Extracto
Antecedentes
adenocarcinoma pancreático es una letal enfermedad con supervivencia a los 5 años de menos de 5%. 5-fluorouracilo (5-FU) es un tratamiento de primera línea principal, pero el tratamiento sólo se extiende modestamente la supervivencia y rara vez es curativo. resistencia a los medicamentos y la recurrencia de la enfermedad es típica y hay una necesidad urgente de superar esto. Para investigar la resistencia adquirida 5-FU en el adenocarcinoma de páncreas, establecimos líneas de células monoclonales chemoresistant de la línea celular Panc 03.27 por exposición a largo plazo a dosis crecientes de 5-FU.
Resultados
5 líneas celulares -FU resistente exhiben una mayor expresión de marcadores asociados con la resistencia a múltiples fármacos que explica su sensibilidad reducida a 5-FU. Además, las líneas celulares 5-FU-resistentes mostraron alteraciones típicas para una transición epitelio-mesenquimal (EMT), incluyendo la regulación al alza de los marcadores mesenquimales y el aumento de la invasividad. Microarray análisis reveló la vía L1CAM como una de las vías más upregulated en los clones quimiorresistentes, y una regulación positiva significativa de L1CAM fue visto en el nivel de ARN y proteínas. En el cáncer pancreático, la expresión de L1CAM está asociado con un fenotipo quimiorresistente y migratorias. Usando esiRNA orientación L1CAM, o mediante el bloqueo de la parte extracelular de L1CAM con anticuerpos, se muestra que el aumento de la invasividad observado en las células quimiorresistentes depende funcionalmente de L1CAM. Usando esiRNA la orientación β-catenina y /o Slug, se demuestra que en las líneas celulares chemoresistant, L1CAM expresión depende de Slug en lugar de ß-catenina.
Conclusión
Nuestros resultados establecen Slug inducida expresión L1CAM como mediador de un quimioresistente y el fenotipo migratorio en células de adenocarcinoma pancreático
Visto:. Lund K, Dembinski JL, Solberg N, Urbanucci a, Mills IG, Krauss S Regulación al alza (2015) Slug dependiente de L1CAM es responsable del aumento de potencial invasión de las células del cáncer pancreático tras tratamiento a largo plazo con 5-FU. PLoS ONE 10 (4): e0123684. doi: 10.1371 /journal.pone.0123684
Editor Académico: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos |
Recibido: 2 Octubre, 2014; Aceptado: February 2, 2015; Publicado: 10 Abril 2015
Derechos de Autor © 2015 Lund et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: datos de microarrays puede se encuentran en GEOarchive, número de acceso GSE58386. Todos los demás datos pertinentes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. KL es fundada por el Consejo de Investigación de Noruega, conceder nr. 205.783, y Affitech Investigación AS. Affitech Investigación admite como parte KL durante un doctorado industrial, junto con el Consejo de Investigación de Noruega, conceder nr. AU 205783. fue financiado por la Vida Biología Molecular (Universidad de Oslo) y Helse Sor-Ost. NS fue financiado por el Consejo Noruego de Cáncer. JLD fue financiado por el Consejo de Investigación de Noruega. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Affitech Investigación admite como parte KL durante un doctorado industrial, junto con el Consejo de Investigación de Noruega, conceder nr. 205783. Sin embargo, la investigación como Affitech no tiene intereses financieros en este trabajo. Los autores declaran que esto no altera su adhesión a las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
adenocarcinoma de páncreas es una enfermedad extremadamente mortal. El curso temprano de la enfermedad es a menudo asintomática que conduce a sólo el 8% de los casos se diagnostica en esta etapa. El pronóstico para los pacientes con adenocarcinoma en etapa tardía es sombrío, con sólo el 20% de los pacientes candidatos a recibir la cirugía (debido al diagnóstico tardío de la metástasis /tumor), dando como resultado una supervivencia a 5 años de menos del 5% [1]. Las opciones terapéuticas actuales disponibles pueden prolongar la supervivencia y aliviar los síntomas en los pacientes, pero no son curativos en la mayoría de los casos.
5-fluorouracilo (5-FU) ha sido durante mucho tiempo ha sido una forma establecida de la quimioterapia para el adenocarcinoma de páncreas, junto con la gemcitabina de drogas [2]. Sin embargo, inherente (de novo) y la resistencia adquirida son los principales obstáculos para el éxito de la quimioterapia con 5-FU basado en el adenocarcinoma de páncreas y otros tumores [3]. Adquirido resistencia a los medicamentos, que se desarrolla durante el tratamiento, que a menudo se manifiesta por mecanismo a prueba varios y por lo tanto es difícil de revertir terapéuticamente.
5-FU disminuye la biosíntesis de nucleótidos de pirimidina mediante la inhibición de la timidilato sintasa (TS), una enzima que cataliza la etapa limitante de la velocidad en la síntesis de ADN [4]. Aunque los mecanismos de resistencia a 5-FU aún no está claro, varios informes han vinculado quimiorresistencia en diversas líneas celulares de tumores sólidos epitelial-a-mesenquimal transición (EMT) [5-8]. EMT es un proceso embriológico fundamental que se caracteriza por alteraciones en la morfología, la arquitectura celular, la señalización y la adhesión que conducen a un fenotipo migratorio [9]. Cuando EMT se produce en las células tumorales, estas células pierden sus características epiteliales y adquieren un fenotipo más invasivas y migratorias que conduce a potencial metastásico aumentada. Los marcadores moleculares para la EMT incluyen el aumento de la expresión de vimentina y N-cadherina y el aumento de la expresión de factores de transcripción que reprimen la expresión de E-cadherina, incluyendo Twist, caracol, y la babosa [10].
La molécula de adhesión celular L1 (L1CAM ) es una glicoproteína transmembrana altamente conservadas de la superfamilia de las inmunoglobulinas que se identificó primero a desempeñar un papel en el desarrollo y la regeneración de tejido neuronal [11]. expresión L1CAM se ha observado en una serie de líneas celulares de cáncer y tejidos, y la expresión de alto L1CAM se asocia a menudo con un mal pronóstico y los tiempos de supervivencia cortos [12]. L1CAM se ha relacionado con EMT en varios tipos de cáncer diferentes, incluyendo cáncer de páncreas [13-18]. En particular, L1CAM se ha asociado con un fenotipo quimiorresistente y migratoria en el adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC) [19-21]. Para investigar los mecanismos implicados en la adquisición de resistencia a 5-FU, establecimos clones 5-FU-resistentes de la línea celular de adenocarcinoma de páncreas Panc 03.27, y se somete a las líneas celulares de pruebas funcionales y análisis de microarrays. Las células Panc chemoresistant 03.27 experimentaron cambios fenotípicos consistentes con un EMT, y la expresión de marcadores relacionados con la EMT, en particular L1CAM, aumentaron considerablemente. desmontables estudios mostraron que la expresión L1CAM en los clones 5-FU-resistentes era dependiente de la Slug factor de transcripción, pero no en β-catenina, y desmontables de L1CAM confirmó un vínculo funcional entre L1CAM y el potencial proliferativo e invasivo de la quimiorresistente Panc 03,27 clones. desmontables estudios mostraron además que L1CAM moderadamente protegida células B1V chemoresistant de la apoptosis inducida por 5-FU. Nuestros resultados proporcionan una mayor comprensión de los mecanismos moleculares que conducen a un quimioresistente y el fenotipo migratorio en las células de cáncer de páncreas y ponen de relieve la importancia de abordar la expresión inducida por L1CAM Slug en PDAC recurrente.
Resultados
Desarrollo de clones 5-FU-resistentes
Panc 03.27 líneas celulares de 5-FU-resistentes fueron generados por la exposición continua de las células tumorales a 5-FU durante un período de 6 meses, a partir de 0,5 g /ml y 5-FU aumentado a 1 g /ml en el tiempo. Para verificar la quimiorresistencia dependiente de la dosis de los clones obtenidos, una curva de dosis se llevó a cabo a un rango de 5-FU concentraciones (0,5 a 10 g /ml) durante un período de 6 días. Como era de esperar, los clones que se habían criado sin selección de 5-FU (llamado Nt y NW) fueron sensibles a todas las concentraciones de 5-FU. En los clones quimiorresistentes B1Q y B1V crecimiento normal se observó con dosis de hasta 1 g /ml 5-FU, mientras que las concentraciones más altas de 5-FU (5 a 10 mg /ml) inhibió el crecimiento todavía
(Fig 1A)
.
(A) El sensible a la quimioterapia (N, NW) y resistentes (B1Q y B1V) líneas celulares fueron tratados con 0-10 g /ml 5-FU) durante 6 días. gráfica muestra el crecimiento frente a días de exposición. (B) Transferencia Western que muestra los niveles de la timidilato sintasa (TS) en el las líneas celulares chemoresistant sensible a la quimioterapia y. (C) los niveles de ARN (cantidad relativa) de ABCB1 (MDR1) y ABCC5 como medidos por RT-PCR. (D) Transferencia Western que muestra los niveles de survivina en el las líneas celulares chemoresistant sensible a la quimioterapia y. Las barras de error representan la desviación estándar. diferencia estadísticamente significativa entre el sensible a la quimioterapia y los clones chemoresistant (P & lt; 0,05) se indica mediante *
clones 5-FU-resistentes presentan mecanismos de resistencia
tiene una sensibilidad de 5-FU. se ha demostrado que estar inversamente relacionada con el nivel de proteína de la timidina sintasa (TS) en las células cancerosas y los tumores 5-FU-resistentes comúnmente expresan altos niveles de la proteína TS [22,23]. Alta expresión de TS en tejido de cáncer es un indicador de mal pronóstico para la quimioterapia basada en 5-FU en pacientes con cáncer de colon [24]. El nivel de proteína de TS se analizó en los cuatro clones. TS se incrementó drásticamente en los clones B1Q y B1V quimioresistente, como se muestra mediante análisis de transferencia Western
(Figura 1B)
. El uso de TaqMan RT-PCR, se analizaron a continuación los niveles de ARN de bombas de eflujo asociados con 5-FU y la resistencia a múltiples fármacos [25,26]. Se observó un aumento estadísticamente relevante en la expresión del flujo de salida de las bombas de ABCB1 (MDR1) y ABCC5 (MRP5) en los clones chemoresistant en comparación con los clones sensibles a la quimioterapia
(Figura 1C). México La nivel de survivina fue también en gran medida aumentado en los clones quimiorresistentes tal como se evaluó mediante transferencia Western
(Fig 1D).
survivina es un inhibidor de la apoptosis expresado en la fase G2 /M del ciclo celular y la sobreexpresión de survivina está vinculada a la resistencia a los estímulos apoptóticos inducidos por los fármacos quimioterapéuticos [27,28].
clones 5-FU-resistentes muestran cambios morfológicos que se asocian con la EMT
Cuando la morfología de los clones 5-FU-resistentes se comparó con la clones sensibles, el ex muestran un fenotipo más mesenquimales-como, con la dispersión celular y aumento de la formación de pseudópodos, mientras que los clones sensibles muestran una morfología epitelial apretada
(figura 2A)
. Las células 5-FU-resistentes parecían más grandes y más extendido que las células sensibles. El fenotipo mesenquimal similar, que se mantuvo durante más de 30 pasajes, está en línea con las observaciones anteriores de la quimio-resistencia inducida por la droga en líneas celulares [29,30].
(A) fotos de contraste de fase que muestra la morfología celular de normal (Nw, Nt) y los clones chemoresistant (B1Q, B1V), 40x. (B-D) los niveles de ARN (cantidad relativa) de la vimentina, E-cadherina, y N-cadherina, tal como se mide por RT-PCR. Las barras de error representan la desviación estándar. Diferencia estadísticamente significativa entre el sensible a la quimioterapia y los clones quimiorresistentes (P & lt; 0,05) se indica por *. (E-G) Western blot y immunostain que muestra los niveles de vimentina, E-cadherina, y N-cadherina, en el sensible a la quimioterapia (N, NW) y las líneas celulares quimioresistente (B1Q, B1V). (H) Inmunotinción y (I) de transferencia de Western que muestra los niveles de CD19 en la las líneas celulares sensible a la quimioterapia y quimiorresistentes. (J) gráfica que presenta los resultados de ensayos de invasión 24 horas realizados en los clones, con imágenes de contraste de fase (20x) que muestra áreas representativas de la invasión de células teñidas con la tinción de cristal violeta (K). El ensayo se realizó tres veces. diferencia estadísticamente significativa entre el sensible a la quimioterapia y los clones chemoresistant (P & lt; 0,05) se indica mediante *
características importantes de la EMT son una regulación a la baja del marcador epitelial E-cadherina acompañada de una regulación al alza de la N. -cadherin y vimentina [9]. Por consiguiente, los clones quimiorresistentes mostraron un aumento en la vimentina
(Fig 2B y 2E)
y N-cadherina
(Fig 2D y 2G)
en proteínas y los niveles de ARN, y una regulación por disminución de E -cadherin
(Fig 2C y 2F).
citoqueratina 19 (CK19) es un filamento intermedio que es en parte responsable de la integridad estructural de las células. Diversas modificaciones del citoesqueleto dentro de una célula se asocian con la transformación maligna, y una pérdida de CK19 se ha asociado con EMT [31] y la resistencia a múltiples fármacos [32]. Cuando se analizaron los Nt, NW, B1Q y B1V clones para la expresión de CK19 por inmunocitoquímica y Western blot, se observó una reducción masiva de CK19 en los clones quimiorresistentes en comparación con los clones sensibles 5-FU
(Fig 2H y 2I).
Para evaluar si la morfología modificada que se observó en los clones chemoresistant era funcionalmente importantes, hemos examinado las propiedades invasivas de los clones usando un ensayo de invasión de matrigel
(figura 2J y 2K).
chemoresistant clones B1Q y B1V eran de 4 a 6 veces más invasivo que los dos clones sensibles a la quimioterapia Nt y NW.
L1CAM está regulada positivamente en las células 5-FU-resistentes
con el fin de establecer una más exhaustiva perfil molecular entre las líneas celulares sensibles y no sensibles, se realizó el análisis de microarrays incluyendo el B1V línea celular resistente a 5-FU y el clon sensible a la quimioterapia Nt. 607 genes fueron considerados cuando se presentaban con el cambio log2 & gt; 1
(S1 figura)
. Se encontraron 319 genes que se upregulated y 288 genes fueron regulados a la baja al menos 2 veces en comparación con B1V Nt (P & lt; 0,05)
(Tablas S1 y S2, respectivamente)
. Gene Ontología análisis de los 319 genes regulados positivamente reveló que la vía de la interacción L1CAM fue una de las vías más aumentada en los clones chemosresistant, junto con citoquinas y las respuestas inflamatorias
(Figura 3A)
. sí L1CAM se upregulated 4 veces en las células B1V comparación con las células NT. También se encontraron sellos distintivos de la señalización de Wnt y pluripotencia, la apoptosis, la actividad del transportador de la serotonina, el transporte de monoaminas y el metabolismo del glucógeno que se upregulated en la línea celular B1V quimioresistente
(Figura 3A y en la Tabla S1).
análisis (a) de ontología de genes de 319 genes regulados positivamente en el clon B1V en comparación con el clon Nt de la línea celular Panc 03.27. los niveles de (B) de ARN (cantidad relativa) de L1CAM en el sensible a la quimioterapia (Nt, NW) y el quimiorresistente (B1Q, B1V) líneas de células, tal como se mide por RT-PCR. Las barras de error representan la desviación estándar. Diferencia estadísticamente significativa entre el sensible a la quimioterapia y los clones quimiorresistentes (P & lt; 0,05) se indica por *. (C) de transferencia de Western que muestra los niveles de L1CAM en todas las líneas celulares. (D) Análisis de citometría de flujo usando anticuerpo anti-PE L1CAM en todas las líneas celulares. Las células no teñidas se muestran en las células grises y anticuerpos teñidos se muestran en negro. (E) Inmunotinción de L1CAM. Aumento de la localización de la membrana de L1CAM se puede ver en la de las líneas quimiorresistentes (B1Q, B1V). Las imágenes se tomaron con un aumento de 40x
El aumento de L1CAM en los clones chemoresistant fue confirmada por PCR en tiempo real (P & lt; 0,05). Y Western blot (
Figura 3B y 3C, respectivamente )
. Además, el análisis de citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-L1CAM conjugado con PE mostró enriquecimiento de células L1CAM positivos en la célula B1Q y B1V líneas
(Fig 3D)
. En apoyo de esta observación, inmunohistoquímica reveló una expresión distinta L1CAM en la membrana de la B1Q clones y B1V quimioresistente pero no en las células sensibles a la quimioterapia NT y NW El
(Figura 3E).
Una proporción de las células chemoresistant también exhibidos inmunoreactividad L1CAM nuclear.
L1CAM está implicada en la proliferación y la invasividad de los clones 5-FU-resistentes, y moderadamente protege las células chemoresistant de la apoptosis inducida por 5-FU
EMT se ha asociado con un aumento de la invasividad de las células tumorales [33], y los informes publicados previamente mostró que L1CAM desencadena la migración celular y la invasión en varios tipos de tumores [15,18,34]. Para investigar si la regulación al alza de L1CAM está implicado en el aumento del potencial de invasión de las células chemoresistant, la expresión de L1CAM fue derribado usando esiRNA. esiRNA se piscinas siRNA compuestos por una mezcla heterogénea de siRNAs que todos se dirigen a la misma secuencia de ARNm endorribonucleasa-preparado. tratamiento esiRNA redujo drásticamente el nivel de proteína de L1CAM en la célula quimiorresistente líneas B1Q y B1V
(Fig 4A)
, en comparación con las células transfectadas con el control esiRNA (orientación EGFP). Cuando se ensayó la capacidad de invasión en una cámara de invasión de Matrigel el número de células invasoras después de L1CAM caída fue significativamente menor en comparación con el control negativo después de 24 h invasión
(Fig 4B).
A fin de evaluar la relación entre la invasividad de la clones quimiorresistentes y expresión L1CAM, las células se trataron con un anticuerpo dirigido la parte extracelular de L1CAM (clon UJ127.11), o un anticuerpo de control de isotipo de ratón, antes de un experimento ensayo de invasión (tiempos de ensayo de invasión se aumentaron a 48 horas). Nuestros resultados muestran que el tratamiento de células B1Q y B1V con el anticuerpo L1CAM redujeron significativamente su capacidad de invasión en comparación con el tratamiento con el anticuerpo de control. Por el contrario, el tratamiento de células NT y Nw chemosensitive con anticuerpo L1CAM no tuvo efecto sobre la invasividad
(Fig 4C).
(a) el control de transferencia de Western que muestra los niveles de L1CAM después de la transfección con la orientación esiRNA L1CAM o controlar esiRNA, como se describe en
Materiales y métodos
. La actina se usa como control de carga. (B) Gráfico que muestra el número de células invasoras (24 h ensayos de invasión) después de la transfección con esiRNA focalización L1CAM o controlar esiRNA. Los experimentos se realizaron dos veces con resultados similares. Los resultados representativos se muestran. (C) Gráfico que muestra el número de células invasoras (48 h) ensayos de invasión de las células tratadas con 2 g /ml anti-L1CAM anticuerpo (clon UJ127.11) o anticuerpo de isotipo de control para 1 h a temperatura ambiente antes de que se añadieron a la invasión placa de ensayo. (D) las curvas de crecimiento Incucyte (96 horas) de todas las líneas celulares después de la transfección con esiRNA orientación L1CAM o controlar esiRNA. El experimento se realizó por triplicado. (E) La línea celular sensible a la quimioterapia Nt y la línea celular quimioresistente B1V (F) fueron tratados con 1 ug /ml de 5-FU durante 72 horas después de la transfección con esiRNA focalización L1CAM o control, y se realizaron ensayos de citometría de flujo de Anexina V. Cada ensayo se repitió dos veces con resultados similares. Porcentaje en los gráficos muestra células anexina V-positivo.
La sobreexpresión de L1CAM se ha demostrado para promover la proliferación de células tumorales, y en consecuencia, la inhibición de la expresión o función L1CAM puede suprimir la proliferación [35-37]. Para investigar si desmontables de L1CAM tuvo una influencia sobre el crecimiento celular en las células quimiorresistentes, se realizó
in vitro
ensayos de proliferación en. Todas las líneas celulares se sometieron a L1CAM y controlar el tratamiento esiRNA, y la confluencia porcentaje se midió con el tiempo por un lector automatizado IncuCyte
(Figura 4D)
. Las mediciones comenzaron 24 horas después de la transfección esiRNA. Hemos observado anteriormente que el efecto de esiRNA caída en el nivel de proteína disminuye gradualmente después de 72 horas (resultados no mostrados), pero para obtener una curva de crecimiento adecuado de los experimentos se llevaron a cabo durante al menos 96 horas después de la transfección. Las curvas de crecimiento no mostraron ningún efecto del tratamiento esiRNA orientación L1CAM en las líneas de células sensibles a la quimioterapia Nt y NW. Sin embargo, las líneas celulares quimiorresistentes B1Q y B1V visualizan redujeron significativamente el crecimiento siguiente L1CAM desmontables
(Fig 4D)
demostrando que la expresión L1CAM está involucrado en la proliferación celular de las células quimiorresistentes.
Cuando el anti- L1CAM anticuerpo que inhibió la invasión de las células chemoresistant esta en
in vitro
en ensayos de proliferación, no pudimos ver ninguna diferencia en la confluencia celular porcentual entre las células tratadas con el anticuerpo en comparación con las células tratadas con el anticuerpo de control. Esto se realizó en las cuatro líneas celulares.
L1CAM se ha demostrado que desempeñan un papel en la mediación de la quimiorresistencia contra gemcitabina y etopósido en líneas celulares PDAC [38]. Para evaluar si la L1CAM estaba implicado en la mediación de la resistencia a 5-FU en las líneas de células Panc 03.27 quimiorresistentes, ensayos de citometría de flujo de Anexina V se llevaron a cabo en Nt y células B1V 72 horas después las células se trataron con L1CAM o controlar esiRNA en presencia y ausencia de 1 mg /ml 5-FU. Como era de esperar, las células Nt tratados con un control esiRNA mostraron un cambio significativo hacia las células positivas anexina V después de haber sido expuesto a 5-FU (de 0,87% a 18,32%). Por el contrario, se trata de control de células B1V solamente mostraron un ligero aumento (de 1,19% a 2,22%) en las células con anexina V positivas en respuesta al tratamiento 5-FU
(Fig 4E y 4F)
. Desmontables de L1CAM no alteró significativamente las tasas de apoptosis en la línea celular sensible a la quimioterapia Nt, ya sea en presencia o en ausencia de tratamiento con 5-FU en comparación con el ctrl desmontables
(Figura 4E)
. Sin embargo, desmontables de L1CAM aumentó células positivas porcentaje anexina V, tanto con o sin tratamiento con 5-FU. Por lo tanto, L1CAM parece proteger a las células moderadamente B1V chemoresistant de la apoptosis en ausencia de 5-FU, y más aún en la presencia de 5-FU
(figura 4F).
transcripcional regulación de L1CAM depende de Slug, pero no en β-catenina
los estudios previos han implicado tanto Slug y β-catenina en la regulación transcripcional de L1CAM [14,39-41]. Slug es un factor de transcripción que está involucrado en EMT y la invasión en el cáncer de páncreas [34,42]. L1CAM se considera que es un objetivo de β-catenina, el mediador clave de la señalización de Wnt canónica con un papel en la regulación de la proliferación contextual, entre los puntos de decisión 'stemness' y la diferenciación, el metabolismo celular y EMT [39,43]. Dado que el análisis de microarrays reveló una regulación al alza de los componentes que pueden contribuir a la señalización de Wnt canónica en las células chemoresistant
(Figura 3A)
, los niveles de β-catenina en las líneas de células sensibles a la quimioterapia y chemoresistant fueron investigados. Los niveles de ARN de β-catenina se incrementaron significativamente (P & lt; 0,05) en los clones chemoresistant
(Figura 5A)
, sino en la micromatriz el aumento fue menos de dos veces y por lo tanto no aparece en la lista de los genes que eran más de dos veces aumentada en el microarray
(S1 Tabla)
. transferencias de Western no muestran ninguna diferencia en los niveles de proteína total β-catenina entre el sensible a la quimioterapia y las células quimiorresistentes, ni en el citoplasma ni en el núcleo.
(Figura 5A)
. los niveles de β-catenina activa, tal como se mide por un anticuerpo de detección única proteína activa (no fosforilado), no se han cambiado o bien (resultados no mostrados).
(A) los niveles de ARN (cantidad relativa, RT-PCR) y el oeste blot que muestra los niveles de proteína de β-catenina en el sensible a la quimioterapia (N, NW) y el quimioresistente líneas (B1Q, B1V) de células. niveles (B) de ARN (cantidad relativa, RT-PCR) y Western Blot que muestra los niveles de proteína de Slug en la sensible a la quimioterapia (N, NW) y el quimioresistente (B1Q, B1V) líneas celulares. Los niveles de proteína de Slug en la transferencia Western se cuantificaron utilizando Image Studio Lite (versión 3.1.4) (normalizado contra los controles de carga). (C) Niveles de L1CAM siguientes transfección con esiRNA la orientación β-catenina o controlar esiRNA. (D) Los niveles de L1CAM siguientes transfección con esiRNA focalización Slug o controlar esiRNA. La cuantificación de las intensidades de banda se puede ver en los paneles inferiores en (C) y (D). (E) Gráfico que muestra el número de células invasoras (24 h ensayos de invasión) después de la transfección con esiRNA orientación Slug o controlar esiRNA, en combinación con 2 g /ml anti-L1CAM anticuerpo (UJ127.11) o anticuerpo de isotipo de control para 1 h en la sala temperatura. Los experimentos se realizaron dos veces con resultados similares. Los resultados representativos se muestran. La actina se usa como control de carga en todas las transferencias de Western. Las barras de error en las gráficas de RT-PCR representan la desviación estándar. diferencias estadísticamente significativas (P & lt; 0,05) entre el sensible a la quimioterapia y los clones chemoresistant se indican con *
Slug no mostró alteraciones en el microarray, que también fue confirmada por RT-PCR
. (figura 5B)
. Sin embargo, un análisis de transferencia Western mostró una clara regulación por incremento de los niveles de proteína SLUG en las dos líneas celulares en comparación quimiorresistentes a la célula sensible a la quimioterapia líneas
(Fig 5B).
A probar el impacto de β-catenina y Slug en la expresión de L1CAM, tanto β-catenina y Slug fueron blanco de esiRNA. Desmontables de Slug, pero no β-catenina, conducen a una disminución en los niveles de proteína L1CAM
(Figura 5C y 5D).
Cuando Slug y β-catenina se derribaron simultáneamente en las células chemoresistant, no se redujo más se observó los niveles de L1CAM (resultados no mostrados)
Cuando se ensayó la capacidad invasora después desmontables células, B1Q y B1V Slug mostradas reducida capacidad de invasión en comparación con las células control esiRNA (24 h invasión;
figura 5E). , España de una manera similar a lo visto con desmontables de L1CAM
(Fig 4B).
pretratamiento con anticuerpo L1CAM además de Slug caída no redujo aún más la capacidad invasiva de las líneas de quimiorresistentes
(Fig 5E).
Aunque la adquisición de 5-FU-resistencia inducida una multitud de cambios en las células Panc 03.27 páncreas adenocarcinoma, identificamos L1CAM y su regulación a través de Slug como un importante mediador de un fenotipo invasivo y quimiorresistencia adquirida, y como una posible diana terapéutica.
Discusión
5-FU fue el tratamiento sistémico de elección para el cáncer de páncreas avanzado durante muchos años, pero en los últimos años 90, se demostró que el fármaco fue gemcitabina superior a 5-FU en el control de los síntomas relacionados con la enfermedad [44]. Sin embargo, el 5-FU sigue siendo una opción de tratamiento recomendado para el cáncer de páncreas hoy [45], y varios estudios recientes han demostrado un papel valioso para el 5-FU en los protocolos de tratamiento combinado en comparación con la quimioterapia sola gemcitabina [46,47].
resistencia a los fármacos quimioterapéuticos es una causa importante de fracaso del tratamiento y de mal pronóstico en el cáncer de páncreas. En este estudio hemos demostrado que la línea celular de cáncer de páncreas Panc 03,27 sometido a exposición a largo plazo a 5-FU desarrolló resistencia y adquirió características moleculares prototípicos incluyendo la regulación positiva de la timidilato sintasa, survivin, y las bombas de infusión. Además, hemos demostrado que las células chemoresistant se hizo más cambios mesenquimales-como y se sometió relacionados EMT, incluyendo la pérdida de marcadores epiteliales (E-cadherina y CK19) y una mayor expresión de la vimentina marcadores mesenquimales y N-cadherina, y el factor de Slug transcripcional . Hemos demostrado una regulación al alza de L1CAM en las células 5-FU-resistentes, lo que concuerda con los hallazgos previos que apoyan la hipótesis de que L1CAM está regulada positivamente por las células cancerosas como parte del proceso de EMT [13-18]. Estábamos más capaces de vincular L1CAM al proceso de EMT por lo que demuestra que el aumento de la invasividad de las células quimiorresistentes dependía de L1CAM, y que la expresión de L1CAM dependía de Slug. En consonancia con esta observación, Gavert
et al
. mostró que la estimulación de células epiteliales ductales pancreáticas con TGF-β1 condujo a la adquisición de una morfología de las células en forma de huso y la regulación al alza de las proteínas mesenquimales y la expresión L1CAM, que era dependiente de la activación de JNK mediada de Slug [40].
En la línea celular de carcinoma de mama MCF7, la regulación positiva de L1CAM se ha demostrado que conducen a la interrupción de uniones adherentes que contienen e-cadherina y con ello a una mayor actividad transcripcional de β-catenina [48]. La activación de β-catenina contribuyó a la expresión L1CAM sostenido y mejorado la motilidad celular [48], que está en línea con otra evidencia que demuestra que L1CAM es un objetivo de la β-catenina de señalización [39]. Sin embargo, nuestros resultados no muestran expresión de la proteína alterada o localización de β-catenina en las células quimiorresistentes, y más importante, desmontables de β-catenina no redujo los niveles de L1CAM, lo que indica que la expresión de L1CAM no estaba regulada por β-catenina en estos Células. Nuestros resultados son, pues, de acuerdo con los hallazgos de Pfeifer
et al
. mostrando en el carcinoma endometrial que Slug, y no β-catenina, es responsable de la regulación positiva de L1CAM [41].
La sobreexpresión de L1CAM se ha demostrado para promover la proliferación de células tumorales, y la inhibición de la expresión o función L1CAM puede suprimir la proliferación [35-37]. Desmontables de L1CAM reduce la proliferación en el quimioresistente Panc 03.27 celular líneas
(Figura 4D)
. Esta reducción en el crecimiento no se observó en las líneas de células sensibles a la quimioterapia que no expresan L1CAM. Nuestros resultados apuntan hacia un papel específico para L1CAM en la proliferación de células de cáncer de páncreas 5-FU-resistentes. Se necesitan más estudios para comprender el efecto de L1CAM sobre la proliferación, sin embargo, otros informes apuntan hacia un enlace a la ERK1 /2 y Akt-los caminos, que ambos son conocidos para acelerar la proliferación y el crecimiento de las células tumorales [35,37,49 , 50]. Además, la proliferación reducida visto para los clones quimiorresistentes siguientes knockdown L1CAM en la figura 4D puede ser en parte el resultado de la ligero aumento de la apoptosis se observa en la figura 4F, siguiendo knockdown L1CAM
.
Curiosamente, el aumento de la invasividad representada por nuestro clones quimiorresistentes se redujo cuando L1CAM fue derribado, o cuando la parte extracelular de L1CAM se bloqueó con un anticuerpo. Aumento de la capacidad de invasión a través de la regulación positiva de L1CAM es posiblemente una de las muchas regulaciones aguas abajo de Slug después de la inducción de la EMT.
Hay algunos informes contradictorios sobre el papel L1CAM desempeña en el proceso de la EMT. Por ejemplo, Gavert
et al
. recientemente mostró que L1CAM metástasis mediada por las células de cáncer de colon era prescindible para la inducción de la EMT y una expresión alterada de células epiteliales y mesenquimales marcadores de proteínas [51]. Se requieren más estudios para elaborar si la regulación positiva de L1CAM es parte de la EMT o incluso el caso de la inducción. L1CAM podría no ser una misma EMT-mediador, pero parece estar regulada por Slug inducida por EMT, y una vez expresado que parece conducir a la invasión.
L1CAM ha demostrado estar involucrados en la mediación de la quimio-resistencia contra la gemcitabina y etopósido en líneas celulares PDAC [38]. Hemos investigado si la caída de L1CAM reduce la resistencia adquirida a 5-FU se muestra por la línea celular B1V. En nuestras manos, L1CAM parece proteger moderadamente células de la apoptosis en ausencia de 5-FU, y más aún en la presencia de 5-FU.
se planean más estudios para investigar si el tratamiento con anticuerpos anti-L1CAM reducirá el crecimiento o la metástasis de nuestras líneas celulares de cáncer pancreático 5-FU-resistentes
in vivo
. El hallazgo de que las células de cáncer pancreático con resistencia adquirida a 5-FU muestran el aumento de expresión de L1CAM, además de la distinción de la presencia L1CAM en canceroso vs. tejidos normales [52], nos hace la esperanza de que la orientación de L1CAM con anticuerpos terapéuticos y /o follows;
ABCB1-Hs00184500_m1
ABCC5-Hs00981087_m1
CTNNB1-Hs00355049_m1
GAPDH-Hs02758991_g1
Vimentin-Hs00185584_m1
CDH1/Ecadherin-Hs01023894_m1
CDH2/Ncadherin-