Extracto
La enzima 5α-reductasa, que convierte la testosterona en dihidrotestosterona (DHT), realiza funciones clave en el andrógeno receptor (AR) vía de señalización. Los tres isoenzimas de la 5α-reductasa identificados hasta la fecha son codificadas por genes diferentes:
SRD5A1
,
SRD5A2
, y
SRD5A3
. En este estudio, hemos investigado los mecanismos que subyacen a la regulación de la expresión de andrógenos isoenzima 5α-reductasa en las células de la próstata humana. Se encontró que los andrógenos regula el nivel de ARNm de isoenzimas 5α-reductasa de una manera específica del tipo celular, que se produce dicha regulación a nivel transcripcional, y que la AR es necesario que este reglamento. Además, nuestros resultados sugieren que la AR es reclutado a un elemento de respuesta a andrógenos negativo (Nare) en el promotor de
in vivo SRD5A3
y directamente se une a la Nare
in vitro
. Los diferentes niveles de expresión de isoenzimas 5α-reductasa pueden conferir respuesta o resistencia a los inhibidores de la 5α-reductasa y por lo tanto pueden tener importancia en la prevención del cáncer de próstata
Visto:. Li J, Ding Z, Wang Z, Lu JF, Maity SN, Navone NM, et al. (2011) Reglamento de andrógenos 5α-reductasa isoenzimas en el cáncer de próstata: Implicaciones para la prevención del cáncer de próstata. PLoS ONE 6 (12): e28840. doi: 10.1371 /journal.pone.0028840
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de mayo de 2011; Aceptado: 16 de noviembre de 2011; Publicado: December 14, 2011
Derechos de Autor © 2011 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado por el Programa de Investigación de cáncer de próstata en el MD Anderson Cancer Center y apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud a través del Centro de cáncer programa de subsidios del MD Anderson, CA016672. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El proceso de varios años, de varias etapas de la carcinogénesis de próstata y su largo período de latencia hacen cáncer de próstata ideales para la quimioprevención [1]. El receptor de andrógenos (AR) vía de señalización, que es esencial para el desarrollo de la próstata y la función normal, también es fundamental para la patogénesis y la progresión del cáncer de próstata [2], [3]. La enzima clave en la señalización de AR, 5α-reductasa, convierte la testosterona en dihidrotestosterona andrógeno más potente (DHT) [4]. Aunque la testosterona se puede unir a y activar la AR, la DHT se une a ella con una velocidad de disociación tres veces más lenta que la de la testosterona [5], [6].
tres isoenzimas de la 5α-reductasa, que son codificadas por diferentes genes (
SRD5A1
,
SRD5A2
, y
SRD5A3
), se han identificado. reacción en cadena de inmunohistoquímica y de la polimerasa (PCR) análisis de los tejidos de próstata humanos sugieren que los niveles SRD5A1 y SRD5A2 cambian con el desarrollo del cáncer de próstata y la progresión [7], [8], [9].
in vitro
estudios han confirmado la actividad 5α-reductasa de la SRD5A3 más e identificado recientemente [10], que se sobreexpresa en refractarios a las hormonas tejidos de cáncer de próstata [10], [11]. Desmontables de
SRD5A3
expresión también redujo el crecimiento y la viabilidad de las células de cáncer de próstata [10]. Mediante el uso de un anticuerpo monoclonal, Godoy et al. más mostró aumento del nivel de proteína SRD5A3 en el cáncer de próstata en comparación con tejidos de la próstata benignas [12]. Estos resultados sugirieron que SRD5A3 puede contribuir a la progresión del cáncer de próstata. También se ha informado recientemente de que SRD5A3 puede jugar un papel importante en la glicosilación de proteínas [13]. Las mutaciones de
SRD5A3
dan lugar a trastornos congénitos [13], [14] y el síndrome Kahrizi [15].
Dos inhibidores de la 5α-reductasa han sido probados clínicamente. Finasteride inhibe específicamente la actividad SRD5A2 [16], y dutasterida inhibe la de tanto SRD5A1 y SRD5A2 [17]. La Prostate Cancer Prevention Trial (PCPT) arrojó resultados alentadores: la finasterida reduce la incidencia global de cáncer de próstata en un 25%, aunque los efectos potenciales de los tumores de alto grado fueron preocupantes [18]. Del mismo modo, la reducción a la dutasterida del cáncer de próstata Eventos (REDUCIR) ensayo mostró que dutasterida reduce la incidencia de cáncer de próstata en un 23% entre los hombres con alto riesgo y reveló un aumento estadísticamente significativo de tumor de alto grado en los hombres tratados con dutasterida [19] , [20].
Hay tres factores que pueden conferir respuesta o resistencia a los inhibidores de la 5a-reductasa. En primer lugar, la respuesta o la resistencia pueden ser resultado de la presencia de diferentes isoenzimas [21]. En segundo lugar, las diferencias en la sensibilidad puede ser conferida por
SRD5A2
variantes genotípicas [22]; Makridakis et al. [23] mostró
in vitro Windows que
SRD5A2
variantes tienen diferentes afinidades por finasterida. En tercer lugar, los diferentes niveles de expresión de las isoenzimas 5α-reductasa podrían contribuir a la sensibilidad y la resistencia. A diferencia de la ablación de andrógenos, lo que disminuye la testosterona y DHT prostática, la inhibición de la actividad 5α-reductasa disminuye DHT pero aumenta la testosterona [24], [25], [26]. Puesto que los inhibidores de la 5α-reductasa cambiar la relación de testosterona a DHT, y dado el papel crítico de la 5α-reductasa en la señalización AR, los diferentes niveles de expresión 5α-reductasa pueden proporcionar pistas sobre la respuesta y la resistencia a los inhibidores en la prevención del cáncer de próstata-5a-reductasa .
los andrógenos pueden afectar la expresión de
SRD5A1
y
SRD5A2
en diferentes tejidos y tipos celulares. En la rata próstata ventral, la regulación positiva de
SRD5A2 fotos: por andrógenos ha informado [27], y en el testículo de rata, la regulación negativa de
SRD5A1
[28]. Andrógenos ablación condujo a la disminución de la inmunotinción de 5α-reductasa [29].
SRD5A1
y
SRD5A2
también están regulados por la testosterona y DHT en T y células B linfoides [30] y en el hígado y el cerebro de rata [31], [32], [33], [ ,,,0],34]. Sin embargo, cómo la expresión 5α-reductasa está regulada en las células de la próstata humana no ha sido ampliamente investigado.
Nuestro propósito principal de este estudio fue evaluar así la regulación de andrógenos de las isoenzimas 5α-reductasa en las células de la próstata humana. Además, investigó si los efectos reguladores de los andrógenos en las 5a-reductasas son mediados por AR y si existe una interacción directa entre el
cis-elementos reguladores
de isoenzimas 5α-reductasa y AR.
nuestros datos demostraron específica del tipo celular regulación de andrógenos de las isoenzimas que está mediada por AR. A nuestro entender, esta es la primera demostración de que la AR puede unirse directamente al elemento negativo de andrógenos respuesta (Nare) del
SRD5A3
promotor en células de cáncer de próstata LNCaP. Nuestros hallazgos pueden tener implicaciones clínicas para la identificación de los hombres cuya enfermedad se pueden beneficiar de los inhibidores de la 5α-reductasa.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivos
PWR-1E, LNCaP, y células VCAP se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA); HPB-1-GFP, HPB-1-AR, y las células C4-2B4 fueron un regalo del Dr. Sue-Hwa Lin (La Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX); y LAPC-4 células fueron amablemente proporcionados por el Dr. Robert Reiter (Universidad de California, Los Ángeles, CA).
PWR-1E células se mantuvieron en medio de queratinocitos libre de suero (Invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) suplementado con 50 g /ml de extracto de pituitaria bovina, 5% de L-glutamina, y 5 ng /ml de factor de crecimiento epidérmico. LNCaP, C4-2B4, BPH-1-GFP, y las células HPB-1-AR se mantuvieron en medio RPMI-1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina y estreptomicina (P /S). LAPC-4 células se mantuvieron en medio de Dulbecco modificado por Iscove (Invitrogen) suplementado con 5% de FBS y 1% P /S. células VCAP se mantuvieron en Dulbecco Modificado Medio de Eagle suplementado con 10% de FBS y 1% P /S. Todos los cultivos se mantuvieron a 37 ° C en el aire humidificado con un 5% de CO
2. Las líneas celulares fueron validados en línea del MD Anderson Caracterizado por teléfono Core STR huella de ADN utilizando el kit AmpFℓSTR Identifiler (Applied Biosystems, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Los perfiles STR se compararon con las conocidas huellas dactilares ATCC, con la línea celular autenticación integrada Molecular versión de base de datos 0.1.200808 (http://bioinformatics.istge.it/clima/) [35], y para la base de datos de huellas dactilares del MD Anderson. Los perfiles de STR PWR-1E, LNCaP, C4-2B4, y las células VCAP coinciden las huellas dactilares de ADN conocidas; los de las células de la HBP-1-AR y LAPC-4 eran únicos.
cuantitativa con transcripción inversa PCR (QRT-PCR)
ARN total fue extraído de cada línea celular utilizando un RNeasy Plus mini kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. QRT-PCR se realizó usando un kit de un solo paso TaqMan RT-PCR (Applied Biosystems, Life Technologies Corp.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, el ajuste de QRT-PCR para cada reacción fue 48 ° C durante 30 minutos, 95 ° C durante 10 minutos, y 42 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 minuto. β-actina humana se utilizó como control endógeno en cada reacción. Imprimación y sondas para
SRD5A1
,
SRD5A2
, y
SRD5A3
genes eran también de Applied Biosystems.
tratamiento con andrógenos
La testosterona y DHT se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). R1881, un andrógeno sintético, fue proporcionado amablemente por el Dr. Sue-Hwa Lin. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos con su medio de crecimiento regular. Después de la privación de suero durante la noche, las células fueron expuestas a etanol (control) o de 1 nM, 10 nM, o 100 nM de andrógenos. Después de 24 horas y 48 horas de incubación, las células fueron cosechadas y ARN extraído para el análisis de QRT-PCR.
tratamiento actinomicina D
células de HPB-1-AR, LNCaP, y PWR-1E fueron tratados con dimetil sulfóxido (DMSO; control) o 1 mg /ml o 5 mg /ml de actinomicina D durante 30 minutos, seguido de etanol (control) o 10 nM DHT. Después de 24 horas de incubación, las células fueron cosechadas y ARN total extraído.
La transfección con pequeños ARN de interferencia (siRNA)
Para derribar AR expresión, sembramos las células LNCaP en placas de 12 pocillos, suero de ellos murió de hambre durante la noche, y luego transfectadas con 20 nM de ARNsi AR o siRNA control mediante el uso de DharmaFECT 1 (Dhamarcon, Inc., Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO). Después de la incubación durante la noche, las células fueron expuestas a etanol (control) o 2 nM DHT. Los AR siRNA y control siRNA se obtuvieron de Dhamarcon.
análisis de transferencia de Western
Después de 24 horas de incubación con siRNA, se recogieron y se centrifugaron a 5000 rpm durante 5 minutos las células. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón RIPA (Boston Bioproducts, Inc., Ashland, MA) con inhibidor de la proteasa (Roche, Mannheim, Alemania), se incubaron durante 20 minutos con un mezclador vortex ocasional, y después se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 minutos. Se decantó el sobrenadante y se guarda para el Western Blot. Todo el procedimiento de proteína-extracción se realizó a 4 ° C, y la concentración de proteína se midió usando el ensayo BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA). El sobrenadante se hirvió durante 5 minutos, se cargó en gel de poliacrilamida, correr, y se transfirió a una membrana de PVDF, que después se bloquea en TBST (TBS con 0,2% de Tween 20) + 5% de leche durante 1 hora antes de ser sondada con anti-AR anticuerpo (Dako América del Norte, Inc., Carpinteria, CA) en tampón de bloqueo durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 1 hora con anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano secundaria. La detección se realizó mediante el uso de un kit de electroquimioluminiscencia (Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ).
luciferasa ensayo
El
SRD5A3
promotor (-1027 /+ 155 bp) fue clonado en el vector básico pGL2 (Promega Corp., Madison, WI) en los sitios XhoI y MluI, al igual que otras construcciones de deleción. células LNCaP fueron transfectadas con estas construcciones utilizando Fugene 6 reactivo (Roche) o Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Para probar la capacidad de represión AR dependiente de SRD5A3, también insertamos su promotor (-191 /-72 bp) en el constructo pGL3-4ARE-E4-luc en los sitios PstI y XhoI. células LNCaP fueron transfectadas con él y luego cultivadas en ausencia y en presencia de DHT durante 24 horas
.
Un ensayo de doble luciferasa se llevó a cabo según el protocolo del Promega. La relación de luciferasa se obtiene dividiendo la actividad luciferasa por la actividad
Renilla
.
Mutagénesis
Las mutaciones se realizan en la región del Nare
SRD5A3
promotor mediante el uso de un kit QuickChange II XL mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) según las instrucciones del fabricante. La secuencia se mutó a CTGTTTTGCGTCT ATTTTTTTATTAT en el contexto de la construcción pGL3-4ARE-E4-luc.
ensayo de movilidad de desplazamiento electroforético (EMSA)
unión a oligos de doble cadena se evaluó de AR en células LNCaP extractos nucleares mediante la realización de EMSA con un kit de LightShift (todos los kits para EMSA fueron de Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. extractos de proteínas nucleares se aislaron a partir de células LNCaP, y las concentraciones de proteína se determinaron mediante el uso de un kit de ensayo de proteína BCA. Oligos fueron diseñados para cubrir la región -191 /-91 en el
SRD5A3
promotor y se marcaron usando un kit de marcaje de ADN con biotina extremo 3 'de acuerdo con las instrucciones del fabricante. la unión a oligos de doble cadena AR se evaluó en extractos nucleares de células LNCaP por EMSA usando un kit LightShift de acuerdo con las instrucciones del fabricante. oligos no marcados se utilizan en EMSA como uno de los controles. Se detectó el ADN marcado con biotina en la membrana de nylon utilizando un kit módulo de detección de ácido nucleico quimioluminiscente.
inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ensayo
células LNCaP fueron cultivadas en la presencia y ausencia de 100 nM DHT, y chIP se realizó utilizando un kit de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA), de acuerdo con su protocolo. Brevemente, las células se trataron con 37% de formaldehído a las proteínas de enlace transversal al ADN. cromatina reticulado fue digerido por la nucleasa micrococcal a una longitud de 150 a 900 pb, y las membranas nucleares se rompieron por sonicación. anticuerpos-AR específica (Dako) fueron usados para precipitar los fragmentos de cromatina cortas, que luego se lavaron y se eluyeron. Las proteínas de ADN enlaces cruzados se invirtieron y el ADN se purificaron adicionalmente mediante el uso de columnas de giro en cada reacción de PCR. El cebador directo para la Nare fue CTGTTTTGCGTCTTTGCTTCTG, y el cebador inverso era GAGGTCCTTGGTCCTGGTC, que amplifican un producto de 120 pb.
modelos de xenoinjertos
ARN de la MDA PCa 183, MDA PCa 144, MDA CaP 146, y MDA PCa modelos de xenoinjertos 155 fue proporcionado amablemente por el Dr. N. Sankar Maity y el Dr. Nora M. Navone. La MDA PCa 183 de xenoinjertos fue derivada de carcinoma de próstata andrógeno-dependiente, mientras que los otros fueron derivados de carcinomas de próstata resistente a la castración con carcinoma de próstata morfología de células pequeñas (SCPC) AR-negativos.
La cuantificación del ARNm relativa nivel de xenoinjerto
SRD5A3
y el antígeno específico de la próstata (
PSA
) se llevó a cabo mediante el uso de QRT-PCR con SYBR Green (Applied Biosystems, Inc.). QRT-PCR se realizó como se describe en [36]. Las secuencias de los cebadores utilizados fueron los siguientes: SRD5A3: adelante, 5'-TCCAAGCTGGCTTCATGGTT-3 'situado en el exón 2 y marcha atrás, 5'-CACTCGAAGAGTCTTCGTAA-3' se encuentra en el exón 3; PSA: adelante, 5'-GAGAGCTGTGTCACCATGTG-3 'situada en el exón 1 y marcha atrás, 5'-CACAATCCGAGACAGGATGA-3' se encuentra en el exón 2.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como medias ± DAKOTA DEL SUR. Dos caras
t
pruebas se llevaron a cabo por medio entre las muestras y los controles tratados con andrógenos comparar. Significación se fijó en un valor de p de 0,05.
Resultados
Los tres isoenzimas 5α-reductasa están presentes en las líneas celulares de próstata humanos probados, con diferentes patrones de expresión
A Identificar un buen sistema modelo para el estudio de las funciones de isoenzimas 5α-reductasa, se evaluaron los niveles de mRNA de los isoenzimas 5α-reductasa en diferentes líneas celulares de próstata, incluyendo PWR-1E inmortalizado células epiteliales prostáticas normales; células de HPB-1-AR hiperplasia prostática benigna (BPH), que expresan de forma estable AR; células de cáncer de próstata sensibles a andrógenos LAPC-4 y LNCaP; y células independientes de andrógenos C4-2B4. PWR1-E, las células de HPB-1-AR y LAPC-4 expresan AR de tipo salvaje, mientras que las células LNCaP y C4-2B4 expresan un mutante AR, T877A. (Las características de estas líneas celulares, incluyendo su fuente, la sensibilidad de andrógenos, y el estado de AR-expresión, se resumen en la Tabla S1.) Como muestra la Figura 1 ilustra, se detectó el ARNm de las tres isoenzimas 5α-reductasa en QRT-PCR análisis de cada línea celular, lo que indica que los tres se expresan en estas líneas celulares. Sin embargo, el nivel de mRNA de cada isoenzima diferían entre las líneas celulares, y cada isoenzima tenido un patrón de expresión característico.
Los gráficos muestran los niveles de ARNm relativas de los
SRD5A1
,
SRD5A2
y
SRD5A3
isoenzimas en PWR-1E, HPB-1-AR, LAPC-4, LNCaP, y las células C4-2B4 a lo determinado en el análisis de QRT-PCR.
los niveles de 5α-reductasa de ARNm están regulados por los andrógenos en una celda de tipo específico de manera
Para probar si el nivel de mRNA de la 5α-reductasa es regulada por andrógenos, se trataron las células LNCaP, ya sea con etanol (es decir, sólo vehículo) o con testosterona o DHT a diferentes concentraciones (1, 10, y 100 nM). La concentración plasmática normal de testosterona en hombres oscila desde 350 hasta 1.050 ng /dL (12,1 a 36,4 nM) [37], y el nivel de castración de testosterona es menor de 50 ng /dl (1,73 nM) [38]. La concentración plasmática de DHT es de aproximadamente 1/10 de la concentración de testosterona [39], [40]. De este modo, las células tratadas con concentraciones de andrógenos que están cerca de la castración, fisiológicos, y los niveles de superphysiologic. Nuestro QRT-PCR análisis mostró que el tratamiento DHT dio lugar a un aumento del nivel de
SRD5A1
ARNm, mientras que condujo a la disminución de los niveles de
SRD5A2
y
SRD5A3
mRNA en la próstata LNCaP las células cancerosas (Fig. 2A).
A, las células LNCaP se trataron con etanol (vehículo solamente) o diferentes concentraciones de DHT (1 nM, 10 nM, 100 nM) durante 24 y 48 horas. PWR-1E (B), BPH-1-AR (C), las células C4-2B4 (E) LAPC-4 (D), y se trataron de la misma manera pero sólo durante 24 horas. Los niveles de mRNA de
SRD5A1
,
SRD5A2
, y
SRD5A3 Opiniones de todas las líneas celulares se cuantificaron mediante qRT-PCR. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001; 2 caras
t
prueba.
También probó el efecto de DHT en otras líneas celulares. DHT no afectó notablemente el nivel de mRNA de 5α-reductasa en las células PWR-1E (Fig. 2B), mientras que en las células HPB-1-AR, DHT aumentó los niveles de mRNA de los tres isoenzimas (Fig. 2C). En las células LAPC-4, que expresan de tipo salvaje AR, DHT hasta reguladas expresión SRD5A1 sin afectar SRD5A2 y expresión SRD5A3 (Fig. 2D). Y en las células de cáncer de próstata C4-2B4 independientes de andrógenos, DHT regulado expresión 5α-reductasa de manera similar a su regulación en las células LNCaP, pero en un grado menor (Fig. 2E).
Nos pareció interesante que la DHT regula el nivel de ARNm de
SRD5A3
de una manera específica del tipo celular, un hallazgo que no hemos visto informado antes. Para evaluar si esto sucede sólo en LNCaP o líneas celulares LNCaP derivados, que de manera similar trataron células VCAP, que se derivan de una metástasis ósea de xenoinjerto de cáncer de próstata humano. DHT también el regulado el nivel de mRNA de
SRD5A3 Hoteles en células VCAP (Figura S1), lo que indica que la regulación por andrógenos negativo de
SRD5A3
no es específico de LNCaP o líneas celulares LNCaP derivados.
la testosterona y R1881 tuvieron efectos similares a los de la DHT en la expresión de 5α-reductasa en todas las líneas celulares ensayadas (Figuras S2 y S3). Así, nuestros datos demuestran que los andrógenos regulan el nivel de ARNm de isoenzimas 5α-reductasa de una manera específica del tipo celular.
Regulación de nivel de ARNm 5α-reductasa se produce a través de la transcripción
Los andrógenos podría regular 5α- reductasa expresión mediante el control de la transcripción 5α-reductasa o afectando a la estabilidad del ARNm. Para comprender el mecanismo subyacente a la regulación de la 5α-reductasa por los andrógenos, se trataron las células HPB-1-AR con actinomicina D, un inhibidor de la transcripción. Como se muestra por los resultados del análisis de QRT-PCR de la Figura 3, DHT indujo el aumento de expresión de los tres isoenzimas 5α-reductasa relativas a que en el control de etanol (vehículo) en las células HPB-1-AR. Sin embargo, el nivel de mRNA de 5α-reductasa no cambió con el tratamiento DHT cuando las células fueron también tratados con actinomicina D en 1 mg /ml y las concentraciones /ml 5 g (Fig. 3A). Estos resultados indican que la regulación al alza de la expresión de 5α-reductasa por los andrógenos es sensible a la actinomicina D tratamiento, lo que sugiere que los andrógenos regulan la transcripción de 5α-reductasa.
HPB-1-AR (A) y LNCaP ( B), y PWR-1E (células C) se trataron durante 30 minutos con DMSO (control vehículo solamente) o actinomicina D a 1 mg /ml y las concentraciones de 5 mg /ml. El tratamiento con etanol (vehículo solamente) o 10 nM de DHT o testosterona siguió. Se cuantificaron los niveles de mRNA de
SRD5A1
,
SRD5A2
, y
SRD5A3 fotos: por QRT-PCR.
Del mismo modo, cuando las células LNCaP fueron tratados con actinomicina D, la testosterona no aumentó significativamente
SRD5A1
o disminución
SRD5A2
y
SRD5A3
niveles de mRNA (Fig. 3B). Como control negativo, también trataron células PWR-1E con actinomicina D, seguido de tratamiento DHT (Fig. 3C). En el caso del control de DMSO sólo, la DHT no afectó el nivel de ARNm de
SRD5A1
,
SRD5A2
, o
SRD5A3
. Con el tratamiento actinomicina D, la DHT no alteró significativamente el nivel de mRNA de estos genes, tampoco.
Regulación de nivel de ARNm 5α-reductasa por los andrógenos AR es dependiente
Mediante el uso de Western Blot, se verificó la expresión de AR en cada una de las líneas de células estudiadas por comparación con la de las células HPB-1-GFP AR-negativo (Fig. 4A).
a, el nivel de proteína AR de cada línea celular de próstata fue se analizaron por transferencia Western. células HPB-1-GFP se utilizaron como un control negativo para la expresión AR. B, El nivel de proteína de AR se analizó por transferencia Western para las células LNCaP (izquierda) con tres de control y dos tratamientos AR siRNA. El nivel de AR ARNm se analizó mediante qRT-PCR para células PWR-1E (derecha), también con tres de control y dos tratamientos AR siRNA. células C, LNCaP y PWR-1E se trataron con siRNAs de control y AR siRNAs y luego tratados con 2 nM DHT. Medimos los niveles de mRNA de
SRD5A1
,
SRD5A2
, y
SRD5A3 fotos: por el uso de QRT-PCR y se normalizaron los valores de ß-actina. Los cambios en los niveles de ARNm con el tratamiento DHT se muestran en relación con los niveles en las células tratadas con vehículo solamente.
Para determinar si se requiere AR para mediar en la regulación de la expresión de 5α-reductasa por los andrógenos, se realizó un Western Blot y análisis de QRT-PCR después de tratar las células LNCaP y PWR-1E con AR siRNAs y luego con 2 nM de DHT. Western Blot y QRT-PCR validaron la caída efectiva de la expresión del RA por la AR siRNAs (Fig. 4B). QRT-PCR mostró que los ARNip de control no alteraron significativamente el efecto de DHT en los niveles de 5α-reductasa en células LNCaP (Fig. 4C, arriba). DHT tratamiento por sí solo produjo un aumento de
SRD5A1
ARNm pero disminuyó
SRD5A2
y
SRD5A3
mRNA (Fig. 4C, arriba). En contraste, los niveles de 5α-reductasa en células LNCaP tratadas con AR siRNAs no cambian en respuesta al tratamiento con DHT (Fig. 4C, la parte superior). Cuando tratamos las células LAPC-4 de una manera similar,
SRD5A1
ARNm aumentó de manera similar con la DHT o testosterona tratamiento por sí solo, pero no cuando las células fueron también tratados con AR siRNA (Figura S4). Cuando se trataron células PWR-1E de la misma manera, la DHT no afectó el nivel de mRNA de 5α-reductasa en las células PWR-1E, no importa si se trataron con siRNAs de control o AR siRNAs (Fig. 4C, la parte inferior).
en conjunto, estos resultados indican que la regulación de la 5α-reductasa por los andrógenos AR es dependiente.
SRD5A3
promotor contiene un Nare
Nos mostró que andrógenos regula la transcripción de 5α-reductasa y que AR es necesario para mediar esta regulación transcripcional. AR se une directamente a Ares y regula la transcripción de los genes AR-dirigida. Por lo tanto, se investigó si la AR puede regular directamente la transcripción de 5α-reductasa. Hemos clonado una región promotora de
SRD5A3 gratis (-1,027 a 155 pb) en el vector pGL2-básico. En las células LNCaP, este constructo dirige la expresión de luciferasa y, cuando son tratados con 100 nM DHT, una reducción del 75% de los resultados de la actividad luciferasa (Fig. 5A). Esto es similar a la respuesta de endógeno
SRD5A3
al tratamiento de andrógenos en células LNCaP. Por lo tanto, un ARE puede residir en este 1-kb región promotora del
SRD5A3
.
A, Supresión análisis de
SRD5A3
promotor de restringir la ubicación de la nARE- que contiene la región. células LNCaP fueron transfectadas con constructos de luciferasa que contienen una serie de deleción de
SRD5A3
promotor y después se trataron con etanol (vehículo solamente; -DHT) o 100 nM DHT (+ DHT) durante 24 horas. Las células se recogieron a continuación, y sus lisados se utilizaron para el ensayo de luciferasa. B,
SRD5A3
tiene un Nare. células LNCaP fueron transfectadas con pGL3-4ARE-E4 construye con y sin inserción de la secuencia
SRD5A3
promotor (-191 /-72 pb) en ambas orientaciones, o con la inserción de un
SRD5A1
promotor fragmento (-1601 /-1501 pb). Las células se trataron con etanol (vehículo solamente) o 100 nM de DHT durante 24 horas y después se recogieron para el ensayo de luciferasa. C, Las mutaciones en el Nare abolió su efecto supresor. células LNCaP fueron transfectadas con pGL3-4ARE-E4 construye con y sin inserción de
SRD5A3
promotor (-191 /-72 pb) o con la inserción de la
SRD5A3
promotor mutado (-191 /-72 pb) y después se sometieron a un tratamiento DHT y el ensayo de luciferasa
para identificar los putativos, hicimos una serie de construcciones de deleción en el
SRD5A3
región promotora.; las construcciones conservan la capacidad de respuesta al tratamiento con andrógenos hasta que se eliminan los -191 /-91 puntos básicos, lo que sugiere que la ARE putativo se encuentra en esta región (Fig. 5A).
Para evaluar más a fondo si de hecho esta región contiene un Nare , insertamos la región de -191 /-72 pb entre el núcleo promotor 4ARE y E4 en la construcción pGL3-4ARE-E4-luc [41], las células LNCaP transfectadas con ella, y después se trató las células con DHT. El constructo pGL3-4ARE-E4-luc contiene cuatro repeticiones en tándem de la ARE de la
PSA
gen y un núcleo promotor E4 [41]. Como se muestra en la Figura 5B, el tratamiento DHT indujo un aumento de aproximadamente 24 veces en la actividad luciferasa de la construcción pGL3-4ARE-E4-luc. Cuando la región -191 /-72 pb de la
se insertó SRD5A3
promotor entre 4ARE y E4, se aumentó la actividad de luciferasa solamente de 3 a 6 veces por tratamiento DHT, lo que sugiere que esta región contiene un receptáculo nasal. Cuando una región 101 pb derivado de la
SRD5A1
promotor (-1601 /-1501 pb) se insertó de manera similar entre 4ARE y E4 como control, el tratamiento DHT todavía indujo un aumento de 26 veces en la actividad luciferasa. Además, las mutaciones en la región -191 /-72 pb de
SRD5A3
abolió su capacidad represiva (Fig. 5C). En conjunto, estos datos sugieren que
SRD5A3
tiene una Nare funcional en su promotor.
AR es reclutado para la región Nare-que contiene de
SRD5A3
para investigar si la AR ha sido contratado para el promotor de
in vivo SRD5A3
, se realizó un chip usando fragmentos de ADN genómico a partir de células LNCaP (150-900 pb; Fig. 6A) con cebadores dirigido específicamente a la región del Nare
SRD5A3
. Como se muestra en la PCR, AR se enriqueció en la región nāre cuando las células crecieron en presencia de DHT (Fig. 6B). inmunoglobulina de ratón normal G (como control negativo) también se utilizó para la inmunoprecipitación con el ADN genómico LNCaP; la inmunoglobulina G no arrastró cualquier secuencia de ADN AR-asociado de la
SRD5A3
promotor (Fig. 6B). Estos resultados sugieren que la AR es reclutado para la región Nare en el promotor de
SRD5A3
.
A, electroforesis en gel de agarosa de la cromatina de las células LNCaP digerido crecido en ausencia y en presencia de 100 nM DHT. fragmentos de ADN oscilan generalmente entre 150 y 900 pb. B, la cromatina digeridos de células LNCaP cultivadas en ausencia y en presencia de 100 nM de DHT se utilizó en el experimento de inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-AR o normal inmunoglobulina de ratón G. Después, la reticulación de proteínas de ADN se invirtió, y se utilizó ADN purificado en las reacciones de PCR con cebadores que flanquean la región Nare. C, tres sondas de oligonucleótidos fueron diseñados para cubrir la región pb -191 /-91 en el promotor de
SRD5A3
. D, AR se une a la Nare de
SRD5A3
. Las tres sondas oligo (marcadas con biotina) se incubaron con extracto nuclear de células LNCaP, con extracto nuclear de células LNCaP además oligo sondas no marcadas, o con extracto nuclear de células LNCaP más anticuerpo-AR específica.
Para determinar si la AR puede interactuar directamente con el Nare de
SRD5A3
, que lleva a cabo la EMSA con tres sondas de oligonucleótidos, cada una de 40 pb, para cubrir la región -191 /-91 pb del
SRD5A3
promotor (Fig. 6C). Sólo la sonda 1 mostró un cambio de movilidad (Fig. 6D). Para confirmar que este cambio de movilidad es específico para AR, hemos añadido los anticuerpos anti-AR a las reacciones; la sonda 1 mostró un cambio de movilidad más (Fig. 6D). Aunque no marcado de la sonda de tipo salvaje 1 fue capaz de competir con la sonda marcada 1 de AR vinculante en EMSA, perdió esa capacidad cuando hicimos las mutaciones en la secuencia de la sonda 1 (Figura S5).
Estos resultados demostraron que la sonda 1 contiene el Nare y que AR se une directamente a esta región
in vitro
.
en
SRD5A1
y
promotor análisis SRD5A2
, también llevamos a cabo y chip, pero no detectamos una región son o AR directa unión a sus regiones promotoras proximales. El mecanismo regulational para su expresión todavía está bajo investigación.
SRD5A3
mRNA aumentos en el modelo de xenoinjerto SCPC AR-negativos
En la observación de la regulación de andrógenos negativo de
SRD5A3 Hoteles en las líneas celulares de la prueba, que estaban interesados en investigar si esta regulación AR-dependiente también se produce
in vivo
. Por lo tanto, hemos examinado el nivel de ARNm de
SRD5A3
en diferentes modelos de xenoinjertos MDA, incluyendo el CP 183, un andrógeno-dependientes de xenoinjertos de cáncer de próstata que expresan AR, y tres xenoinjertos AR-negativos SCPC independientes de andrógenos, MDA PCa 144 , MDA PCa 146, y MDA PCa 155. en QRT-PCR, se observó un nivel de ARNm notablemente más alta de
PSA
en el MDA PCa 183 xenoinjerto que en los otros (Fig. 7, arriba), la cual es coherente con el estado de AR de estas líneas celulares.