Extracto
PTEN es una proteína supresora de tumores potente. cáncer de próstata agresivo y metastásico (PC) se asocia con una reducción o pérdida de expresión de PTEN. reducción de PTEN a menudo se produce sin mutaciones de genes, y su regulación a la baja no se entiende completamente. En este documento, se muestra que PTEN se incorpora en la carga de los exosomas derivados de las células cancerosas. PTEN no se detecta en exosomas derivados de las células normales, no cancerosas. Se encontró que PTEN se puede transferir a otras células a través de los exosomas. En las células que tienen una reducción o pérdida completa de la expresión de PTEN, PTEN la transferido es competente para conferir actividad de supresión de tumor a las células aceptoras. En los pacientes de PC, se muestra que PTEN se incorpora en la carga de exosomas que circulan en la sangre. Curiosamente, los sujetos normales no tienen expresión de PTEN en sus exosomas sanguíneos. Además, se encontró que el antígeno prostático específico (PSA) se incorpora en los pacientes de PC y los sujetos normales 'exosomas sanguíneos. Estos datos sugieren que exosomal PTEN puede compensar la pérdida de PTEN en las células deficientes en PTEN, y puede tener valor diagnóstico para el cáncer de próstata
Visto:. Gabriel K, Ingram A, R Austin, Kapoor A, Tang D, F Majeed , et al. (2013) La regulación del supresor de tumores PTEN través de exosomas: Un potencial de diagnóstico para el cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (7): e70047. doi: 10.1371 /journal.pone.0070047
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Noviembre 2012; Aceptado: 17 Junio 2013; Publicado: July 25, 2013
Copyright: © 2013 Gabriel et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue otorgado por cáncer de próstata Canadá y está gestionado con fondos de la Fundación Movember, Grant#D2013-2 para K.Al. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (PC) es el cáncer más frecuentemente diagnosticado y la segunda causa de muerte por cáncer en los hombres [1], [2], [3]. La pérdida de una copia del gen PTEN contribuye a la iniciación del tumor de próstata, mientras que una mayor reducción en la expresión de PTEN apoya el comportamiento invasión y metástasis de PC [4]. PTEN es una fosfatasa de proteína /lípido. Su dominio proteína tirosina fosfatasa tiene las características de una fosfatasa de especificidad dual que es capaz de desfosforilar tanto residuos de tirosina y serina /treonina. El sustrato lipídico principal de PTEN es fosfatidilinositol (3,4,5) trifosfato (PIP-3). El principal mecanismo de la supresión tumoral por PTEN es el mantenimiento de PIP-3 celular a niveles bajos, inhibiendo de este modo la vía PI3K-AKT y contribuyendo a la apoptosis celular o detención del ciclo celular [5]. La reducción de la expresión de la proteína PTEN se produce a menudo en ausencia de mutaciones de genes [6], [7], [8]. En total, aproximadamente el 70-80% de los tumores primarios de PC tiene una reducción en la expresión de PTEN [9]. Se han identificado diferentes mecanismos que contribuyen a la reducción de la expresión de PTEN en los tumores, incluyendo la metilación del promotor de proteínas reguladoras negativas [12] [10], [11], y. Se ha sugerido que otros mecanismos, desconocidos pueden estar actuando en muchos tumores [10], [11]. Nuestros resultados apuntan a un nuevo mecanismo por el cual las células cancerosas regulan la expresión de PTEN través de exosomas.
células cancerosas liberan vesículas en su entorno. Microvesículas son una variedad de vesículas cobertizo, generado a través de la brotación directa de la membrana celular. Los exosomas son otro, tipo relativamente menor de la vesícula que se almacenan en los cuerpos multivesiculares y liberado cuando el cuerpo multivesicular se fusiona con la membrana de la célula [13], [14]. exosome contenido refleja su fuente celular [15], [16]. Curiosamente, estos contenidos pueden incluir proteínas oncogénicas, como hemos informado anteriormente [17], [18], o proteínas supresoras de tumor, como se informa en el presente documento. Por lo tanto, se podría anticipar que las moléculas transferidos por exosomas confieren un fenotipo Adquirida a las células aceptoras, dando lugar a efectos positivos o negativos en relación con la progresión del tumor depende de la naturaleza de las moléculas transferidos. La carga de exosomas puede por lo tanto alterar el equilibrio entre las características de supresores de oncogénicos y tumorales. El análisis de dicha carga podría indicar el estado de expresión de proteínas supresoras de tumores en las células malignas sin tener que probar directamente el tumor maligno. Los exosomas se están convirtiendo en una fuente importante para los biomarcadores del cáncer y se describen como cofres del tesoro biomarcador para PC [19]. Se ha sugerido que el estado de PTEN en pacientes de PC podría ser un predictor de los pacientes en riesgo de metástasis del cáncer o la recidiva después de la prostatectomía radical [20], [21], [22]. Desde hace varias décadas, el antígeno específico de la próstata (PSA) se ha utilizado como biomarcador estándar para la detección de PC [23]. Sin embargo, el uso de PSA está limitada por su falta de especificidad y la incapacidad para distinguir entre formas indolentes y potencialmente mortales de la enfermedad en el momento del diagnóstico [24]. la prueba de PSA puede reducir la tasa de mortalidad de PC, sino que también está asociado con una alta tasa de sobrediagnóstico y sobretratamiento [25], [26]. En su estudio, Harvey et al. llegó a la conclusión de que la prueba de PSA tiene una alta tasa de falsos positivos y falsos negativos significativos [27]. Esta falta de valor pronóstico conduce a un enorme aumento de biopsias innecesarias y en el exceso de tratamiento de los pacientes con CP de bajo riesgo [23], [25]. Teniendo en cuenta estos resultados, hay una gran necesidad de encontrar nuevos marcadores para PC o para mejorar la especificidad de la prueba de PSA.
Materiales y Métodos
Materiales
Los anticuerpos monoclonales para PTEN, AKT, Flotilin-1, p27 y ciclina D1 se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Todos los anticuerpos secundarios conjugados con HRP correspondientes fueron adquiridos de Señalización Celular. Alexa Fluor 488 anticuerpos secundarios se adquirieron de Molecular Probes (Eugene, OR).
Las líneas celulares.
DU145, (células de cáncer de próstata humano), U87 (astrocitoma glioblastoma humano) PC-3 y las células humanas normales [células endoteliales aórticas humanas (HAOEC), la aorta células de los músculos lisos humanos (HAOSMC) y células humanas de próstata epitelial (HPEC)] se adquirieron de la ATCC (Manassas, VA). células DU145 con PTEN desmontables (DU145Kd) y las células DU 145 transfectadas con siRNA no específicas se generaron originalmente en uno de nuestros laboratorios (D. T.) en el riñón Hamilton Centro de Investigación (HKRC), Universidad de McMaster. células DU145Kd se generaron utilizando PTEN siRNA expresado por un promotor impulsado H1 vector shRNA basado-retroviral, y las células DU145 de control fueron infectadas con un retrovirus que expresa siRNA no específica, como se detalla anteriormente [12]. CHO y células CHO-EGFR se obtuvieron previamente como un generoso regalo del laboratorio del Dr. Guha en el Hospital para Niños Enfermos, de Toronto. Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio se cultivaron en microvesículas con depleción de FBS (por centrifugación durante la noche a 100.000
g
). Para el cultivo estándar, las células fueron cultivadas en medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS).
El aislamiento de exosomas del medio acondicionado y Blood Plasma
exosomas se obtuvieron de los medios de comunicación de diferentes líneas celulares y del plasma humano, tal como se describe anteriormente [18], [28], [29]. Brevemente, el medio acondicionado se recogió de las células en aproximadamente 80% de confluencia, a menos que se indique lo contrario, y este material se sometió a dos centrifugaciones consecutivas en 300
g
durante 5 minutos y después a 12.000
g
durante 20 minutos para eliminar las células y los desechos. Por último, los exosomas se obtuvieron después de la centrifugación durante 2 horas a 100 000
g
y después se lavó dos veces con un gran volumen de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Este protocolo recoge específicamente exosomas y excluye grandes vesículas. Las proteínas exosome recuperado se midieron utilizando el ensayo de Bradford (Bio-Rad).
expresión de PTEN Profile @
Las células (DU145, DU145Kd y DU145 con el control de siRNA) y las células primarias (HAOEC , HAOSMC y HPEC), junto con sus correspondientes exosomas, se lisaron durante 10 minutos en hielo en un tampón de lisis que contenía: Tris 10 mM (pH 6,8), EDTA 5 mM, NaF 50 mM, pirofosfato de sodio 30 mM, 2% (en peso ./vol) SDS, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y 1 mM Na
3Vo
4. Los lisados se resolvieron mediante SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos monoclonales de conejo para PTEN. La inmunodetección se realizó utilizando el anticuerpo apropiado conjugado con HRP secundaria y quimioluminiscencia plus kit (kit ECL; Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, Reino Unido), después de lo cual las transferencias se escanean y bandas de proteína se cuantificaron usando el software Quantity One (Bio-Rad, CA) .
la detección de la señalización de eventos relacionados con PTEN
para evaluar el impacto de los exosomas que contienen PTEN en las células DU145Kd, este último se sembraron en placas de 100 mm a una densidad de 2 × 10
5 células /ml, cultivadas brevemente, y en ayunas durante 24 horas (ya sea en DMEM suplementado con 0,5% de FBS, o en DMEM libre de suero). Los cultivos se estimularon durante la noche con diferentes concentraciones de los exosomas derivados de células DU145. Después del tratamiento exosome, los lisados celulares se prepararon y se analizaron para su contenido de efector de señalización usando anticuerpos anti-fosfo-AKT (Cell Signaling), según las recomendaciones del proveedor. La detección de la expresión de p27 y ciclina D1 se llevó a cabo utilizando los mismos parámetros experimentales utilizados para la detección de pAKT.
Fluorescent Imaging exosome de captación
En
in vitro
análisis de la expresión de PTEN, se cultivaron las células en portaobjetos de cámara (Nalge Nunc, Nueva York). Los cultivos se lavaron con PBS y se fijaron en precalentado (37 ° C) 4% (pes./vol) de paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato durante 5 minutos. A continuación, se lavaron tres veces en PBS, y se llevó a cabo en antiquenching mM NH 50
4Cl durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavaron dos veces en PBS y se incubaron con BSA [1% (pes./vol) en PBS] durante 30 minutos. La incubación con un anticuerpo primario se realizó durante 1 h, seguido de lavado en PBS, y después de la incubación con un anticuerpo secundario durante 30 minutos. Después de la tinción, los portaobjetos se montaron utilizando medio de montaje Dako fluorescente y observar bajo un microscopio confocal para detectar la presencia de contenido exosomal (PTEN) en las células receptoras.
Ensayo de actividad de PTEN
Los lisados de células DU145Kd, que fueron tratados con exosomas de células DU145, se sometieron a inmunoprecipitación usando anticuerpos PTEN (señalización celular) y la proteína G Sepharose. actividad PTEN se evaluó mediante los DiC8PtdIns sustrato solubles en agua (3, 4, 5) P3 (Echelon). Los fosfatos libres liberados se midieron con el reactivo BIOMOL verde y normalizado contra una reacción que contenía único sustrato PIP3 [12].
Detección de PTEN mRNA
DU145Kd células fueron tratadas con las preparaciones de exosoma derivados de DU145, seguido de un lavado extensivo y la extracción de ARN usando el reactivo Trizol (Invitrogen, NY). análisis de RT-PCR se realizó usando un método de un solo paso (Qiagen, CA) donde se detectó PTEN utilizando los conjuntos de cebadores: sentido 50-ATGACAGCCATCATCAAAGAG-30 y antisentido 50-GTGCCACTGGTCTATAATCCAG-30 [12]. Las reacciones se llevaron a cabo en 50 l con la activación inicial Taq a 95 ° C durante 30 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 segundos, el cebador de recocido a 60 ° C durante 1 minuto, y extensión a 72 ° C durante 30 segundos. Los productos se resolvieron en gel de agarosa al 1% y se fotografiaron. GAPDH se utilizó como control interno utilizando los conjuntos de cebadores: Sentido de 50 TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-30 y 50-antisentido TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-30
Ensayo de proliferación
El ensayo de proliferación se realizó utilizando un kit de ensayo (Chemicon. ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, 0,1 × 10
4 células DU145Kd se sembraron en una placa de 96 pocillos; después de 24 horas, las células se trataron con diferentes concentraciones de los exosomas derivados de células DU145. Otras células DU145Kd fueron tratados con exosomas derivados de DU145Kd para mostrar el efecto de exosomas con PTEN downregulated. Se utilizaron células DU145 como un control para mostrar la capacidad de los exosomas para compensar PTEN regulación a la baja en DU145Kd. Este procedimiento se utilizó para las células U87 y PC-3.
Los pacientes con cáncer de próstata y los sujetos normales
Este estudio está respaldado por la aprobación ética del comité de ética de la Universidad de McMaster (REB#02-2174) . Los participantes fueron informados sobre el propósito del estudio, y el consentimiento por escrito ha sido obtenida de todas las personas que participaron en el estudio. Las muestras de 30 pacientes de PC se utilizaron en este estudio. Los pacientes habían avanzado (T3 /T4) el estadio del tumor. Las muestras de sangre se recogieron antes de la prostatectomía, y se recogieron los tejidos tumorales después de la cirugía y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Se recogieron las historias clínicas tales como la puntuación de Gleason, PSA, el tamaño del tumor, el grado histológico del tumor y la metástasis. Las muestras se recogieron de acuerdo con las normas éticas de McMaster University, y se obtuvo el consentimiento del paciente antes del muestreo. Ocho hombres voluntarios sanos de edades 50-65 (ajustando con las muestras de los pacientes PC) se utilizaron en este estudio; todos estaban sin antecedentes de cáncer y con niveles normales de PSA.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se reproducen al menos tres veces con resultados similares. Los datos cuantitativos se presentan como el valor medio de las repeticiones en el experimento representativo ± SEM. La significación estadística se evaluó mediante la prueba t de Student un sistema informatizado de 2 colas. Las diferencias se consideraron significativas a P & lt;. 0.05
Resultados
PTEN se expresa en exosomas de células PC, pero no las células normales
Se determinó el estado de PTEN en el siguiente las células PC: DU145, DU145 transfectadas establemente con PTEN siRNA (DU145Kd) para PTEN regulación a la baja o caída, y DU145 transfectadas con ARNsi de control [12]. Los exosomas se recogieron de los medios condicionados de cada tipo celular, y las concentraciones de proteína iguales de las células y los exosomas se sometieron a SDS-PAGE y la inmunotransferencia, a continuación, se sondaron con anticuerpos PTEN. Tanto las células DU145Kd (Figura 1A) y los exosomas (Figura 1B) mostraron una regulación a la baja de la expresión de PTEN en comparación con las células DU145 de tipo salvaje y las células DU145 transfectadas con ARNsi de control. También se evaluó el estado de fosforilación de PTEN en los exosomas derivados de estas células. La fosforilación de PTEN lo mantiene en un estado cerrado protegido de la degradación; más tarde PTEN estará disponible para ser activado en el citoplasma, obligar a la membrana celular tras la desfosforilación, y luego iniciar la señalización celular [30], [31]. Se encontró que el PTEN incorporado en exosomas es fosforilada (Figura 1B, panel central). Flotilin-1 se utilizó como control de carga para exosomas [32]. Las tasas de proliferación de células parentales DU145, DU145 con control de siRNA y las células DU145Kd (Figura 1C) muestran que las células PTEN desmontables mostraron una tasa de proliferación significativamente más alto que los otros dos tipos de células. Células humanas primarias (células normales, no cancerosas), tales como las células endoteliales aórticas humanas (HAOEC), aórticas humanas células musculares lisas (HAOSMC), y células humanas epiteliales prostáticas (HPEC) expresan PTEN, pero nos pareció que PTEN no se incorpora en los exosomas de estas células (Figura 1D). Esto puede significar que la incorporación de PTEN en exosomas es una característica exclusiva de las células cancerosas, sin embargo este hallazgo requiere más exploración. La figura 1E es una micrografía electrónica de barrido que muestra el derramamiento de exosomas de células cancerosas.
A. células PC DU145 fueron transfectadas con el ARNsi se indica. Las células transfectadas con siRNA-PTEN específica mostraron una clara caída de la expresión de PTEN, mientras que las células transfectadas con siRNA control de desajuste no mostraron disminución en la expresión de PTEN. B. Los exosomas derivado de DU145, DU145Kd y DU145 con siRNA control muestran el mismo patrón de expresión de PTEN como se observa con la célula del que se derivan. PTEN incorporado en exosomas es fosforilada; fosforilación protege PTEN de la degradación, y puede ser activado por la desfosforilación en la transferencia a otras células. Los exosomas son positivos para Flotilin-1. Se evaluaron C. Las diferencias en la proliferación de DU145, DU145 con el control de siRNA y DU145Kd, con significativamente mayor proliferación exhibida por DU145Kd. células primarias D. Humanos, EAEH, HASMC y HPEC, y sus exosomas se perfilan para la expresión de PTEN. Las tres células han PTEN expresión, pero PTEN no se expresa en sus exosomas. La expresión tanto para células y sus exosomas se normalizó con Flotilin-1. E. Una micrografía electrónica de barrido que muestra el derramamiento de exosomas de células DU145.
Transferencia intercelular de PTEN por exosomas
Para investigar el intercambio intercelular de PTEN, exosomas deriva de la PC nativa DU145 se recogieron las células utilizando el procedimiento estándar de centrifugación. células DU145Kd se incubaron con la preparación exosome derivado de las células DU145 parentales. Se observó la absorción aparente de PTEN microvesicular por las células DU145Kd usando inmunocitoquímica (sustracción de fondo se realizó usando las células sin tratar como control, y la fluorescencia se restó de tanto las células no tratadas y tratadas para mostrar la adquisición de PTEN en las células tratadas de exosoma), e inmunotransferencia (Figura 2 a y B).
células DU145Kd se incubaron con diferentes concentraciones de los exosomas derivados de células DU145 durante 24 horas. células A. DU145Kd se cultivaron en cámaras de diapositivas y tratados con exosomas DU145 derivados. Las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se realizó inmunocitoquímica con anticuerpos primarios PTEN y Alexa Fluor 488 anticuerpos secundarios. Las células se visualizaron mediante microscopía confocal (IF inmunofluorescencia). DU145Kd células adquirieron PTEN (verde) después de la incubación con exosomas derivados de Du145. B. DU145Kd se cultivaron en placas de 100 mm y tratados de la misma manera que en (A) con diferentes concentraciones de exosomas DU145 derivados. Las células se lavaron con PBS, se lisaron con tampón de lisis RIPA, y se analizaron para la expresión de PTEN utilizando immunobloting. DU145Kd células adquieren la expresión de PTEN. C. Los exosomas tienen un efecto inhibidor sobre la transcripción de PTEN. DU145Kd fueron tratados con diferentes concentraciones de los exosomas derivados de células parentales DU145. El ARN total se obtiene de las células tratadas, células DU145 y DU145 con siRNA control. RT-PCR se realizó usando cebadores específicos para PTEN. GAPDH se utilizó como control. RT-PCR se realizó con un kit de RT-PCR de una etapa. Los productos se resolvieron en un gel de agarosa al 1,1%. transferencia de PTEN D. Los exosomas a U87 PTEN
- - /células. células U87 se cultivaron en cámaras de diapositivas y tratados con exosomas DU145 derivados. Las células se tiñeron con anticuerpos PTEN y Alexa Fluor 488 anticuerpos secundarios, y después se visualizaron usando un microscopio confocal (IF-inmunofluorescencia). Las células U87, que no expresan PTEN, ya que tienen mutaciones en ambos alelos PTEN, PTEN expresión adquirida (verde).
Para garantizar que el aumento de PTEN en las células DU145Kd post-incubación con derivado de DU145 exosomas no son el resultado de la estimulación de la transcripción por PTEN exosomas, se realizó RT-PCR para PTEN en las células DU145Kd tratados con diferentes concentraciones de exosomas DU145 derivados. Se observó un efecto inhibidor sobre PTEN transcripción (Figura 2C). Para garantizar aún más que estábamos observando la transferencia intercelular de la proteína PTEN, en contraposición a la estimulación de la transcripción, se utilizó la línea celular U87 glioblastoma, un genotipo nulo, que contiene una mutación en ambos alelos PTEN [33]. Cuando se trata con exosomas derivados de células DU145, células U87 dio positivo por PTEN (Figura 2D). Estos datos confirman que el PTEN adquirida en DU145Kd y U87 es el único relacionado con la transferencia intercelular de la proteína PTEN a través del intercambio de exosomas. Además, se trataron la línea celular de cáncer de próstata PC-3, que es nula PTEN, con exosomas derivados de células DU145, que muestra la adquisición de PTEN (Figura S1). Se determinó la expresión de PTEN en exosomas de distintas líneas celulares de cáncer, es decir, carcinoma de pulmón (A549), cáncer de mama (MDA-MB-231), carcinoma colorrectal (HCT116), y el adenocarcinoma de páncreas (BxPC-3) (Figura S2, A), a muestran que PTEN se expulsa a través de los exosomas de otros tipos de células cancerosas. También se trataron las células PC-3 con exosomas derivados de células de carcinoma de colon HCT116, y se encontró que la expresión de PTEN adquirida células PC-3 (Figura S2, B).
exosomas Transferencia PTEN activa entre las células cancerosas
Para evaluar si el PTEN transferida a través de los exosomas está activo, se trataron las células DU145Kd con diferentes concentraciones de los exosomas derivados de células DU145. Las células tratadas se sometieron a inmunoprecipitación de PTEN. Los inmunoprecipitados fueron evaluados para la actividad de PTEN utilizando un ensayo de lípido-fosfatasa. células DU145Kd mostraron un aumento sustancial en la actividad de la fosfatasa tras el tratamiento con exosomas derivados de células DU145 (Figura 3A).
A. células DU145Kd fueron tratados con exosomas derivados de células DU145. PTEN se inmunoprecipitó con anticuerpos PTEN, PTEN y la actividad fosfatasa se evaluó mediante los DiC8PtdIns sustrato solubles en agua (3, 4, 5) P3 (Echelon). Los fosfatos libres liberados se midieron con BIOMOL reactivo verde y normalizado contra una reacción que contenía único sustrato PIP3. Los resultados representan la media de tres experimentos ± SEM, y son significativas a P & lt; 0,01. exosomas B. PTEN-positivos (de DU145) causó una disminución en la fosforilación de AKT en las células aceptoras (DU145Kd); la fosforilación de AKT se redujo a un nivel comparable al de las células DU145 con siRNA control, y las células DU145 contraparte de los padres (los últimos dos carriles a la derecha, respectivamente). células C. DU145Kd se sembraron en placas de cultivo celular de 100 mm y se trataron con diferentes concentraciones de exosomas DU145 derivados. Las células se lisaron y se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpos D1 p27 y ciclina. PTEN induce la expresión de p27 y reduce la expresión de la ciclina D1 (C). Los dos acontecimientos dieron lugar a las células que entran en la detención del ciclo celular. La expresión se normalizó a ß-actina.
Para investigar si el PTEN transferida es competente para alterar la señalización celular en las células aceptoras, las células fueron tratadas con DU145Kd exosomas derivados de células DU145 durante 24 horas. El estado de fosforilación de fosfatidilinositol 3'-quinasa /serina-treonina quinasa (AKT), el sustrato principal para PTEN, se evaluó. En las células DU145Kd, encontramos una disminución en la fosforilación de AKT que alcanzó niveles comparables a las células DU145 parentales (PTEN positivo) y las células DU 145 transfectadas con siRNA control (Figura 3B).
Para determinar si el PTEN afecta transferido señalización celular vías aguas abajo asociados con AKT, se evaluó la expresión de ciclina-quinasa dependiente de ciclinas (CDK) inhibidor de p27 (KIP1). p27 regula la proliferación celular, la motilidad celular y la apoptosis. Una reducción en la expresión de p27 se observa en los cánceres epiteliales más letales y se asocia con resultados de los pacientes pobres [34]. pAKT regula negativamente la p27 para apoyar la actividad antiapoptótica en la progresión del cáncer. Hemos encontrado que la expresión de p27 se incrementa en las células cuando se tratan con DU145Kd exosomas derivados de DU145 (Figura 3C). Se ha informado de que la detención del ciclo celular G1 está coordinado por actividad de la fosfatasa lipídica PTEN a través de la regulación positiva de p27 y por la actividad de la proteína fosfatasa PTEN a través de la regulación a la baja de la ciclina D1 [35]. Se determinó que la ciclina D1 está regulado por disminución en las células tratadas con exosomas DU145Kd Du145, como se esperaba (Figura 3C).
PTEN transfiere a través de exosomas afecta a las funciones biológicas de las células aceptoras
Para evaluar si la bioquímica cambios observados en la Figura 3 están asociados con la modificación de la función biológica, se evaluó el efecto de los exosomas PTEN-positivos (derivado de las células DU145) sobre la proliferación de líneas celulares tres que carecen de la expresión de PTEN. DU145Kd, PC-3, y U87 células fueron tratadas con diferentes concentraciones de exosomas DU145, y las tasas de proliferación fueron inhibidos en las tres líneas celulares de una forma dependiente de la dosis (Figura 4 A, B y C). Los exosomas que carecen de expresión de PTEN, derivado de DU145Kd, mostraron poco efecto sobre las tasas de proliferación.
Tres líneas de células que carecen de expresión de PTEN, DU14Kd, PC-3, y U87 (A, B y C, respectivamente), fueron tratados con diferentes concentraciones de exosomas DU145. Un ensayo de proliferación se realizó utilizando un kit de ensayo. En las tres líneas celulares, las tasas de proliferación se inhibió de una manera dependiente de la concentración. Las tasas de proliferación de células DU145Kd alcanzaron un nivel comparable a las células DU145, que muestran que los exosomas compensadas completamente por la pérdida de PTEN (A). Los exosomas derivados de DU145Kd, que carecen de PTEN, no mostraron ningún efecto sobre la proliferación celular de las tres líneas celulares. Los resultados se muestran como la media de tres experimentos ± SEM. Las diferencias con el control (0) exosomas son significativos * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0.01, y#las diferencias no son significativas
Incorporación de PTEN en exosomas está regulada por oncogenes
Para investigar el mecanismo de incorporación de PTEN en la carga exosomal, hemos probado el papel del receptor oncogénico factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en este proceso. Hemos utilizado la línea de ovario de hámster chino (CHO), que se inmortalizó espontáneamente [36] y no tienen expresión de EGFR. células CHO transfectadas de manera estable para expresar EGFR tenían niveles similares de PTEN expresan en exosomas como las células CHO parentales (Figura 5A). Tras la estimulación de las células CHO-EGFR con diferentes concentraciones de EGF (5, 10 y 20 ng /ml), hubo un aumento en la cantidad de PTEN en exosomas, de una manera dependiente de la concentración (Figura 5B). Además, hemos probado el efecto de inhibición de EGFR en las células DU145 en PTEN incorporación en los exosomas. Se han tratado las células con el inhibidor de EGFR CI-1033 (5, 10 mM). La inhibición de EGFR disminuyó la incorporación de PTEN en exosomas de una manera dependiente de la concentración (Figura 5C).
A. Presentación de EGFR en células CHO no mostró ningún efecto sobre la expresión de PTEN en las células y los exosomas. B. La estimulación de las células CHO-EGFR con las concentraciones indicadas de EGF (5, 10 y 20 ng /ml) dio lugar a un aumento de la PTEN incorporación en exosomas. células C. DU145 se trataron con dos concentraciones (5 M, 10 mM) de CI-1033, un inhibidor irreversible de EGFR. incorporación PTEN en exosomas se inhibió de una manera dependiente de la concentración; Flotilin-1 se utilizó como control de carga para la concentración de exosomas.
Estado PTEN en pacientes de PC se puede evaluar usando sangre exosomas
Para estudiar el papel de los exosomas en la evaluación de PTEN estado en los pacientes con CP, que recogió sangre de 30 pacientes con CP antes de la prostatectomía, y 8 sujetos normales que concuerden con la edad de los pacientes (50-65 años). Los voluntarios normales no tenían antecedentes de cáncer o previamente documentada PSA sérico elevado. La sangre se fraccionó y se utilizó el plasma como fuente de exosomas. PTEN-exosomas se inmunoprecipitaron usando anticuerpos PTEN y Sepharose proteína-G. La incorporación de PTEN en exosomas de la sangre de PC pacientes se determinó por inmunotransferencia, y se detectaron diferentes niveles de expresión entre los pacientes. Curiosamente, encontramos la expresión de PTEN en exosomas de todos los pacientes de PC, y ninguna expresión de PTEN en los exosomas de la sangre de los sujetos normales (Figura 6 A, B); análisis de la prueba t mostró los resultados fueron altamente significativas P & lt; 0,001. Además, pudimos evaluar la concentración de PTEN en exosomas PC pacientes por inmunotransferencia con concentraciones estándar de PTEN recombinante, y se determinó la concentración de PTEN como (ng de PTEN /mg de proteína exosomas) (Figura 6C).
A. Los exosomas se recogieron a partir del plasma de 30 pacientes de PC pre-prostatectomía y 8 sujetos normales. Los exosomas se sometieron a análisis de inmunotransferencia estándar para el estado de PTEN. La figura muestra la capacidad de los exosomas para evaluar el estado de PTEN. Como se muestra en la figura, los sujetos sanos no tenían expresión de PTEN en sus exosomas de plasma. B. Las densidades ópticas de las bandas de PTEN (A) se evaluaron utilizando el software Cantidad-1. exosomal expresión de PTEN-PC en pacientes y sujetos normales se calculó como la media ± SEM, y las diferencias entre los dos grupos fueron muy significativas (P & lt; 0,001). concentración C. PTEN en los exosomas de la sangre del paciente PC se evaluó por inmunotransferencia concentraciones estándar de PTEN recombinante junto con las muestras de pacientes. Los resultados son el promedio de expresión de PTEN ± SEM y son estadísticamente significativas P. & Lt; 0,01
Sangre exosomal-PTEN Proporciona una herramienta sencilla para evaluar el estado de PTEN
PC tumores son heterogéneos en expresión PTEN como se ve en la (Figura 7 a, B, C). estado de PTEN en los tumores de cuatro pacientes de PC se determinó por inmunohistoquímica. La figura demuestra la dificultad de la formación de una conclusión acerca de la expresión de PTEN utilizando esta técnica. expresión PTEN en los exosomas de la sangre de los mismos pacientes se evalúa en la Figura 7D, lo que demuestra una manera simple y directa para evaluar la concentración de PTEN en pacientes de PC. Figura 7E es una micrografía electrónica de barrido que muestra la población homogénea de exosomas sanguíneos.
Esta figura proporciona un estudio comparativo de la evaluación de PTEN utilizando exosomal PTEN, y los tumores de pacientes inmunohistoquímica de PC. La inmunohistoquímica de tejidos tumorales de cuatro pacientes de PC demuestra la heterogeneidad de la expresión de PTEN en los tumores de próstata. A. Eosina & amp; tinción con hematoxilina. B. Tinción con anticuerpos secundarios. C. La tinción con anticuerpos específicos de PTEN, PTEN flechas indican las células positivas. D. Evaluación de la expresión de PTEN utilizando exosomas de plasma de los mismos pacientes. E) Una micrografía electrónica de barrido que muestra microscopio la población homogénea de exosomas recogidos de la sangre del paciente. Los exosomas se adjunta a una hoja de cubierta utilizando polilisina, y se procesaron para microscopía electrónica de barrido.
La expresión de PSA en las preparaciones de exosomas de pacientes y sujetos normales de PC
Uso de 30 pacientes con CP y 8 sujetos normales, se detectaron PSA en exosomas de ambos pacientes de PC y sujetos normales (Figura 8A): densidades ópticas de las bandas de PSA (Figura 8A) se utilizaron para el análisis estadístico. Las diferencias de PSA exosomal entre pacientes y sujetos normales de PC no fueron significativas (Figura 8B).