apuntar MCL-1 |
Visto:. Gautrey NS, Tyson -Capper AJ (2012) Reglamento de MCL-1 por SRSF1 y SRSF5 en las células cancerosas. PLoS ONE 7 (12): e51497. doi: 10.1371 /journal.pone.0051497
Editor: Justin L. Mott de la Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 4 Julio, 2012; Aceptado: 1 Noviembre 2012; Publicado: 17 Diciembre, 2012
Derechos de Autor © 2012 Gautrey, Tyson-taponadora. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo contó con el apoyo de una beca de la Fundación JGW Patterson y financiación complementaria de la salud Beneficencia Newcastle (RVI /NGH) y Newcastle upon Tyne Hospitales NHS Caridad (FH). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la apoptosis o muerte celular programada es un proceso importante implicado en el desarrollo y la homeostasis de los tejidos normales, y su desregulación puede resultar en cáncer. Un número significativo de factores de apoptosis han demostrado ser regulada por corte y empalme alternativo; esto incluye la familia de proteínas Bcl-2 que controla la vía intrínseca (mitocondrial) la muerte celular [1], [2], la Figura 1A. La familia Bcl-2 contiene tanto pro-apoptótica y las proteínas anti-apoptóticas, y es el equilibrio entre los dos que determina si se activa la vía [3], [4]. La familia Bcl-2 se puede subdividir en tres grupos basados en su estructura y función. Los anti-apoptóticas Bcl-2 proteínas contienen múltiples dominios de homología de Bcl-2 (BH) y también lo son estructuralmente similares a Bcl-2, que es también un miembro de este grupo. Los pro-apoptóticas Bcl-2 proteínas se dividen en dos subgrupos, el primer grupo también son estructuralmente similares a Bcl-2 con múltiples dominios BH, e incluyen las proteínas Bak y Bax. El segundo grupo de proteínas pro-apoptóticas sólo contienen el dominio BH3. La apoptosis se activa cuando las proteínas pro-apoptóticas Bak y Bax causan mitocondrial permeabilización de la membrana externa. Los miembros de la familia Bcl-2 anti-apoptóticas Para prevenir esto, la unión a las proteínas pro-apoptótica Bax y Bak. El BH3-only proteínas puede activar la apoptosis a través de dos rutas en primer lugar, a través de la activación directa de Bak y Bax, y en segundo lugar mediante la unión a las proteínas anti-apoptóticas, lo que permite la liberación de Bak y Bax.
MCL-1 es una miembro de la familia Bcl-2 de reguladores de la apoptosis. La sobreexpresión de MCL-1 se ha encontrado en una amplia gama de tejidos de cáncer [5], [6], [7], así como las líneas celulares de cáncer [8]. Además, el aumento de expresión de MCL-1 se ha asociado con un mal pronóstico en cáncer de mama [9]. MCL-1 también parece ser un factor importante implicado en la resistencia a terapias contra el cáncer, y su regulación a la baja ha demostrado ser eficaz en la inducción de la apoptosis [7], [10], [11], [12].
La
MCL-1 | gen contiene tres exones y codifica dos proteínas, la anti-apoptóticos MCL-1
L y el pro-apoptótica MCL-1
S [13], [14]. La transcripción de longitud completa que contiene todos los tres exones codifica MCL-1
L, que contiene BH1, 2, y 3, así como un dominio TM. Esto resulta en una proteína anti-apoptótica de Bcl-2 que se produce. MCL-1
S tiene el segundo exón empalmado a cabo lo que resulta en un cambio de aguas abajo en el marco de lectura dejando sólo el dominio BH3 restante (Figura 1B). MCL-1
S parece ejercer su efecto pro-apoptótico de una manera similar a otras proteínas BH3-sólo mediante la unión a anti-apoptóticas Bcl-2 de proteínas, y más específicamente de Mcl-1
S se une sólo a MCL -1
L [13], [15].
un interruptor en el splicing alternativo de MCL-1 ha sido hasta ahora demostrado que se producen en la mama y el cáncer de ovario, con la existencia de un aumento de la anti-apoptótica de Mcl-1
L isoforma en tejidos de cáncer [16]. A pesar de esto, se sabe muy poco acerca del mecanismo que regula el interruptor en el empalme o las proteínas del factor de empalme que intervienen en la inclusión o exclusión del segundo exón. Hasta ahora, sólo dos miembros de la familia de proteínas SR, SRSF1 y 3, han sido identificados como que afecta el empalme alternativo de MCL-1 [17]. Con relevancia para este estudio una gama de diferentes factores de empalme se ha demostrado que tienen alteraciones en la expresión en tejidos de cáncer [18]; estos incluyen SRSF1 [19] y SRSF3 [20], que se regula positivamente en una amplia gama de tipos de cáncer y han sido identificados como los proto-oncogenes, y SRSF5 que se sobreexpresa en el cáncer de mama [21].
El objetivo del presente trabajo fue investigar cómo MCL-1 está regulada en las células cancerosas e identificar células específicas ARN proteínas de unión (prácticas comerciales restrictivas) que participan en la promoción de la inclusión del segundo exón del
MCL-1 | gen. Esto se logró mediante el uso de knockdown de genes específicos de una gama de diferentes prácticas comerciales restrictivas, seguido de la medición de los niveles de las isoformas de corte y empalme-específico.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
dos líneas celulares de cáncer diferentes se seleccionaron inicialmente para este estudio (Figura 2), células MCF-7 de adenocarcinoma de cáncer de mama (que se describe como que tiene un fenotipo de bajo invasión
in-vitro
) y células de coriocarcinoma JAR; otra célula de cáncer de mama MDA-MB-231 células (que se describe como teniendo un fenotipo invasivo
in-vitro
) se añadió al estudio para la comparación (ATCC, LCG). MCF-7 y las células MDA-MB-231 se mantuvieron en DMEM (Sigma-Aldrich) que contiene 10% de suero de ternera fetal, L-glutamina y penicilina estreptomicina. células JAR se mantuvieron en RPMI-1640 (ATCC, LCG) que contiene 10% de suero de ternera fetal y penicilina estreptomicina. Las células se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2. Las células fueron tratadas con 20 nM de la rapamicina, 35 mg /ml de cicloheximida o 1 mg de inhibidor de proteasa ml /(Sigma-Aldrich) donde se indica.
(A) El (mitocondrial) vía de la muerte celular intrínseca es controlado por la familia de proteínas Bcl-2, incluyendo las proteínas BH3-solamente, anti-apoptóticas Bcl-2 de proteínas, Bax, Bak y Bid. (B) El
MCL-1 | génica consiste en tres exones; el anti-apoptótica MCL-1
L y el pro-apoptótica MCL-1
S isoformas de la proteína son el resultado de la inclusión y la omisión del exón 2 (caja abierta), respectivamente.
Top panel muestra isoformas de empalme Mcl en lisado de células JAR disponible en el mercado, células MCF-7 y las células JAR. La detección por Western Blot de las variantes de corte y empalme MCL-1, SRSF1-6 y la GAPDH control de carga de 40 ug de lisado celular total de las células MCF-7 y JAR.
Gene Knockdown por RNAi
Todas las células se transfectaron inversa con Silencer® Seleccionar siRNA (Ambion, Tabla 1),
Silenciador
® control negativo siRNA (Ambion),
Silenciador
de control ® Seleccionar GAPDH positiva siRNA (Ambion ) y SIPORT ™
NeoFX
™ transfección Agent (Ambion) usando el siguiente protocolo optimizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 5,9 × 10
4 células MCF-7 y 4 × 10
4 células JAR se sembraron en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. JAR células fueron transfectadas con 4 ul /ml y MCF-7 y MDA-MB-231 células con 2 ul /ml de SIPORT ™
NeoFX
™ agente de transfección; Todas las células se transfectaron con 6 nM siRNA. Las células y los siRNA se incubaron juntos a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2. Se recogió el ARN 48 y 72 horas después de la transfección y la proteína recogido 72 horas después de la transfección. En todos los experimentos se evaluaron los niveles de caída por RNAi a nivel de ARN y proteínas mediante PCR e inmunotransferencia, como se ha descrito.
inmunotransferencia
Las células se lavaron en PBS frío y luego recogido en tampón RIPA (25 mM Tris-HCl, pH 7,6, NaCl 150 mM, 1% NP-40, desoxicolato sódico al 0,1% y 0,1% de SDS) para la cuantificación de proteínas seguido de la adición de tampón de muestra y luego se desnaturalizaron por calor a 95 ° C durante 5 minutos. Proteína lisados se separaron usando electroforesis en 12% SDS-gel de poliacrilamida (PAGE) geles y se transfirieron electroforéticamente a una membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon durante 1 hora con PBS que contiene 10% de leche en polvo seca, y se sondaron con anti-ratón, ya sea de Mcl-1 (1:500, Santa Cruz), de conejo anti-GAPDH (1:1000, Santa Cruz), anti-ratón SF2 /ASF (1:1000, SRSF1, Zymed), de conejo anti-SC35 (1:100, SRSF2, Abgent), ratón anti-SRp20 (1:1000, SRSF3, Zymed), de conejo anti-SRp75 (1:500, SRSF4, Abcam), de cabra anti-SRp40 (1:500, SRSF5, Zymed), de conejo anti-SRp55 (1:2000, SRSF6, Aviva Biología de Sistemas) durante la noche a 4 ° C. Después de lavar en PBS se añadieron los anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiadas diluidos en PBS. ECL o Super Señal Femto ECL (Pierce) se utilizaron para la detección de proteínas. Donde se indique, el análisis densitométrico se realizó con un sistema de documentación de gel UVP y cuantificación realizó utilizando el software ImageJ. Los datos se analizaron posteriormente mediante un ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Tukey '.
El aislamiento de ARN y semi-cuantitativos RT-PCR
El ARN total se extrajo con columnas RNeasy de spin (Qiagen) y tratado con DNasa I (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Uno g de ARN total fue transcrito utilizando oligo (dT) cebadores inversos y Superscript II de la transcriptasa reversa (RT) (Invitrogen, Life Technologies). PCR se realizaron con el ADNc, cebadores específicos (Tabla 2) y mezcla maestra de PCR (Promega). Los cebadores para MCL-1 fueron diseñados para ser cualquiera de los lados del exón 2 de modo que pudieran detectar tanto MCL-1
S y MCL-1
L y distinguir las dos isoformas por tamaño. (Figura 3A). Los controles negativos, que carecían de RT durante la preparación del ADNc se incluyeron para controlar la contaminación genómica. Los productos de ADNc se separaron mediante electroforesis en 1,5% (w /v) de geles de agarosa, se visualizaron bajo UV después de la tinción con bromuro de etidio.
células MCF-7 se transfectaron con SRSF1-6, Tra2β, SREK1, GAPDH (G ) y el control negativo (CN) siRNAs, o tratados con vehículo (lípidos) solamente (V), o se dejaron sin tratar (UT). (A) Semi-RT-PCR cuantitativa que muestra ambos MCL-1 variantes de corte y empalme. (B) Semi-RT-PCR cuantitativa que muestra desmontables de ARN proteínas de unión a 48 horas después de la transfección con ARNip. (C) Semi-RT-PCR cuantitativa que muestra los niveles de las isoformas de empalme MCL-1 (MCL-1
L y MCL-1
S) y el control de GAPDH de carga de 72 horas después de la transfección con ARNip. (D) MCL-1
L niveles medidos por PCR en tiempo real sobre la misma muestra se muestra en (B). (E) MCL-1
S niveles medidos por PCR en tiempo real sobre la misma muestra se muestra en (B). (F MCL-1
S niveles en la muestra replica mide por PCR en tiempo real (media (n = 3) ± SEM) ** p≤0.01;.. * P≤0.01
real-Time PCR
-PCR en tiempo real se realizó en cDNA utilizando ensayos TaqMan ® inventariados (Applied Biosystems) y TaqMan universal Master Mix II (Applied Biosystems). se seleccionaron ensayos TaqMan que eran específicos para cada una de las variantes de corte y empalme de MCL-1 como las sondas fueron diseñados para abarcar las fronteras exón específicas para cada variante de empalme (MCL-1
S - exón límites 1-3, MCL-1
L - exón frontera 1- 2), y el ensayo de Taqman GAPDH fue seleccionado como control endógeno. el ensayo se realizó por cuadruplicado y se realizó la amplificación por PCR usando el sistema de PCR OneStepPlus en tiempo real (Applied Biosystems). Todos los experimentos se realizaron por triplicado con un mínimo de tres experimentos independientes.
miARN Aislamiento y PCR en tiempo real
el ARN total se extrajo con TRIzol®, se precipitó con etanol al 100% y después se purificó en columnas RNeasy de spin (Qiagen) utilizando sólo tampón RPE. El ARN total se eluyó de las columnas con RNasa libre de agua. reacción de transcripción inversa se realizó en 10 ng de ARN total, utilizando TaqMan® MicroARN Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), y la secuencia de los cebadores de RT específicos de los TaqMan® Small RNA Ensayos (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Separados reacciones de transcripción inversa se realizaron para cada TaqMan® pequeños ARN de ensayo en cada muestra de ARN. PCR en tiempo real se realizó en cDNA utilizando el inventario TaqMan® Small RNA Ensayos y TaqMan® Universal Master Mix II (Applied Biosystems). El ensayo se realizó por triplicado y la amplificación por PCR se realizó usando el sistema de PCR OneStepPlus en tiempo real (Applied Biosystems).
Apoptosis Ensayo
células fueron transfectadas con siRNA inversa en 96 MCF-7 así placas y, a continuación, se incubaron durante 48 horas. MCF-7 células se trataron a continuación con el inhibidor de la topoisomerasa, etopósido, como se describe anteriormente [22]. En resumen, las células se incubaron con medio de privación de suero (1% FCS) durante 18 horas, seguido de tratamiento con 200 M etopósido (Sigma Aldrich) durante 6 horas [22]. los niveles de caspasa se midieron entonces utilizando caspasa-Glo 3/7 de ensayo (Promega) según las instrucciones del fabricante. Brevemente volúmenes iguales de la caspasa-Glo 3/7 reactivo se añadieron a los pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se midió la luminiscencia en un luminómetro (BMG).
Resultados
MCL -1 empalme isoformas y AR proteínas en líneas celulares
prácticas comerciales restrictivas que intervienen en el control del evento splicing alternativo en MCL-1 fueron investigados en tanto JAR y las células MCF-7. La justificación del uso de estas dos líneas celulares se basa en la premisa de que tienen diferentes perfiles de expresión de MCL-1
L y MCL-1
S. JAR células producen tanto MCL-1
L y MCL-1
S, mientras que las células MCF-7 sólo producen altos niveles de MCL-1
L (Figura 2, panel superior). Los lisados celulares de las mismas líneas celulares (Figura 2) también se evaluó la expresión de una selección de las prácticas comerciales restrictivas (AR proteínas, SRSF1-6), conocida por estar involucrada en la selección del sitio de empalme y predice que tienen sitios de unión a ARN putativo en el exón 2 de la
MCL-1 | gen (http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder). Las comparaciones de los niveles de expresión de estas proteínas SR en las células MCF-7 y las células JAR líneas sólo mostró un ligero aumento en SRSF2, 3 y 6 en las células MCF-7. A pesar de estar allí niveles similares de expresión, estas proteínas SR todavía pueden estar implicados en el corte y empalme alternativo de MCL-1, como la actividad de las proteínas SR son controlados por su concentración y de activación de estados nucleares combinadas, además de sus niveles de proteínas en general.
Niveles de mRNA de MCL-1 isoformas de empalme después de Derribo de ARN proteínas
para identificar las prácticas comerciales restrictivas que participan en la inclusión del segundo exón de MCL-1, siRNA se utilizó para derribar las proteínas candidatas en células MCF Encuadernación células -7. La prácticas comerciales restrictivas SRSF1, 2, 5, 6 y SR SREK1 proteína reguladora (SFRS12) tenían dos ARNsi diferente que su secuencia específica, mientras que SRSF3, 4 y Tra2β tenían un siRNA. Una consideración importante es verificar primero que desmontables de SRSFs individuales por RNAi no afectó la expresión de otros miembros de la familia (Figura S1). La Figura 3B demuestra la caída de las prácticas comerciales restrictivas en las células MCF7 48 horas después de la transfección, y muestra que los niveles de ARNm para cada RBP se redujo en al menos un siRNA. Una pantalla inicial del efecto de caída siRNA mediada tanto por PCR semi-cuantitativa (Figura 3C) y PCR (Figura 3D y 3E) en tiempo real demostró que a las 72 horas después de los niveles de transfección de MCL-1
S aumentó cuando las células se agotaron de SRSF1 (1 y 2) y SRSF5 (1); un ligero aumento de MCL-1
S también se observó cuando los niveles se redujeron Tra2β de siRNA. Aunque el segundo siRNA dirigido que SRSF5 (2) no produjo un aumento similar en MCL-1
S, la caída de SRSF5 no fue tan eficaz como con SRSF5 (1) siRNA. Los niveles de MCL-1
L ARN también se midieron (Figura 3C y 3D), pero a medida que los niveles de expresión de MCL-1
L ARNm eran tan altos los ligeros cambios producidos por el interruptor en el empalme no se observaron en la expresión general de ARNm. Después de la pantalla inicial de siRNAs las caídas se repitieron con SRSF1 (1 y 2) y SRSF5 (1) siRNAs (n = 3), y la Figura 2F muestra importantes sobre regulación de MCL-1
S ARNm 72 horas después de la transfección de estos siRNAs en la línea celular MCF-7
.
para evaluar las prácticas comerciales restrictivas, que están involucrados en este evento splicing alternativo en células JAR, el mismo panel de siRNAs se utilizaron para derribar las prácticas comerciales restrictivas en estas células. La figura 4A muestra la caída logrado con estos siRNAs en células JAR 48 horas después de la transfección. El interruptor en el empalme se evaluó midiendo los niveles de mRNA de MCL-1 por PCR semi-cuantitativa (Figura 4B) y PCR en tiempo real (Figura 4C y 4D) después de 72 horas. Los resultados muestran un gran aumento en el nivel de MCL-1
S después SRSF1 había sido derribado por cualquiera SRSF1 (1) o SRSF1 (2). MCL-1
niveles de L también se midieron en la pantalla, pero al igual que las células MCF-7 se observó ningún cambio debido a los altos niveles de MCL-1
presente L ARNm. Para validar los resultados de la pantalla inicial de las caídas con SRSF1 (1 y 2) fueron repetidos (n = 3) y mostraron un aumento significativo en los niveles de MCL-1
S ARNm después desmontables de SRSF1 (Figura 4E).
JAR células fueron transfectadas con SRSF1-6, Tra2β, SREK1, GAPDH (G) y el control negativo (CN) siRNAs, o tratados con vehículo (lípidos) solamente (V), o se dejaron sin tratar (UT) . (A) Semi-RT-PCR cuantitativa que muestra desmontables de ARN proteínas de unión a 48 horas después de la transfección con ARNip. (B) semi-cuantitativos de RT-PCR que muestran los niveles de las isoformas de empalme MCL-1 (MCL-1
L y MCL-1
S) y el control de GAPDH de carga de 72 horas después de la transfección con ARNip. (C) MCL-1
L niveles medidos por PCR en tiempo real sobre la misma muestra se muestra en (B). (D) MCL-1
S niveles medidos por PCR en tiempo real sobre la misma muestra se muestra en (B). (E) MCL-1
S niveles en la muestra replica mide por PCR en tiempo real (media (n = 3) ± SEM). * P≤0.01.
niveles de proteína de MCL-1 isoformas de empalme después de Derribo de ARN Proteínas
Para determinar si el interruptor de corte y empalme observado en el ARNm se traduce en proteínas de unión, inmunotransferencia se utilizó para definir el patrón de expresión de MCL-1
L y MCL-1
S en MCF-7 células y JAR. Es digno de notar que los niveles de MCL-1
S y MCL-1
proteínas L no pueden ser visualizados, para fines de cuantificación, al mismo tiempo de exposición (Figura S4) debido a los bajos niveles endógenos de Mcl- 1
S. Desmontables de SRSF1 y SRSF5 en las células MCF-7 se muestra en la Figura 5A, junto con la consiguiente producción de pequeñas cantidades de MCL-1
S, replicando las observaciones realizadas de MCL-1
niveles S ARNm (Figura 3B y 3D). Los niveles de proteína de MCL-1
L también se muestran después de caída. Los niveles de MCL-1
L después del tratamiento con siRNA SRSF5 no cambian significativamente de los controles, lo cual es consistente con los niveles de mRNA de MCL-1
L después de caída SRSF5 (Figura 3B y 3C). Curiosamente, los niveles de MCL-1
L se redujeron significativamente después SRSF1 fue derribado en comparación con los controles en células MCF-7. Esta reducción observada en los niveles de proteína no se observó en MCL-1
L mRNA (Figura 3B y 3C), por lo tanto la reducción en SRSF1 puede estar afectando la traducción o la estabilidad de MCL-1, así como el evento de corte y empalme alternativo. Los datos iniciales de los experimentos de inmunoprecipitación sugieren SRSF1 puede obligar a MCL-1 mRNA en células MCF-7 (Figura S3 y Métodos S1); Esta observación está de acuerdo con la evidencia previa de que la proteína SRSF1: existen complejos de MCL-1 RNA [17]
células MCF-7 (A) se transfectaron con SRSF1 (1 y 2), SRSF5 (1 y 2. ), GAPDH (G) y el control negativo (CN) siRNAs, o tratados con vehículo (lípidos) solamente (V), o estaban sin tratar (UT). SRSF1, 5, los niveles MCL-1 y la proteína GAPDH se determinó por inmunotransferencia 72 horas después de la transfección con los siRNAs, utilizando 30μg de lisado celular total. Los histogramas muestran el análisis densitométrico de MCL-1
L y MCL-1
S expresión de la proteína. Los datos se muestran como la media ± SEM. ** Indica p≤0.01; * Indica P & lt; 0,05. (B) las células se transfectaron con JAR SRSF1 (1 y 2), GAPDH (G) y control negativo (NC) siRNAs, o tratados con vehículo (lípido) solamente (V), o se dejaron sin tratar (UT). SRSF1, MCL-1 y GAPDH los niveles de proteína se determinó por inmunotransferencia de las 72 horas después de la transfección con los siRNAs, utilizando 30 g de lisado celular total. (C) Después de la transfección con SRSF1 (1) y siRNA células MCF-7 NC fueron tratados con 200 M etopósido o DMSO de control durante 6 horas. La inducción de la apoptosis se evaluó mediante la medición de caspase3 /7 actividad * indica P & lt;.. 0,05
Figura 5B muestra el efecto sobre los niveles de proteína de MCL-1 después del tratamiento con SRSF1 siRNA en células JAR. En consonancia con los resultados de ARNm, reducciones en los niveles SRSF1 resultaron en un aumento en el nivel de proteínas de MCL-1
S. Por el contrario, MCL-1
niveles de proteína L aumentó después del tratamiento con SRSF1 siRNA, mientras que los resultados de ARNm correspondientes no mostraron ningún cambio en los niveles después de la precipitación (Figura 4B y 4C). En consecuencia, a diferencia de la línea celular MCF-7, MCL-1
niveles de proteína L se incrementó en respuesta a SRSF1 siRNA en lugar de reducir, este aumento no fue estadísticamente significativa (Figura 4B). Estos hallazgos indican que SRSF1 puede estar implicado en otros aspectos de la regulación de Mcl-1, tales como control de la traducción o la estabilidad de proteínas en las células JAR. Los niveles de proteína de MCL-1
L y MCL-1
S también se examinaron después de caída con los demás prácticas comerciales restrictivas utilizadas en la pantalla de ARN tanto en las células MCF-7 y JAR, pero no se observaron cambios (datos no se muestra).
a continuación se investigó si desmontables de SRSF1, lo que resultó en un cambio tan dramático en MCL-1
L y MCL-1
S proporciones de proteína en la células MCF-7, pudo afectar a la inducción de la apoptosis. Nos primero realizó un ensayo de MTT para descartar la posibilidad de que la proliferación celular y la viabilidad celular pueden ser afectados por desmontables de SRSF1 en las células MCF-7 (Figura S2 y Métodos S2). La apoptosis se indujo en tanto el control negativo y las células SRSF1 (1) siRNA tratados por el tratamiento con etopósido (200 mM), y se mide mediante la evaluación de la actividad de la caspasa 3/7 resultante (Figura 5C). El porcentaje de incremento en la actividad de caspasa 3/7 fue ligeramente más alta después de la caída SRSF1 que demuestra una mayor inducción de la apoptosis.
Efecto de SRSF1 Derribo de Estabilidad y Traducción de MCL-1
L
MCL-1 contiene varios residuos dentro de la región N-terminal que pueden sufrir una modificación post traduccional, tales como la ubiquitinación y la fosforilación [23]. Estas modificaciones pueden afectar a la estabilidad de la proteína MCL-1. Por lo tanto, pasamos a evaluar la estabilidad de la proteína MCL-1 después de la caída de SRSF1 en las dos líneas celulares. cycloheximide tratamiento se utiliza para bloquear la traducción de proteínas y MCL-1
niveles de proteína L se evaluaron durante los siguientes 7 horas. La figura 6A muestra una tasa muy similar a la pérdida de MCL-1
L en las células MCF-7 después del tratamiento con SRSF1 siRNA en comparación con el control negativo siRNA. Esto sugiere que no hay ningún cambio en la estabilidad de MCL-1
L después de desmontables de SRSF1 en las células MCF-7. En contraste, el tratamiento de las células JAR con cicloheximida (Figura 6B) dio lugar a ritmo ligeramente más lento de la pérdida de MCL-1
l después desmontables de SRSF1, que indica que puede haber un ligero aumento de MCL-1
L células JAR estabilidad de la proteína.
(A) MCF-7 y (B) se transfectaron con SRSF1 (1 y 2) y control negativo (NC) siRNA. Tres días después de la transfección las células fueron tratadas con 35 ug /ml muestras de cicloheximida y la proteína se recogieron después de 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 5 y 7 horas para evaluar la estabilidad de la proteína. MCL-1
L niveles de proteína se mide entonces por inmunotransferencia. Células MCF-7 (C) se transfectaron con SRSF1 (1 y 2), GAPDH (G) y control negativo (NC) siRNA, o tratados con vehículo (lípido) solamente (V), o estaban sin tratar (UT). 48 horas después de la transfección las células se trataron con 20 nM de rapamicina durante otras 24 horas. A continuación se utilizó el Western Blot para evaluar los niveles de proteína de SRSF1, MCL-1
L y GAPDH. (D) los niveles de miR-29b medidos por PCR en tiempo real en el JAR y MCF-7 líneas celulares (media (n = 3) ± SEM), ** p≤0.01. Desmontables de SRSF1 en células MCF-7 (E) y células JAR (F) se evaluó por semi-cuantitativos de RT-PCR en SRSF1 (1) y control negativo (NC) siRNA (paneles superiores). Los niveles de miR-29b se midieron mediante PCR en tiempo real en SRSF1 (1) y el control negativo (CN) siRNA tratada células MCF-7 de (E) y células JAR de (F) junto con GAPDH (G) siRNA, vehículo ( lípidos) solamente (V), y las células no tratadas (UT) (paneles inferiores) (media (n = 3) ± SEM).
a medida que la disminución de los niveles de MCL-1
L en las células MCF-7 después de caída SRSF1 no parece estar afectando a la estabilidad de la proteína, puede ser un efecto de la traducción. SRSF1 ya se ha demostrado estar implicado en la iniciación de traducción mTOR, donde su presencia en los resultados de ARN en el reclutamiento mejorada del complejo mTOR al ARNm [24], [25], [26], [27], [28]. Además, MCL-1 también se ha demostrado que se translationally controlada por mTOR y la vía de señalización mTOR [24], [25], [26], [27], [28]. Para investigar más esto, MCF-7 células fueron tratadas con el inhibidor de mTOR rapamicina. Figura 6C confirma la reducción de MCL-1
L después del tratamiento con rapamicina y muestra esta reducción de MCL-1
L a ser similar a la observada después de caída SRSF1. Además, la adición de rapamicina a las células SRSF1 desmontables no dio lugar a ninguna disminución adicional en los niveles de MCL-1
L.
Un informe reciente ha sugerido también otro mecanismo por el que puede controlar SRSF1 traducción , a través del procesamiento de miRNAs [29]. Uno de los miRNAs identificados como upregulated después de la sobreexpresión de SRSF1 fue mir-29b. Este miRNA ya se ha demostrado estar involucrados en la inhibición de la traducción de MCL-1 [30]. A la luz de esta hipótesis de que el aumento observado en MCL-1
L niveles de proteína en las células JAR pueden, en parte, debido a la disminución de los niveles de miR-29b. A medida que la caída de SRSF1 en las células MCF-7 no mostraron un incremento similar en los niveles de
L proteína MCL-1, pero, de hecho, una disminución, que no esperaría mir-29b a estar implicado en la regulación de MCL -1
L en células MCF-7. Como resultado de ello podría esperarse que los niveles iniciales de mir-29b a ser mayor en las células JAR en comparación con células MCF-7. Para investigar esta mir-29b se midió en las células JAR sin tratar y MCF-7 por PCR en tiempo real (Figura 6D). Esto mostró, contrariamente a lo esperado, que los niveles de miR-29b fueron significativamente mayores en las células MCF-7 en comparación con las células JAR. Para evaluar si la caída de SRSF1 afectó a los niveles de miR-29b, como ya ha sido demostrado sobre-expresión de hacerlo [29], siRNA se utilizó para derribar SRSF1 en MCF-7 células (Figura 6E) y células JAR (Figura 6F). La caída se llevó a cabo inicialmente en las células MCF-7, ya que mostraron los más altos niveles iniciales de miR-29b (Figura 6D). Aunque el tratamiento con el reactivo de transfección solo parecía resultar en una reducción en mir-29b en las células MCF-7, desmontables de SRSF1 tuvo poco efecto sobre los niveles de miR-29b en ambos tipos de células en comparación con las células siRNA control negativo transfectadas ( Figura 6E y 6F).
Reglamento de MCL-1 por SRSF1 y 5 también se investigó en una segunda línea de células de cáncer de mama utilizando MDA-MB-231 células, que se describe como teniendo un fenotipo invasivo
in vitro
. Endógenas MCL-1 los niveles de proteína fueron evaluadas por Western Blot (Figura 7A), lo que indica que la MDA-MB-231 células expresan principalmente el MCL-1
isoforma proteína L, pero a niveles mucho más bajos que las células MCF-7. Para determinar si las mismas prácticas comerciales restrictivas están implicados en el corte y empalme de MCL-1 en MDA-MB-231 células siRNA contra SRSF1 y 5 se utilizó para agotar las células de estas dos proteínas. La Figura 7B muestra una reducción en los niveles de ARN de SRSF1 y 5 después de 48 horas, y un posterior aumento de los niveles de MCL-1
S mRNA después de 72 horas. tiempo real, análisis de PCR de transfecciones repetidos también demostró una significativa regulación de MCL-1
S ARNm 72 horas después de la transfección con tanto SRSF1 y 5 siRNAs. Los niveles de proteína se mide también por inmunotransferencia después de la caída SRSF1 y 5. La figura 7C muestra derribo de SRSF1 y 5 proteínas de 72 horas después de la transfección. Debido a los bajos niveles de MCL-1
L y MCL-1
S en la línea celular MDA-MB-231 Super Señal Femto ECL se utilizó para detectar las dos isoformas, pero esto no se presentó ningún cambio significativo en las dos isoformas después desmontables de SRSF1 ó 5, aunque hubo una ligera reducción de la proteína MCL-1 después de la caída de ambas proteínas SR (Figura 7C). A medida que la vía mTOR parece ser importante en la regulación de MCL-1 en células MCF-7 esto también se investigó en las células MDA-MB-231. La rapamicina se utilizó para inhibir la vía de mTOR en esta línea celular, pero la reducción dramática que se observó en las células MCF-7 con el tratamiento de la rapamicina y la caída SRSF1 no fue menos evidente con las células MDA-MB-231.
(a) Detección de MCL-1 variantes de corte y empalme y proteínas GADPH en MCF-7 y MDA-MB-231 con 40 ug de lisado celular total a partir de ambos tipos de células. Los histogramas muestran el análisis densitométrico de MCL-1
L y MCL-1
S expresión de la proteína. Los datos se muestran como la media ± SEM. (B) Semi-RT-PCR cuantitativa que muestra desmontables de ARN proteínas de unión a 48 horas después de la transfección con ARNip. células MDA-MB-231 se transfectaron con SRSF1, GAPDH (G) y control negativo (NC) siRNAs, o tratados con vehículo (lípido) solamente (V), o se dejaron sin tratar (UT). Semi-RT-PCR cuantitativa que muestra los niveles de las isoformas de empalme MCL-1 (MCL-1
L y MCL-1
S) y el control de GAPDH de carga de 72 horas después de la transfección con ARNip. MCL-1
S en niveles Muestra Duplicados medidos por PCR en tiempo real (media (n = 3) ± SEM).