Extracto
El FOXO3 factor de transcripción es un supresor de tumores bien establecida cuya actividad, estabilidad, y la localización son reguladas por la fosforilación y acetilación. los datos previos de nuestro laboratorio demostraron que amplifican tromboxano-A
2 de señalización se asoció con un mal pronóstico en pacientes con cáncer de vejiga y la sobreexpresión de la tromboxano-A
2 receptor de isoforma-β (TPβ), pero no TPα, inducida por la transformación maligna de células de la vejiga inmortalizadas
in vivo
. A continuación, describimos un mecanismo de TP mediada por la modulación de la actividad y la localización FOXO3 por la fosforilación y la desacetilación en un modelo celular de cáncer de vejiga.
in vitro
ganancia y pérdida de función de los estudios realizados en líneas celulares no transformadas, UROsta y SV-HUC, revelaron desmontables expresión de shRNA FOXO3 por aumento de la migración celular y la invasión, mientras que la sobreexpresión de forma exógena TPβ elevó basal fosforilada (p niveles) FOXO3-S294. Por el contrario, la sobreexpresión de ERK-resistente, FOXO3 mutante reducida aumentos en la migración celular y la invasión UMUC3, incluyendo la mediada por TP agonista (U46619). Además, la estimulación de las células con U46619 UMUC3 aumento de la expresión pFOXO3-S294, que podría ser atenuada por el tratamiento con un antagonista de TP (PTXA
2) o un inhibidor de ERK (U0126). Inicialmente U46619 provocó la acumulación nuclear de pFOXO3-S294; Sin embargo, la estimulación prolongada aumentó FOXO3 localización citoplasmática. estimulación U46619 disminución de la actividad transcripcional global FOXO3, pero se asoció con una mayor expresión de su objetivo favor de la supervivencia, la superóxido dismutasa de manganeso. Los datos también muestran que la estimulación TP aumentó la expresión de la histona desacetilasa, SIRT1, y correspondió con una disminución de acetilada-FOXO3. En conjunto, los datos sugieren un papel para la señalización de TP en la regulación de la actividad FOXO3, mediada en parte a través de la fosforilación y la desacetilación
Visto:. Sobolesky PM, Halushka PV, Garrett-Mayer E, Smith MT, Moussa O ( 2014) Reglamento de la FOXO3 supresor tumoral por el tromboxano-A
2 los receptores en el cáncer urotelial. PLoS ONE 9 (9): e107530. doi: 10.1371 /journal.pone.0107530
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 4 Febrero 2014; Aceptado: 19 Agosto 2014; Publicado: 9 de septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Sobolesky et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Instalaciones Imaging para esta investigación fueron apoyados, en parte, por el Centro de cáncer Soporte de Grant P30 CA138313 para el Centro de cáncer Hollings, MUSC. El proyecto de investigación descrito fue apoyado en parte por subvenciones RO1127905CA, UL1TR000062, y UL1RR029882 del Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es el quinto cáncer más frecuente en los Estados Unidos con el carcinoma superficial de células transicionales (TCC) es la forma más comúnmente diagnosticado [1]. TCC tiene una alta tasa de recurrencia y no requiere costosos de toda la vida de seguimiento, por lo que el cáncer de vejiga uno de los cánceres más costosas de tratar durante la vida de un paciente [2]. La comprensión de los mecanismos de transformación oncogénica de las células uroteliales es esencial para el diseño de terapias eficaces y novedosos para el tratamiento de cáncer de vejiga. Hemos identificado previamente una asociación inversa entre la tromboxano sintasa expresión y la supervivencia de pacientes con cáncer de vejiga (TXS), lo que sugiere un papel para la prostaglandina tromboxano (TP) de señalización en la progresión del tumor urotelial [3]. TXS es una enzima importante que cataliza la conversión de prostaglandina H
2 a tromboxano A
2 (TXA
2). El TXA
2 ligando, a su vez, activa el receptor TP, la promoción de la migración celular, la proliferación y la invasión, que son las características clave de la transformación celular y la progresión de la enfermedad [3], [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. Otros estudios han indicado un papel para la señalización de TXA
2 en la tumorigénesis y fenotipos malignos de próstata [8] y los cánceres de mama [9], [10].
El gen del receptor TP humano codifica dos isoformas, TPα y TPβ [11]. Ambas isoformas son siete membrana trans G receptores acoplados a proteínas que se diferencian sólo en el dominio C-terminal [12]. La variación C-terminal permite a cada isoforma para interactuar con ambos mediadores de señalización idénticos y únicos [13]. Expresión de las isoformas del receptor TP es el tejido y de tipo celular dependiente. Hemos informado anteriormente de TPβ sobreexpresión en pacientes con cáncer de vejiga se asoció con una disminución significativa en la supervivencia [14]. Además, la sobreexpresión de TPβ, pero no TPα, era suficiente para aumentar la migración, invasión y proliferación, así como inducir la transformación maligna de una línea inmortalizada no transformada urotelial de células [14]. Se desconoce el mecanismo de la transformación inducida por la sobreexpresión TPβ.
El factor de transcripción forkhead box-O3 (FOXO3) regula los procesos clave de supervivencia celular, incluyendo la resistencia al estrés oxidativo, la detención del ciclo celular y la apoptosis a través de la regulación de sus genes diana p.ej manganeso superóxido dismutasa (MnSOD), p27
Kip1, ligando Fas (FasL), y Bim [15], [16]. FOXO3 actividad transcripcional puede ser regulada a través de modificaciones post-traduccionales (PTM), tales como la acetilación y la fosforilación. La desregulación de la actividad FOXO3 y la localización se ha asociado con la iniciación y progresión del cáncer, así como la resistencia quimioterapéutico [17], [18], [19]. La acetilación de la histona FOXO3 por el p300 acetil-transferasa se ha relacionado con disminución de la actividad FOXO3, aumentó localización citoplasmática, y la degradación de [20]. La desacetilación de desacetilasa dependiente de NAD Sirtuinas-1 (SIRT1) se ha demostrado que regulan diferencialmente objetivos FOXO3 mediante la promoción de la transcripción de p27
Kip1 y MnSOD, mientras que disminuye la transcripción de Bim y FasL [21]. Extracelular-quinasa regulada por señales 1 y 2 (ERK1 /2) se ha demostrado que phosphorylate FOXO3 en -S294, -S344, y -S425, y afectar negativamente a su función y estabilidad a través de murino doble 2 minutos (MDM2) mediada por la degradación FOXO3 [ ,,,0],22]. Mientras que la estimulación de TPβ se sabe que inducen la fosforilación y la activación de ERK [23], [24], [25], a nuestro conocimiento ningún estudio ha examinado los efectos de la señalización de TP en la modulación FOXO3.
En este sentido, identificado FOXO3 como un objetivo corriente abajo de la vía del receptor TP y examinado los efectos negativos de la señalización de TP en la localización FOXO3 y la función en la línea celular de vejiga-cáncer derivado UMUC3. Curiosamente, la actividad general FOXO3 transcripcional se redujo después de la estimulación agonista TP resulta en la reducción de expresión de un objetivo de apoptosis, sin embargo, mayor expresión de un objetivo resistencia al estrés. De acuerdo con estudios anteriores [21], la expresión diferencial de los objetivos FOXO3 después de la estimulación agonista TP se asoció con un aumento de la expresión de SIRT1 y FOXO3 desacetilada. En su conjunto, este estudio aclara un mecanismo por el cual indujo TP modulación de la actividad FOXO3 a través de modificaciones posteriores a la traducción contribuye al fenotipo maligno de las células uroteliales.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
la línea celular UROsta, proporcionado amablemente por el Dr. Donald Sens (Universidad de Dakota del Norte, Grand Forks, Dakota del Norte) fue derivado de células uroteliales humanos normales e inmortalizó con el antígeno T de SV40 [26]. células UROsta se mantuvieron en una mezcla 70:30 de medio DMEM (1 g /l de glucosa: 4,5 g /L de glucosa; Mediatech, VA, EE.UU.), 10% de suero bovino fetal (FBS). El urotelial humana del virus de simio 40 inmortalizado-(SV-HUC), urotelial línea celular no transformada fue proporcionado amablemente por el Dr. Swaminathan Santhanam (Universidad de Wisconsin, Centro Integral del Cáncer, Madison, WI) [27], [28], [29] y las células se cultivaron en F12K Khaigns medios modificados suplementado con 10% FBS, insulina, hidrocortisona, y transferrina. La línea celular de cáncer de vejiga UMUC3 se obtuvieron de la American Type Culture Collection y células cultivadas en medio RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE.UU.), que contiene 10% de SFB. Cada medio contenía 1% de penicilina /estreptomicina. Las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO
2
Los anticuerpos, reactivos y plásmidos
Los siguientes anticuerpos fueron utilizados de acuerdo con las recomendaciones del fabricante:. pFOXO3-S294 , pc-jun Ser63, c-jun, pAKT Ser473, pMAPK Thr202 /Tyr204, Akt, ERK, p300, Sirt1, Bim, p27
Kip1 (Cell tecnología de señalización, Danvers, MA, EE.UU.), FOXO3, GFP (Santa Cruz), Lamin B1 (GeneTex, Irvine, CA, EE.UU.) MnSOD (Ciencias EnzoLife, Ann Arbor, MI, EE.UU.), α-tubulina (ABD Serotec, Raleigh, Carolina del Norte, EE.UU.), GAPDH (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO, EE.UU.). TP agonista específico, U46619 se adquirió de Cayman Químicos (Ann Arbor, MI, EE.UU.). ERK1 /2 U0126 inhibidor se adquirió de Sigma-Aldrich. FHRE-luc plásmido fue un regalo de Michael Greenberg (Addgene plásmido#1789, Cambridge, MA, EE.UU.). La
3A-FOXO3 GFP (serinas-294, -344, -425 y sustituido a alaninas) y el control pEGFP-C
2 plásmido fueron regalos de Mien-Chie Hung en la Universidad de Texas, M. D. Anderson Cancer Center. El plásmido GFP-TPβ fue un regalo de Jean-Luc Padres de la Universidad de Sherbrooke, Canadá.
Western blot
Las células se lavaron con PBS y se recogieron en tampón RIPA (Thermo Fisher Scientific ) suplementado con un cóctel comprimidos completos Inhibidores de la proteasa cóctel comprimidos y PhosSTOP fosfatasa inhibidores (Roche Applied Science). Las proteínas se desnaturalizaron por ebullición en tampón de Laemmli (BioRad, Hercules, CA, EE.UU.) y se resolvieron en un 12% SDS-PAGE. Después de la transferencia de proteínas, la membrana de nitrocelulosa se bloqueó con 5% de leche en TBST 1 × y se sondó con el anticuerpo primario en 5% de BSA en 1 × TBST durante la noche a 4 ° C. Después de la incubación del anticuerpo primario, las membranas se lavaron en 1 x TBST y se incubaron con unido a HRP anticuerpo secundario (Cell Signaling Technology) en 1 x TBST. Las membranas se lavaron 5 x durante 5 min con 1 x TBST y la detección se visualizaron utilizando SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Thermo Fisher Scientific). Western blots se cuantificaron utilizando Image Studio Lite Ver. 3.1 siguientes instrucciones de software y graficada en GraphPad Prism 5.
Las transfecciones y la generación de clones estables
Para generar clones FOXO3 desmontables estables, las células SV-HUC y UROsta fueron transfectadas con cualquiera pRFP-C- RS plásmido de control, C-desordenados pRFP o pRFP-c-shRNA plásmido de FOXO3 (Hush-29; OriGene, Rockville, MD, EE.UU.) utilizando Fugene 6 (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN, EE.UU.). clones individuales se seleccionaron en medios que contenían 2,5 mg /ml de puromicina (Invivogen, San Diego, CA, EE.UU.) y desmontables se analizó por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo específico FOXO3 (H-144; sc-11351; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA , ESTADOS UNIDOS). La transfección de GFP-TPβ en células SVHUC se realizó con el reactivo TurboFect transfección (Thermo Fisher Scientific) con una proporción de 1,5 g de ADN a 4 TurboFect l. células UROsta (1 × 10
6) se sometieron a electroporación con 3,5 g de GFP-TPβ usando el botón solución kit V Línea Amaxa célula Nucleofector (cat #: VCA-1003, Lonza, Allendale, NJ, EE.UU.) y el 2b Nucleofector dispositivo (Lonza) con el protocolo preprogramado T-030. Cuatro horas siguientes medios electroporación se aspiró, sustituidos con medio completo, y se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2. La eficacia de transfección se comprobó 24 horas después de la electroporación. Para generar estable GFP-FOXO3
3A expresar UMUC3 clones, las células en una placa de 6 pocillos se transfectaron usando 4 l X-HP tremeGENE reactivo de transfección de ADN (Roche Applied Science) y el plásmido de ADN de 1,5 mg. Los clones individuales se seleccionaron en medio que contenía 500 g /ml de geneticina selectivo con antibióticos (Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.).
La migración de células de ensayo
El BD Falcon Cultivo Celular Sistema de inserción que contenga tereftalato de polietileno (PET) membranas con poros de 8 micras (BD Biosciences, Rockville, MD, EE.UU.) fueron utilizados para este ensayo. Los insertos se pre-recubrieron durante la noche con 5 g /cm
2 fibronectina a 4 ° C y se equilibraron en agua durante 2 horas a 37 ° C antes de su uso. Se recogieron las células tripsinizadas, contadas y 5 × 10
4 células se resuspendieron en 250 l de medio libre de suero. La cámara superior del inserto se llenó con la suspensión de células, mientras que 750 l de medio que contiene 10% de FBS se añadieron a la parte inferior de cada pocillo. Se dejó que las células UROsta migrar durante 16 horas en un ambiente humidificado a 37 ° C con 5% de CO
2. Después de la migración, las células fueron retirados de la superficie superior de la membrana frotándola con un paño de algodón húmedo. La superficie inferior de las membranas se tiñeron utilizando el kit de tinción Hema-3 (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EE.UU.). Una vez que se terminó la tinción de las membranas se enjuagaron en agua destilada para el exceso de eliminación de manchas y se secó al aire durante la noche. migración por ciento o invasión se calculó contando y promediando el número de células invadidas en 10 campos aleatorios de vista con un aumento 40 ×, dividida por el área del campo de visión del microscopio y, a continuación, multiplicado por el área de la inserción Transwell. A continuación, se divide el número previamente calculada por el número de células sembradas y por último se multiplica por 100 para obtener un porcentaje. Este experimento se realizó de forma independiente en tres ocasiones en los duplicados.
invasión de la célula de ensayo
El BD BioCoat Matrigel Invasión Cámara de cultivo de células del sistema de inserción que contenga 8 micras membrana de PET (BD Biosciences) con una fina capa de Matrigel membrana basal Matrix se utilizó para este ensayo. se recogieron las células tratadas con tripsina, se contaron y se resuspendieron a 5 x 10
4 células /ml en medio libre de suero. La cámara superior recibió 500 l de la suspensión celular, mientras que 750 l de RPMI con 10% de FBS se añadió al pocillo. Se dejó que las células para invadir durante 16 horas en un ambiente humidificado a 37 ° C con 5% de CO
2 antes de la eliminación de células de la superficie superior con un hisopo de algodón húmedo. Las membranas fueron teñidas utilizando el kit de tinción Hema-3 (Thermo Fisher Scientific) y el porcentaje de invasión se calculó como se describe en la sección de ensayo de migración celular. Este experimento se realizó de forma independiente en tres ocasiones en los duplicados.
luciferasa Dual ensayo
UMUC3 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos a 0,3 x 10
6 células /pocillo, a continuación, transfectadas transitoriamente dentro 24 horas usando el reactivo de transfección de ADN HP X-tremeGENE (Roche Applied Science) con 4 g de 3 × forkhead elemento de respuesta (FHRE) construcción de reporte (Addgene plásmido#1789) y 0,1 g pBIND Renilla luciferase control del vector (Promega, Madison, WI, ESTADOS UNIDOS). Se incubaron las células transfectadas durante 24 horas en un ambiente humidificado a 37 ° C con 5% de CO
2. Las células fueron suero de hambre durante la noche y tratados con control de vehículo (acetato de metilo, Sigma-Aldrich) o 1 U46619 mu M (Cayman Chemical) durante 30 o 120 minutos. A raíz de las células de tratamiento se lavaron dos veces con PBS y se recogieron en tampón de lisis reportero (Promega). La luminiscencia se midió utilizando un luminómetro de microplacas Veritas (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, EE.UU.) en 20 l de cada muestra durante 10 segundos después de cada inyección de 50 l Luciferase Assay Reagent II y luego se detiene y 50 l resplandor. El promedio de expresión de luciferasa de luciérnaga se ajustó a la expresión de la proteína total de luciferasa de Renilla y control de vectores, y luego se normalizan para el control del vehículo. Los resultados representan la actividad media por ciento de tres experimentos independientes realizados en los duplicados, Estudiante de
t
alltests (*) P & lt; 0,05
nuclear /citoplasmática de células fraccionamiento
UMUC3 células. se privaron de suero durante la noche, a continuación, previamente con 1 M indometacina (Cayman Chemicals) durante 10 minutos para reducir endógeno TXA 2 señalización
. Las células se trataron con vehículo o U46619 1 M durante 5, 30, o 120 minutos. Las células se tripsinizaron, recogieron y se lavaron dos veces con PBS. El fraccionamiento se realizó utilizando el kit de Pierce NE-PER nuclear y citoplasmática de extracción (Thermo Fisher Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. Los extractos se analizaron por Western blot.
inmunoprecipitación
La inmunoprecipitación de FOXO3 de UMUC3 células se realizó utilizando el kit de IP /Co-IP vinculada con NHS (Thermo Fisher Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, las células fueron cultivadas a UMUC3 80% de confluencia en placas de 10 cm, y luego se colocan en medio libre de suero durante 24 horas en un ambiente humidificado a 37 ° C con 5% de CO
2. Las células se trataron a continuación, ya sea con el control del vehículo (acetato de metilo, Sigma-Aldrich) o 1 M U46619 (Cayman Chemical) para 30, 60, o 120 minutos. A raíz de las células de tratamiento se lavaron una vez con PBS (-Ca, Mg) y se recogieron en tampón enfriado con hielo IP lisis /lavado suplementado con cóctel inhibidor de la proteasa libre de EDTA y cóctel inhibidor de PhosSTOP (Roche). lisado se recoge a continuación, se centrifuga para eliminar los restos celulares y se determinó la concentración de proteínas utilizando el kit de ensayo de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific). Las perlas magnéticas activadas con NHS se agitaron y 25 l de suspensión se transfirió a tubos de 1,5 ml por reacción de IP. Los tubos fueron colocados en la solución de imán y el almacenamiento se descartó, y después se lavaron con HCl mM enfriado en hielo 1 y suavemente vortex durante 5 segundos. Las perlas se recogieron en soporte magnético y se descartan el sobrenadante.
La solución de anticuerpo se preparó diluyendo dos FOXO3 g (Santa Cruz Biotechnology) y la fracción de inmunoglobulina de conejo de control negativo (absorbida en fase sólida) (Dako, Carpinteria, CA , EE.UU.) a una concentración final de 2 mg de anticuerpo en 100 l de tampón de borato 0.067M. Añadido 100 l de solución de anticuerpo preparada a las perlas activadas, suavemente agitó en vórtex, y se incubaron en una plataforma giratoria durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las reacciones se agitaron con vórtex cada 10 minutos durante la incubación para asegurar que las perlas se mantuvieron en suspensión. Las perlas se recogieron y el sobrenadante se descartó. Se lavan perlas dos veces con tampón de elución, vórtex los tubos de cada lavado para eliminar el anticuerpo no unido covalentemente. El enfriamiento tampón se añadió a las perlas y se incubó en una plataforma rotatoria durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las perlas se recogieron en soporte magnético y descartan el sobrenadante. Y se añadió 0,5 ml de tampón de borato modificado para cada IP y se mezcló suavemente por torbellino, a continuación, se recogieron los granos en soporte magnético y se descartan el sobrenadante. Las reacciones se lavaron dos veces con tampón de lisis /lavado IP, a continuación, se incubó cada reacción de IP con 100 g de lisado en un volumen final de 500 tampón de lisis /lavado l IP suplementado con inhibidores de la proteasa y fosfatasa cóctel durante la noche (entre 14-18 horas a 4 ° C en un rotador. las perlas se agitaron con vórtex cada 15 minutos la primera hora para asegurar las perlas quedaron en suspensión. Después de la incubación del antígeno se recogieron las perlas, se lavó dos veces con tampón de lisis IP /lavado y después se transfirió a un nuevo tubo de 1,5 ml. perlas lavadas con agua ultrapura (pH 7,0), luego se coloca en el soporte magnético y se desechó el sobrenadante. las proteínas se eluyeron de las perlas con tampón de elución de pH bajo (pH 2,0) dos veces y se neutralizó con Tris-HCl pH 8.5. las proteínas eluidas se analizaron entonces mediante transferencia Western .
el análisis estadístico
Los resultados continuos se compararon a través de condiciones utilizando
t-test
. Los experimentos se compararon con más de dos variables utilizando un uno-dos caras de Student para dos muestras ANOVA de un factor seguido de un test post-hoc de Tukey. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Desmontables de FOXO3 Aumenta urotelial migración y la invasión
Nos informó anteriormente un papel para el receptor TPβ en urotelial. migración, invasión, y la transformación maligna [3], [14]. FOXO3 expresión reducida en los pacientes también se ha relacionado con la invasividad del cáncer urotelial [30]. Para determinar si la inactivación FOXO3 sería suficiente para inducir un fenotipo maligno independiente de TPβ, bajo TPβ endógeno líneas celulares que expresan UROsta y SVHUC (determinado anteriormente [14]) fueron transfectadas establemente con FOXO3 específica shRNA (Figura 1A). células FOXO3-shRNA transfectadas reducción de la expresión de proteínas FOXO3 más de la mitad en comparación con revueltos (SCR) -shRNA observados por Western blot y validados por el examen de la diana aguas abajo MnSOD (Figura 1A). En comparación con las células scr-shRNA desmontables de expresión FOXO3 resultó en un aumento del 39% y 114% en la migración, así como un aumento del 63% y 18% en la invasión de las células SV-HUC y UROsta, respectivamente, (P & lt; 0,05, Figura 1B-C). Dado que la ausencia de FOXO3 era suficiente para inducir un fenotipo maligno en las células uroteliales no transformadas inmortalizadas, se examinó el efecto de la sobreexpresión TPβ sobre la inactivación FOXO3. células SV-HUC y UROsta transfectadas con TPβ muestran un aumento de 0,5 veces en la expresión basal de la proteína pFOXO3-S294 inactiva (Figura 1D-E).
(A) por transferencia Western de lisados de células enteras de SV -HUC células y UROsta transfectadas de forma estable con FOXO3-shRNA o control revueltos (scr-) shRNA immunoblotted para FOXO3 total y su objetivo abajo MnSOD conocido. a-tubulina se aplicó como control de carga. Las transferencias que se muestran son representativos de tres experimentos individuales y números representan los coeficientes promediados de FOXO3 a alfa-tubulina. Ratios de cuantificación mediante Image Studio Lite Ver.3.1. SV-HUC y UROsta FOXO3 desmontables y de control de los clones se sembraron en insertos recubiertos con fibronectina o matrigel y se dejaron migrar (B) o invadir (C) durante 16 horas. Desmontables de FOXO3 aumentó SV-HUC y la migración celular UROsta (39% y 114%) y la invasión (63% y 18%, respectivamente) en comparación con scr-shRNA. Los datos representan tres ensayos independientes realizados por duplicado y se expresaron como la media ± SEM. La significación se determinó con un dos muestras de dos caras
t-test
, (* = P & lt; 0,05, n = 3) en comparación con el control scr-. (D) La sobreexpresión de GFP etiquetada TPβ en células UROsta y SVHUC aumenta basal pFOXO3-S294 expresión (E) en comparación con el control de vector (n = 3). Los números representan los coeficientes promediados de pFOXO3-S294 a FOXO3. Ratios de cuantificación mediante Image Studio Lite Ver.3.1. [UA] = unidades arbitrarias.
Efectos de la estimulación agonista TP en FOXO3 fosforilación, la localización y la actividad transcripcional
Para demostrar TXA de señalización
2 está implicada en la regulación FOXO3, el estado de fosforilación de FOXO3 y su regulador conocida ERK se examinaron en UMUC3 células después de la estimulación agonista U46619 TP (Figura 2A). La fosforilación mediada por agonista TP de ERK en T202 /Y204 se incrementó significativamente (~ 1 veces) 15 y 30 minutos después de la estimulación (Figura 2A y C). En consecuencia, se observó un aumento significativo en pFOXO3-S294 15 (5 veces), 30 (7 veces), y 60 (3,5 veces) minutos después de la estimulación agonista de TP (Figura 2A-B). El tratamiento de las células con el UMUC3 pinano antagonista de TP (PTXA
2) o un inhibidor de ERK (U0126) atenuó el U46619 efectos de ERK activado y pFOXO3-S294 (Figura 2D-I) mediada.
(A) células UMUC3 fueron tratados con 1 U46619 mu M durante los tiempos indicados. Los lisados celulares se analizaron por inmunotransferencia de ERK tanto total y fosforilada y FOXO3. GAPDH sirvió como control de carga. Las manchas se cuantificaron y proporciones de (B) pFOXO3-S294 a FOXO3 y (C) pERKT202 /Y204 de ERK1 /2 se representa gráficamente utilizando GraphPad Prism 5. UMUC3 células pretratadas durante 15 minutos con (D) 2 M TP antagonista pinano (PTXA
2) o (G) 10 inhibidor de ERK mu M (U0126) atenúan la activación de ERK y la fosforilación de FOXO3 después del tratamiento con 1 U46619 mu M durante 30 minutos. Los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia para ambos ERK fosforilada y total y FOXO3. -tubulina sirvió como control de carga. Los gráficos representan las proporciones de (E e I) cuantificaron pFOXO3-S294 a FOXO3 y (F y G) pERKT202 /Y204 de ERK1 /2 se graficaron. La significación se determina para todos los borrones cuantificados, a través de una medida repetida ANOVA de una vía con la prueba post-hoc de Tukey. P & lt;.
0,05
Los efectos de la estimulación agonista TP sobre la actividad transcripcional FOXO3 fueron examinados por un ensayo de luciferasa dual. células UMUC3 fueron transfectadas transitoriamente con el elemento de respuesta forkhead (FHRE) constructo informador de luciferasa de luciérnaga y Renilla control de vectores, antes del tratamiento con vehículo o agonista de TP. FOXO3 actividad transcripcional se redujo significativamente en un 36% y 44% a los 30 y 120 minutos, respectivamente, después de la estimulación agonista de TP en comparación con el control del vehículo (Figura 3A).
células UMUC3 (A) transfectadas transitoriamente con 3 × forkhead elemento de respuesta (FHRE) construcción de reporte y control de Renilla luciferasa de vectores se trataron con U46619 1 M durante 30 o 120 minutos y se produjo una reducción de la actividad transcripcional FOXO3. El promedio de expresión de luciferasa de luciérnaga se ajustó a la expresión de la proteína total de luciferasa de Renilla y control de vectores antes de la normalización de control del vehículo. Los resultados representan la actividad media de luciferasa por ciento de tres experimentos independientes realizados por duplicado. * P & lt; 0,05, ANOVA de una vía con la prueba post-hoc de Tukey. (B) células UMUC3 fueron privadas de suero durante la noche y trataron previamente durante 15 min. con 1 M indometacina antes del tratamiento con vehículo o 1 U46619 mu M para 5, 30, o 120 minutos. Las células se sometieron a fraccionamiento nuclear y citoplasmática y las proteínas se analizaron por Western blot. α-tubulina y Lamin-B1 sirvieron como controles de carga para las fracciones citoplasmáticas y nucleares, respectivamente. (C) La densitometría de manchas que muestran la estimulación agonista prolongado aumento de la proteína citoplasmática FOXO3 y el aumento de las proteínas pFOXO3 nuclear en comparación con los controles del vehículo. La significación se determina para todos los borrones cuantificados, a través de una medida repetida ANOVA de una vía con la prueba post-hoc de Tukey. P & lt;.
0,05
Sobre la base de la cinética de fosforilación de FOXO3, se analizó la distribución celular de FOXO3 en UMUC3 células tratadas con vehículo o agonista TP durante 5, 30 o 120 minutos. fracciones de proteínas nucleares y citoplásmicas se analizaron por Western blot (Figura 3B) y las densidades de la banda se cuantificaron utilizando Image Studio Lite Ver 3.1 (Figura 3C). células estimuladas con agonista UMUC3 TP mostraron un aumento inicial de FOXO3 nuclear que también se asoció con un aumento de la nuclear pFOXO3-Ser294 (Figura 3C). estimulación prolongada resultó en un aumento significativo en FOXO3 total en el citoplasma (Figura 3C).
estimulación TP aumenta la expresión de SIRT1, desacetilación de FOXO3, y afecta FOXO3 expresiones objetivo
El efecto de la estimulación U46619 en los niveles de expresión de p27 bien caracterizado objetivos FOXO3
Kip1, MnSOD, y Bim fueron examinados por Western blot (Figura 4A). UMUC3 células estimuladas con U 46619 durante 30, 120 y 240 minutos observó disminución de p27
proteínas Kip1 y Bim, y el aumento de expresión de la proteína MnSOD (Figura 4A). Puesto que el patrón de expresión de los objetivos FOXO3 se parecía al patrón observado tras la sobreexpresión de la histona deacetyltransferase SIRT1 [21], se investigó el efecto de la estimulación U46619 sobre la expresión de SIRT1. células estimuladas con agonista UMUC3 TP muestran una mayor expresión de SIRT1 y disminución de la expresión de p300 en comparación con el control del vehículo (Figura 4B-C). Para determinar si el aumento de la expresión de SIRT1 en UMUC3 células estimuladas con agonista TP estado afectado FOXO3 acetilación, FOXO3 se inmunoprecipitó a partir UMUC3 células tratadas con vehículo o U46619, y inmunotransferencia de residuos de lisina acetilados. La estimulación de células con UMUC3 U46619 para 120 y 240 minutos mostró un 48% y 70% de reducción en FOXO3 acetilado, respectivamente (Figura 4D-E).
células (A) UMUC3 tratados con vehículo o U46619 1 M durante 30, 120, y 240 minutos. Los lisados celulares fueron recogidos y analizados por Western blot para la expresión FOXO3 total y objetivos de abajo p27
Kip1, MnSOD, y Bim. (B) Expresión de proteínas de p300 y SIRT1 en lisados de células mismas. α-tubulina sirvió como control de carga. valores (C) Cuantificación de borrones de tres experimentos independientes se representan gráficamente. (*) Indica p & lt; 0,05, ANOVA de una vía, en comparación con el tiempo 0 para cada relación de destino. (D) El aumento de expresión de SIRT1 mediada por células U 46619 en UMUC3 correspondió con una disminución de FOXO3 acetilado. FOXO3 total se inmunoprecipitó a partir de células privadas de suero UMUC3 tratados con vehículo o U46619 1 M durante 30, 120, o 240 minutos. Las proteínas eluidas se analizaron por Western blot con anticuerpos contra restos de lisina acetilados y FOXO3. Blots son representativos de tres experimentos independientes. Las transferencias se cuantifican y se graficaron las proporciones de (E) acetilada-lisina (acetil-K) para FOXO3. La significación se determinó a través de medidas repetidas ANOVA de una vía con la prueba post-hoc de Tukey. P & lt;. 0,05
ERK resistentes mutado FOXO3
3A reducido TP agonista mediada por migración y la invasión
UMUC3 células fueron transfectadas establemente con un vector de GFP-o mutadas de GFP-FOXO3
constructo 3A en la que los tres residuos de la fosforilación de ERK se sustituyeron por residuos de alanina para imitar un no fosforilada o activo estado (Figura 5A). Para determinar si la fosforilación mediada por U46619 de FOXO3 por ERK afecta a la migración celular y la invasión, se dejó que las células transfectadas de forma estable para migrar e invadir después de la estimulación con vehículo o U46619. Las células GFP-vector de control resultaron en un aumento de 2 veces en la migración celular y la invasión con la estimulación U46619 en comparación con el control del vehículo, mientras que la expresión de la GFP-FOXO3
proteína 3A reducción de la migración mediada por U46619 y la invasión (Figura 5B-C) .
(a) GFP-FOXO3
3A o EGFP-C
2 (vector) se transfectaron de forma estable en las células y la expresión UMUC3 FOXO3 mutante fue confirmada por inmunotransferencia para GFP. α-tubulina sirvió como control de carga. Las células se sembraron en insertos recubiertos con fibronectina para la migración o matrigel para la invasión en medio libre de suero que contienen 1 U46619 mu M y se colocan en los pocillos que contenían medio completo con U46619 1 M. Las células se dejaron migrar (B) durante 8 horas o invadir (C) durante 16 horas. La significación se determinó con un dos muestras de dos caras
t-test
, (* = P & lt; 0,05, n = 3) en comparación con el control GFP-vector. (D) células UMUC3 se pretrataron con 10 U0126 mu M durante 15 minutos antes de la estimulación con U46619 1 M y se dejaron migrar durante 16 horas. Los datos representan tres ensayos independientes realizados por duplicado y se expresaron como la media ± SEM. La significación se determinó con un ANOVA de una vía con la prueba post-hoc de Tukey. P & lt;.
0,05
Para demostrar aún más la importancia de la señalización de ERK en el TXA
2 movilidad mediada por células, nos pre-tratados con el inhibidor de ERK U0126 (10 mM) durante 10 minutos antes de medir la efecto sobre la migración mediada por U46619.