Extracto
expresión y la actividad del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) /proteína cinasa B (Akt) vía de señalización está asociado con el desarrollo, la progresión y la resistencia al tratamiento del cáncer de cabeza y cuello (HNC) elevada. Varios estudios han demostrado que microRNA-7 (miR-7) regula la expresión de EGFR y la actividad de Akt en una gama de tipos de células de cáncer a través de su interacción específica con la región de EGFR mRNA 3 'no traducida (3' UTR). En el presente estudio, encontramos que el miR-7 regula la expresión de EGFR y la actividad de Akt en líneas celulares de HNC, y que esto se asoció con una reducción del crecimiento
e in vitro
in vivo Red de células ( HN5) que eran sensibles al inhibidor de tirosina quinasa de EGFR (TKI) erlotinib (Tarceva). miR-7 actuó sinérgicamente con erlotinib para inhibir el crecimiento de las células FaDu erlotinib resistentes, un efecto asociado con el aumento de la inhibición de la actividad de Akt. el análisis de microarrays de líneas celulares y HN5 FaDu transfectadas con miR-7 identifica un conjunto común de regulación a la baja de miR-7 genes diana, proporcionando información sobre la función supresora de tumores de miR-7. Por otra parte, hemos identificado varios objetivos de miR-7 ARNm con un supuesto papel en la sensibilización de las células FaDu al erlotinib. En conjunto, estos datos apoyan la regulación coordinada de la señalización Akt por miR-7 en células HNC y sugieren el potencial terapéutico de miR-7 solos o en combinación con ITC del EGFR en esta enfermedad
Visto:. Kalinowski FC, Giles KM, Candy PA, Ali A, C Ganda, Epis MR, et al. (2012) La regulación del factor de crecimiento epidérmico receptor de señalización y sensibilidad Erlotinib en la cabeza y las células del cáncer del cuello por el miR-7. PLoS ONE 7 (10): e47067. doi: 10.1371 /journal.pone.0047067
Editor: G. Hidayatullah Munshi, Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de mayo de 2012; Aceptado: 7 Septiembre 2012; Publicado: 24 Octubre 2012
Derechos de Autor © 2012 Kalinowski et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación médica de Australia Nacional de Salud e Investigación y el Fondo de Comercialización médica de Australia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de cabeza y cuello (CCC) es el sexto cáncer más común, con aproximadamente 600.000 nuevos casos por año en todo el mundo [1]. A pesar de los avances en las modalidades de tratamiento, el pronóstico de muchos pacientes con CCC que se presentan con enfermedad avanzada o metastásica sigue siendo pobre [2]. El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), un miembro de la familia ErbB de receptores tirosina quinasa (RTK), se sobreexpresa en más del 80% de todas las HNCS y es un predictor independiente de mal resultado [3]. la señalización de EGFR activa una red de vías de aguas abajo, incluyendo la fosfoinosítido 3-quinasa (PI3K) /Akt [4], [5] y Ras /Raf /ERK1 /2 [6], [7] vías, que promueven la proliferación de células tumorales, invasión, metástasis, la angiogénesis y la resistencia a la apoptosis. Por consiguiente, el EGFR se ha convertido en un objetivo terapéutico importante en HNC.
Cetuximab es un anticuerpo monoclonal (mAb) dirigido contra el EGFR que mejoró la supervivencia de los pacientes tratados HNC en combinación con radioterapia o quimioterapia [8], [ ,,,0],9]. ITC pequeña molécula, tales como gefitinib y erlotinib, también se han evaluado en HNC avanzada y haber tenido algún efecto antitumoral clínica en un pequeño subgrupo de pacientes [10], [11]. También se han iniciado ensayos clínicos en HNC que evalúan la combinación de inhibidores de EGFR con otros enfoques terapéuticos, así como los estudios que investigan los agentes de nueva generación anti-EGFR, como el panitumumab anti-EGFR mAb y la doble EGFR /HER2 TKI lapatinib [12] . La pobre respuesta clínica de HNC a las terapias anti-EGFR es debido a la resistencia inherente y adquirida de las células HNC a estos agentes, que se cree que se producen a través de varios mecanismos, incluyendo mutaciones en EGFR y sus efectores aguas abajo que activar la señalización (por ejemplo. Pérdida de PTEN, PI3K mutación o sobreexpresión), la señalización de compensación a través de otros RTK (por ejemplo. los demás miembros de la familia ErbB, factor de crecimiento insulínico tipo 1 del receptor (IGF1R), o c-Met), y la transición de un epitelial a un fenotipo mesenquimal ( EMT) [12], [13], [14]. Por lo tanto, se requieren nuevos enfoques para inhibir eficazmente las vías de señalización oncogénicas aguas abajo que se activan de manera independiente en EGFR-EGFR HNC resistente a los inhibidores.
microRNAs (miRNAs) son cortos, endógenos, los ARN no codificantes que unirse a la región 3 'no traducida (3'-UTR) de mRNAs específicos para reprimir la expresión de genes, ya sea a través de la inducción de la represión de la traducción o transcripción degradación [15]. miRNAs puede regular muchos objetivos de genes, a menudo de una manera coordinada dentro de una vía celular o de la red [16], y, al hacerlo, el control de diversos procesos celulares, incluyendo el desarrollo, la diferenciación, la apoptosis y la progresión del ciclo celular [17]. miARN expresión aberrante es una característica de muchos tipos de cáncer, incluyendo HNC, y estos miRNAs pueden actuar como supresores de tumores u oncogenes [18]. Por ejemplo, let-7d expresión se reduce en muchos HNCS, causar la expresión RAS elevada, aumento del crecimiento del tumor y la reducción de la supervivencia de los pacientes [19]. Por el contrario, miR-184 expresión está regulada positivamente en el carcinoma de células escamosas lengua, lo que conduce a una mayor expresión de la
c-Myc oncogén
, el aumento de la proliferación celular y el crecimiento del tumor [20]. Informes recientes sugieren que los miRNAs pueden tener utilidad como nuevas terapias para el cáncer o biomarcadores de diagnóstico /pronóstico [18], [21], [22].
Nosotros y otros han demostrado que el miR-7 inhibe la expresión de EGFR y Akt aguas abajo y ERK1 /2 en la actividad de pulmón, de mama, cáncer de próstata y glioblastoma [23], [24], lo que lleva a la proliferación celular reducida y la supervivencia. La regulación de la expresión de EGFR implica la interacción directa, específica de miR-7 con dos miR-7 sitios diana dentro del EGFR mRNA 3'-UTR. Por otra parte, el miR-7 regula la expresión de otras moléculas de abajo del EGFR en forma de coordenadas, incluyendo RAF1, IRS1, IRS2, PAK1 [23], [24], [25], el apoyo a una función supresora de tumores de miR-7 en estos y otros tipos de cáncer. En el presente estudio, se investigó la función de miR-7 en la señalización del EGFR y el crecimiento en HNC
in vitro
y
in vivo
, centrándose en las líneas celulares que son sensibles o resistentes al EGFR erlotinib TKI. La hipótesis de que el miR-7 podría inhibir la expresión de EGFR y la señalización aguas abajo, y se evaluó la sinergia entre erlotinib y miR-7 en células HNC erlotinib resistente. Por último, se realizó un análisis de microarrays de dos líneas de células HNC para identificar nuevos objetivos de miR-7 que dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a su acción supresora de tumores en HNC. Nuestros resultados tienen amplias implicaciones para el tratamiento de HNC con terapias dirigidas a EGFR y el uso de miR-7 como una novela anti-HNC terapéuticos.
Resultados
Sensibilidad diferencial de HNC Líneas celulares a el EGFR inhibidor erlotinib
para establecer la sensibilidad relativa de HN5, FaDu, y SCC-25 células HNC al erlotinib inhibidor de EGFR, hemos realizado ensayos Titre celulares de células tratadas con un amplio intervalo de concentraciones (Fig. 1 ). Mientras que las células HN5 eran muy sensibles a erlotinib (CE
50 = 0,6 M), las células FaDu eran resistentes a la droga (CE
50 = 8,3 M). SCC 25 células muestran sensibilidad intermedia a erlotinib (CE
50 = 3,8 M) se han reportado células HN5 para sobreexpresar EGFR a través de una amplificación de genes [26], y ser muy sensibles a la inhibición del EGFR
in vitro
y
in vivo
[27]. FaDu y SCC-25 células presentan la expresión de EGFR moderado y se ha demostrado que exhiben resistencia a la gefitinib inhibidor de EGFR [28]. Nuestros resultados son consistentes con estos informes, en los que las células FaDu son ~ 10 veces más resistente a erlotinib que las células HN5. En conjunto, las células HN5 son representativos de EGFR HNC inhibidor sensible, las células FaDu representan HNC que es resistente a la inhibición del EGFR, y SCC-25 células representan HNC con la resistencia a EGFR-inhibidor intermedio. Por lo tanto, podemos investigar la actividad supresora de tumores de miR-7 en cada una de estas configuraciones.
HN5 (rojo) Fadu (azul) y SCC-25 células (verde) se sembraron en placas de 96 pocillos y tratados con el inhibidor de EGFR erlotinib (concentración final 0-100 mM). Se determinó la concentración efectiva media máxima (EC
50) de erlotinib para cada línea celular después de la medición del número relativo de células viables mediante el ensayo de título de células 3 d después de la adición de erlotinib. Se normalizaron los datos a la menor concentración de erlotinib. Las barras de error representan desviaciones estándar. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
miR-7 regula la expresión de EGFR y Akt actividad en HNC Líneas Celulares
Antes, nosotros y otros identificaron el EGFR mRNA 3'-UTR como un objetivo específico de miR-7 en múltiples líneas celulares de cáncer diferentes, y demostró que miR-7 es un potente inhibidor de la señalización de EGFR y la viabilidad celular [23], [24]. Curiosamente, el miR-7 atenúa la señalización del EGFR EGFR en U87MG resistente a los inhibidores (glioblastoma) y A549 (cáncer pulmonar de células no pequeñas) las células [23], [24]. Dada la importancia del papel de EGFR señalización en HNC tumorigénesis y el tratamiento, se investigó la capacidad de miR-7 para inhibir la expresión de EGFR y la señalización corriente abajo en líneas de células HNC. Estamos transfectadas HN5 Fadu y líneas de células SCC-25 con miR-7 o un control negativo miARN, MIR-NC, y se realizó el Western Blot para determinar el impacto de miR-7 sobre la expresión de EGFR y la actividad de Akt. miR-7 inhibe la expresión de EGFR y la actividad (P-EGFR), así como la actividad de Akt (P-Akt), un efector aguas abajo clave de EGFR (Fig. 2A). La reducción de la actividad de Akt causada por miR-7 se asoció con un aumento en los niveles relativos de Akt total (Fig. 2A), un efecto que posiblemente refleja un mecanismo de retroalimentación que controla la expresión de Akt en células de cáncer de cabeza y cuello. No se observó inhibición de la señalización ERK1 /2 en cabeza y cuello líneas celulares de cáncer de miR-7 (datos no mostrados). Invertir análisis transcriptasa reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-qPCR) de células HNC transfectadas con miR-7 demostrado un descenso de la expresión de EGFR mRNA (células HN5, Fig 2B;. Células FaDu, datos no mostrados), un hallazgo consistente con nuestros estudios previos con el miR -7 en el glioblastoma, de pulmón, de mama y próstata células del cáncer [24]. La reducción de EGFR mRNA de miR-7 también es apoyado por un informe reciente que sugiere que la mayoría de miRNAs reprimir la expresión génica mediante la promoción de descomposición de ARNm [29]. Finalmente, se confirmó la inhibición directa de la expresión de EGFR por miR-7 a través de su acción sobre el EGFR 3'-UTR utilizando ensayos de genes informadores en células HNC. La co-transfección de las células HNC con miR-7 y un constructo indicador de luciferasa de luciérnaga que contiene la longitud completa EGFR mRNA 3'-UTR produjo actividad de reportero significativamente menor que con miR-NC (células FaDu, Fig 2C;. Células HN5, datos no mostrados ), lo que confirma que el miR-7 interactúa con EGFR específica 3'-UTR sitios objetivo [24] en las células HNC. Tomados en conjunto, estos resultados indican que el miR-7 inhibe el EGFR mRNA y expresión de la proteína y la señalización aguas abajo al menos en parte a través de la orientación directa del EGFR mRNA 3'-UTR.
(A) Análisis Western Blot de EGFR, P-EGFR, Akt y los niveles de P-Akt en HN5 (panel izquierdo) y FaDu (panel central) y SCC-25 (panel derecho) células 3 d después de la transfección con moléculas o vehículo precursor de miR-7 o miR-NC (LF2000) solamente. β-actina se incluye como control de carga. (B) Análisis de RT-qPCR de la expresión de EGFR mRNA en células HN5 24 h después de la transfección con moléculas precursoras de miR-7 o miR-NC. Los datos se normalizó a la expresión de GAPDH mRNA y expresa en relación con las células transfectadas con el miR-NC. (C) ensayo indicador de luciferasa con células FaDu co-transfectadas con moléculas de miR-7 o miR-NC precursoras, una de cuerpo entero EGFR mRNA 3'-UTR plásmido indicador de luciferasa de luciérnaga, y un
Renilla
plásmido indicador de luciferasa . la actividad de la luciferasa de luciérnaga se evaluó 24 horas después de la transfección, normalizado a
Renilla luciferasa
mediciones y los datos se expresó respecto al vehículo (LF2000) únicamente las células transfectadas. Las barras de error representan desviaciones estándar. Todos los datos son representativos de tres experimentos independientes. *, P. & Lt; 0,001, miR-7 frente a miR-NC
miR-7 inhibe el crecimiento de células sensibles a erlotinib-HN5
in vitro
y
in vivo
HN5 células HNC son muy sensibles a erlotinib y por lo tanto representan un excelente modelo para evaluar la importancia funcional de la inhibición del EGFR por miR-7
in vitro
y
in vivo
. Se investigaron los efectos de miR-7 en células HN5 erlotinib sensible mediante la medición de la viabilidad celular con ensayos de células titre 5 días después de la transfección transitoria de miR-7. En comparación con el vehículo (LF2000) y miR-NC, miR-7 reducido significativamente el crecimiento celular HN5 (Fig. 3A y la Fig. 3B).
(A) ensayo colorimétrico título celular de las células HN5 5 días después de la transfección in placas de 96 pocillos con moléculas precursoras de miR-NC miR-7 o, o vehículo (LF2000) solamente. (B) Representación gráfica de ensayo de título de células a partir de (A). Los datos representan el número relativo de células viables HN5 normalizadas a las células HN5 tratados con LF2000. análisis (C) TaqMan RT-qPCR de miR-7 clones de expresión en HN5 con expresión estable de miR-7 (clon 39) o miR-NC (clon 2). Los datos se normalizó a la expresión U44 snRNA y expresa en relación con HN5 miR-NC clon 2. (D) Análisis de transferencia de Western de los niveles de EGFR, Akt y P-Akt en clones HN5 con expresión estable de miR-7 (clon 39) o miR NC (clon 2). β-actina se incluye como control de carga. (E) el recuento de células Manual de células HN5 con la expresión estable de miR-7 (clon 39) o miR-NC (clon 2). Los datos se expresan en relación con el miR-NC. ensayo (F) clonogenicidad de las células HN5 con la expresión estable de miR-7 (clon 39) o miR-NC (clon 2) 10 d después se sembraron las células en placas de 10 cm. Las barras de error representan desviaciones estándar. Todos los datos son representativos de tres experimentos independientes. *, P & lt; 0,01, miR-7 frente a miR-NC; **, P & lt; 0,005, miR-7 frente a miR-NC
Para evaluar el efecto de miR-7 sobre el crecimiento tumoral HN5
in vivo
, utilizamos la entrega lentiviral a. generar células HN5 con sobreexpresión estable de miR-7 o miR-NC. El uso de TaqMan miARN RT-qPCR observamos ~ 80 upregulation pliegue de miR-7 en células HN5 con estable expresión miR-7 (HN5 clon estable 39), en comparación con las células HN5 con la expresión de miR-NC estable (HN5 clon estable 2) (Fig . 3C). Análisis de la expresión de EGFR y la señalización por el Western Blot reveló una reducción modesta (~ 15%;
Véanse los métodos 2.7
) en los niveles de proteína EGFR en HNC con miR-7 expresión estable (figura 3D.), Pero una más grande ( ~ 25%) de reducción en los niveles de Akt fosforilada en serina-473 (P-Akt). Hemos examinado varios /miR-7 clones HN5 y observamos la sobreexpresión de miR-7 y similares niveles de EGFR y P-Akt en cada clon (Fig. S1). Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que la disminución de la actividad de Akt mediada por miR-7 no es simplemente debido a la inhibición de la expresión de EGFR y en su lugar es probable que el resultado de una coordenada reducción en la expresión y la actividad de múltiples moléculas responsables de la actividad de Akt.
Para determinar si la expresión estable de miR-7 inhibe el crecimiento HN5
in vitro
, se realizó un recuento manual de células de miR-NC HN5 clon estable 2 células y miR-7 HN5 células del clon estable 39. Estos experimentos revelaron una reducción significativa en la proliferación de 7 miR-células HN5 estable en comparación con las células HN5 estables miR-NC (Fig. 3E). Para confirmar este hallazgo, se evaluó la clonogenicidad de nuestras líneas celulares estables HN5. La expresión estable de miR-7 redujo significativamente el número y tamaño de las colonias formadas después de 10 d en comparación con las células HN5 con estable expresión de miR-NC (Fig. 3F). En conjunto, estos resultados son consistentes con los que obtuvimos con transitorios de miR-7 transfección e indican que el ~ 80 veces mayor en el miR-7 expresión en HN5 miR-7 clon estable 39 ocasiona una disminución de la actividad de Akt y reduce significativamente el
In vitro
crecimiento de las células HNC HN5.
a continuación trató de investigar el impacto de la expresión estable de miR-7 en el
in vivo
crecimiento de xenoinjertos de tumores en ratones desnudos HN5. Después de la inyección subcutánea de miR-7 HN5 clon estable 39 o miR-NC HN5 células del clon estable 2 en el flanco de ratones desnudos femeninos, los volúmenes tumorales fueron monitoreados durante un período de 29 días. Una reducción significativa en el crecimiento tumoral se observó para HN5 xenoinjertos con estable expresión miR-7 en comparación con miR-NC xenoinjertos estables HN5 (Fig. 4A y la Fig. 4B). Se utilizó el análisis TaqMan miARN QRT-PCR de miR-7 niveles para confirmar que el miR-7 sobreexpresión persistió en los HN5 /miR-7 xenoinjertos durante la duración del estudio (Fig. 4C), y también se observó una reducción de la P- los niveles de Akt en el clon HN5 /miR-7 39 xenoinjertos en comparación con HN5 /miR-NC clon 2 xenoinjertos por Western Blot (Fig. 4D y la Fig. 4E). Esta es la primera demostración de que el miR-7 puede reducir el crecimiento del tumor HNC
in vivo
, y es consistente con otros estudios recientes que demuestran que el miR-7 reduce el crecimiento del cáncer de hígado, cáncer de pulmón y xenoinjertos schwannoma en ratones [ ,,,0],30], [31], [32]. Para confirmar nuestro hallazgo y para excluir la posibilidad de un efecto clonal, se realizó un ensayo de formación de tumores en los que las células HN5 fueron transfectadas transitoriamente en cultivo con miR-7 o miR-NC, y después de 24 h inyectaron por vía subcutánea en el flanco del desnudo femenino evaluó la formación de los ratones y el tumor. Análisis de los volúmenes tumorales en 10 d reveló una inhibición significativa de la formación de tumores en ratones inyectados con células HN5 transfectadas transitoriamente con miR-7 (HN5 /miR-7), en comparación con los ratones inyectados con células HN5 tratados con vehículo o transfectada-miR-NC (HN5 /miR-NC) (Fig. S2). Estos datos apoyan nuestra observación de que estable la expresión de miR-7 inhibe el crecimiento de xenoinjertos de tumores HN5 (Fig. 4A y la Fig. 4B) y la hipótesis de que miR-7 es un potente inhibidor de la señalización de EGFR, la actividad de Akt, y la tumorigenicidad en HNC.
(A) el crecimiento de xenoinjerto de tumor HN5 después de la inyección subcutánea de estable HN5 miR-NC clon 2 (rojo) o miR-7 clon 39 (azul) de células en ratones desnudos. La media del volumen del tumor (mm
3) se representa el tiempo (d). (B) fotografías representativas de xenoinjertos de tumores de células con expresión estable de miR-NC (clon 2, izquierda) y estable la expresión de miR-7 (clon 39, derecha). (C) Análisis TaqMan RT-qPCR de miR-7 expresión en HN5 /miR-7 y xenoinjertos tumorales estables HN5 /miR-NC en el punto final experimental. Los datos se normalizó a la expresión U44 snRNA y los niveles de miR-7 se muestran en relación con HN5 /miR-NC clon 2 tumores. (D) Análisis de transferencia de Western de los niveles de Akt y Akt-P entre HN5 xenoinjertos de tumores estable /miR-7 y HN5 /miR-NC. β-actina y Akt se incluyen como controles de carga. (E) Densitometría análisis de los niveles de P-Akt entre HN5 /miR-7 (clon 39) y HN5 /miR-NC (clon 2) xenoinjertos tumorales mediante Western Blot. los niveles de P-Akt se normalizaron a la expresión de Akt total. Las barras de error representan desviaciones estándar. *, P & lt; 8,0 × 10
-5, miR-7 frente a miR-NC; **, P & lt; 1,0 x 10
-8, miR-7 frente a miR-NC; ***, P = 0,06, miR-7 frente a miR-NC.
Syngergistic Acción de miR-7 y erlotinib en FaDu y SCC-25 Las células HNC
in vitro
a medida que el miR-7 puede inhibir la expresión de EGFR, así como la actividad de Akt, la hipótesis de que podría mejorar la eficacia de la terapéutica anti-EGFR con células HNC; es decir, la combinación de miR-7 y erlotinib podría sinérgicamente inhibir el crecimiento de células HNC. Para investigar esto, hemos utilizado células FaDu que son resistentes a erlotinib (CE
50 = 8,3 M; ~ 10 veces mayor que las células HN5). células FaDu fueron transfectadas transitoriamente con miR-7, miR-NC, o sólo vehículo, y se tratan a los 3 días después de la transfección con un sub-CE
50 y clínicamente relevante [33] de la dosis (7,5 M) de erlotinib ( o vehículo). Después de otras 4 d, la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de título de células (Fig. 5A). miR-7 solo (sin erlotinib) y erlotinib solo (sólo vehículo; LF2000) cada uno produce una pequeña inhibición aún estadísticamente significativa del crecimiento celular FaDu. Sin embargo, la combinación de miR-7 y erlotinib produce una reducción aún mayor en el crecimiento celular, un efecto que fue determinado por el modelo aditivismo la dicha [34] para ser sinérgicos, donde E
Dicha = E
miR-7 + e
erlotinib-e
miR-7 × e
erlotinib = 0,15 + 0,18 a 0,15 × 0,18 = 0,30, y la inhibición observada experimentalmente fraccional (e
observada) con miR-7 más erlotinib fue de 0,61. También se observó sinergia entre miR-7 y erlotinib en células SCC-25 HNC (Fig. S3), donde E
Dicha = E
miR-7 + E
erlotinib-E
miR-7 × e
erlotinib = 0,61 + 0,35 hasta 0,6 x 0,35 = 0,75, y la inhibición observada experimentalmente fraccional (e
observada) con miR-7 más erlotinib fue de 0,84.
(A) el título de la célula análisis de las células FaDu que fueron transfectadas con sólo el vehículo (LF2000), miR-7, o miR-NC para 3 d, y luego tratados con erlotinib (7,5 M) o vehículo (DMSO) durante 4 d. Los datos se expresan con relación al vehículo transfectadas, las células FaDu tratados con vehículo (LF2000 menos erlotinib, primera columna). (B) Análisis de transferencia de Western de EGFR, P-EGFR, Akt y los niveles de P-Akt en células FaDu que fueron transfectadas con sólo el vehículo (LF2000), o miR-7 o miR-NC durante 3 días y luego se trató ± erlotinib (7,5 M) durante 24 h. β-actina se incluye como control de carga. (C) el análisis de densitometría de los niveles de P-Akt de Western Blot entre las células FaDu transfectadas con miR-NC o miR-7 y luego tratados con erlotinib (7,5 M) durante 24 h. Los datos se muestran en relación con las células transfectadas con el miR-NC. Las barras de error representan desviaciones estándar. Todos los datos son representativos de tres experimentos independientes. *, P & lt; 0,05, miR-7 menos erlotinib vs miR-NC menos erlotinib, y LF2000 más erlotinib vs LF2000 menos erlotinib; **, P & lt; 0,01, miR-7 más erlotinib vs miR-NC más erlotinib. † indica sinergia entre miR-7 y erlotinib como se define en el modelo aditivismo la dicha [34].
En estudios paralelos, se utilizó el Western Blot para evaluar el impacto de miR-7, erlotinib, y el combinación de miR-7 y erlotinib en la expresión de EGFR /actividad y la actividad de Akt en células FaDu (Fig. 5B). Se observó inhibición de la fosforilación de EGFR (EGFR-P) tanto con erlotinib y miR-7, mientras que el miR-7 también redujo la expresión de EGFR basal. Es importante destacar que la combinación de miR-7 y erlotinib produjo una mayor reducción en la expresión de P-EGFR que el observado con cualquiera de erlotinib o miR-7 solo, y densitometría confirmó que los niveles de P-Akt fueron menores con la combinación de miR-7 y erlotinib que con el miR-NC y erlotinib (
Véanse los métodos 2.7
; Fig. 5C). Tomados en conjunto, estos datos indican que la combinación de miR-7 y erlotinib trabaja sinérgicamente en células HNC, para inhibir simultáneamente la expresión de EGFR y la actividad, la actividad de Akt, y el crecimiento celular.
Análisis Microarray de miR-7-regulada los genes en células HN5 y FaDu HNC
Para obtener más información sobre el mecanismo de acción de miR-7, tanto en HN5 y células FaDu, se realizó el análisis de microarrays en paralelo de ARN total aislado de células HN5 y FaDu que eran transfectadas con miR-7 o miR-NC. Nos elegido para la cosecha de ARN para el análisis de microarrays a las 24 h post-transfección con miARN, para maximizar la especificidad y sensibilidad, en base a nuestra experiencia previa con miR-7 transfección de células A549 [24] y un informe que sugiere que la regulación a la baja de los costes indirectos de miR-124 objetivo mRNAs en células de cáncer de hígado HepG2 se inició a ~32 h después de la transfección [35]. Después de la normalización de datos, que razonó que directos miR-7 genes diana en HN5 y células FaDu serían regulados a la baja significativamente después de miR-7 transfección. Hemos refinado estas listas de genes mediante la asignación de un punto de corte para la regulación a la baja de al menos -1.5 veces y con una significación de p & lt; 0,05 (Fig. 6A), y se realizó un análisis de agrupamiento de los genes resultantes que fueron regulados a la baja de manera significativa por el miR-7 en relación con miR-NC en HN5 o células FaDu (Fig. 6B). Esto reveló superposición en los genes downregulated de miR-7 entre las dos líneas celulares. Ciento setenta y nueve ARNm se downregulated significativamente por miR-7 en células HN5 (Tabla S1), 357 ARNm se downregulated significativamente en las células FaDu por miR-7 (Tabla S2), y 103 mRNAs fueron comúnmente regulados a la baja tanto en las células FaDu HN5 y (Tabla S3). Un diagrama de Venn que consta de los miR-7 genes regulados negativamente para cada línea celular (Fig. 6C) pone de relieve la intersección de miR-7 ARNm downregulated entre HN5 y células FaDu, lo que representa una firma diana de miR-7 en células HNC. análisis gráfico de dispersión indica una fuerte correlación (R
2 = 0,435, p & lt; 0,001) entre el pliegue-disminución en la expresión de los 103 genes en respuesta a miR-7 entre HN5 y las células FaDu (Fig 6D.). También se utilizó el análisis de RT-qPCR para confirmar la regulación a la baja de RAF1 y factor de crecimiento transformante alfa (TGFA) mRNA de miR-7 en nuestros análisis de microarrays de ambas células FaDu (Fig. S4) y HN5. Estas observaciones sugieren miR-7 tiene la capacidad para dirigir el EGFR, sus vías descendentes y también un ligando de EGFR, tales como TGFA.
(A) que representan parcelas Volcán gama de sondas entre HN5 (izquierda) y FaDu (derecha ) las células 24 horas después de la transfección con moléculas precursoras de miR-7 o miR-NC. La asignación de un punto de corte de ± 1,5 veces el cambio (miR-7 frente a miR-NC) y p & lt; 0,05, sondas significativamente downregulated están en verde y sondas significativamente upregulated están en rojo. (B) Análisis de agrupamiento de genes downregulated-miR-7 en células HN5 y FaDu, donde el sombreado verde y rojo corresponde a los genes downregulated y upregulated, respectivamente. (C) Diagrama de Venn de los genes regulados negativamente-miR-7 en HN5 y las células FaDu. (D) Gráfico de dispersión de genes comunes a HN5 y células FaDu miR-7-downregulated (R
2 = 0,435, p & lt; 0,001).
Para validar nuestro enfoque de combinar el miR 7 conjuntos de genes regulados negativamente para HN5 y células FaDu para identificar ARNm diana comunes, que utilizan Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para evaluar la proporción de genes que son regulados a la baja de manera significativa por el miR-7 y eran moderada o alta confianza predijeron, o probados, MIR -7 objetivos. IPA identificó 91/179 (54%) downregulated HN5 ARNm como ser predicho o comprobada miR-7 objetivos, 113/357 (32%) downregulated FaDu ARNm como ser predicho o comprobada miR-7 dianas, y 57/103 (55%) downregulated ARNm comunes a ambas células HN5 y FaDu como supuestos o reales de miR-7 objetivos, haciendo hincapié en el enriquecimiento del gen regulado por disminución de miR-7 combinado expuesto con putativos o validados miR-7 ARNm diana y sugiriendo que representa un objetivo de miR-7 firma en células HNC.
para identificar el significado funcional de la miR-7 gen objetivo común a HN5 y células FaDu, que utiliza la API para asignar funciones a los 103 genes que fueron regulados a la baja por el miR-7 en ambos líneas celulares. Un subconjunto de los 103 genes - de los cuales más de la mitad fueron predichas o validada miR-7 objetivos - se asoció con las funciones que representan una amplia gama de procesos que intervienen en el crecimiento y progresión tumoral, incluyendo "la proliferación celular", "desarrollo de las células", "tumorigénesis", "síntesis de proteínas", "angiogénesis", "muerte celular", "ciclo celular", y "el movimiento celular" (Fig. 7). Este hallazgo pone de manifiesto la capacidad de miR-7 a coordinadamente regulan múltiples procesos oncogénicos en las células cancerosas.
genes comunes a ambas células FaDu HN5 y (103) miR-7-downregulated fueron asignados a anotado asociada a cáncer procesos que utilizan el software IPA. Estos incluyen "ciclo celular", "el movimiento celular", "proliferación celular", "desarrollo de las células", "tumorigénesis", "síntesis de proteínas", "angiogénesis" y "muerte celular". símbolos oficiales de genes se utilizan para cada gen downregulated-miR-7 y un círculo azul indica que un gen es un valor de referencia o validado objetivo de miR-7 mediante análisis de IPA.
Para obtener una mayor comprensión de la función de miR-7 como un regulador de la señalización de EGFR y la actividad de Akt - con la capacidad de sensibilizar a las células HNC a erlotinib - utilizamos IPA para asignar el grupo de genes downregulated de miR-7 en células HN5 y células FaDu a la "PI3K canónica /Akt vía de señalización "(Fig. 8). Mientras PIK3CD, PAK1, IKK y NF-kB se downregulated por las células miR-7 en HN5 pero no FaDu, la mayoría de miR-7 genes downregulated asociado con la PI3K /Akt se redujeron tanto en las células FaDu HN5 y, lo que sugiere que representar una definitiva miR-7 firma destino asociado PI3K /Akt señalización corriente abajo del EGFR. Nuestra hipótesis es que la sinergia entre miR-7 y erlotinib es al menos en parte debido a una regulación a la baja mediada por miR-7 de múltiples moléculas asociadas con la actividad de Akt en las células HNC.
Representación esquemática de las moléculas en el EGFR /vía de señalización Akt que se inhibe por el miR-7 en HNC. el software IPA se utilizó para mapear los genes downregulated-miR-7 comunes (en verde) en las células FaDu y HN5 en la vía PI3K canónica /Akt. La densidad de sombreado representa el factor de cambio regulación a la baja de un gen de miR-7. Los círculos azules indican que un gen es un objetivo previsto o validado de miR-7 mediante análisis de IPA. Varios genes que pertenecen a la vía PI3K /Akt que fueron downregulated de miR-7 en células HN5 solamente están sombreados en azul claro.
Discusión
En el presente estudio, hemos demostrado que miR-7 regula la expresión de EGFR y la señalización corriente abajo en HN5 y células FaDu HNC líneas que tienen sensibilidad diferencial a la EGFR TKI erlotinib. Encontramos que el miR-7 inhibe el crecimiento de las células HN5 erlotinib sensible
in vitro
y
in vivo
, y que el miR-7 puede sensibilizar a las células FaDu erlotinib resistente al erlotinib. el análisis de microarrays de HN5 transfectadas-miR-7 y las células FaDu identificado una firma gen diana común para miR-7, proporcionando información sobre su actividad supresora de tumores en el contexto de varias funciones asociadas con el cáncer, tales como la proliferación celular y el movimiento celular. Por último, el análisis de nuestros datos de microarrays sugirió que el miR-7 sensibiliza a las células HNC resistentes EGFR-inhibidor a erlotinib mediante la regulación coordinada expresión de múltiples moléculas asociadas con la actividad de Akt, un efector crítico de EGFR y una diana terapéutica emergente en el cáncer.
una de las principales conclusiones de nuestro estudio es que el miR-7 tiene la capacidad de sensibilizar a las células HNC erlotinib resistente a erlotinib, con la combinación de erlotinib y miR-7 que presenta una disminución sinérgico en la proliferación celular en comparación con erlotinib o miR 7 solo. Esta observación es importante, dado que la resistencia de HNC a los inhibidores de EGFR es común y un importante problema clínico [12].