Extracto
cuadro de la proteína Forkhead O1 (FoxO1), un miembro clave de la familia de factores de transcripción FOXO, actúa como un supresor de tumores y se ha asociado con varias funciones celulares clave, incluyendo el crecimiento celular, la diferenciación, apoptosis y la angiogénesis. Por lo tanto, es incomprensible por qué la expresión de proteínas FOXO está regulado por disminución en las células cancerosas. Los microARN, no codificante 20~22 de nucleótidos de ARN de cadena simple, como resultado de la represión o la degradación de traslación y silenciamiento de los genes de sus genes diana, y contribuye significativamente a la regulación de la expresión génica. En el presente estudio, mostramos que la expresión de miR-370 fue significativamente upregulated en líneas celulares de cáncer de próstata y cinco, en comparación con las células epiteliales normales de la próstata (PrEC). La expresión ectópica de la proliferación inducida por miR-370 y un aumento de la capacidad de crecimiento y la formación de colonias independiente del anclaje de células de cáncer de próstata DU145 y LNCaP, mientras que la inhibición de miR-370 proliferación reducida, el crecimiento y la formación de colonia capacidad independiente de anclaje. Por otra parte, la regulación positiva de miR-370 promovió la entrada de las células de cáncer de próstata DU145 y LNCaP en la transición S ciclo G1 /célula, que se asoció con la regulación a la baja de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) inhibidores,
p27
Kip1 Opiniones y
p21
Cip1
, y la regulación al alza del regulador del ciclo celular ciclina D1 mRNA. Además, hemos demostrado que el miR-370 se puede regular a la baja expresión de FoxO1 atacando directamente a la
FoxO1
región 3 'no traducida. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que el miR-370 juega un papel importante en la proliferación de células de cáncer de próstata humano, suprimiendo directamente el FoxO1 supresor de tumores
Visto:. Wu Z, Sun H, Zeng W, Él J , Mao X (2012) Regulación al alza de MircoRNA-370 induce la proliferación de células de cáncer de próstata humano mediante la regulación negativa del factor de transcripción FoxO1. PLoS ONE 7 (9): e45825. doi: 10.1371 /journal.pone.0045825
Editor: Jindan Yu, de la Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 24 de mayo de 2012; Aceptado: August 24, 2012; Publicado: 18 Septiembre 2012
Copyright: © Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Weixia Zeng es empleado de una empresa comercial Laura Biotech Co., Ltd. Esta no altera nuestra adhesión a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales. Los otros autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
El cáncer de próstata es la segunda neoplasia común en los hombres, con más de 0,78 millones de nuevos casos cada año en todo el mundo [1]. Aproximadamente 190.000 hombres son diagnosticados con cáncer de próstata y más de 27,360 pacientes con cáncer de próstata mueren cada año en los EE.UU. [2]. El cáncer de próstata representa un importante problema de salud pública y se asocia con importantes costes sanitarios. antígeno de detección (PSA) prostático específico en suero es útil para el diagnóstico precoz del cáncer de próstata; Sin embargo, la prueba de PSA tiene muchas deficiencias, por ejemplo, los niveles de PSA son a menudo elevados en los hombres que sufren inflamación de la próstata benigna. Las estrategias de tratamiento actualmente disponibles para el cáncer de próstata, incluyendo la castración quirúrgica y la quimioterapia, son generalmente infructuosos [3]. Es bien conocido que las lesiones de cáncer de próstata son heterogéneos y a menudo responden bien a la terapia de privación de andrógenos inicial (ADT) [4]. En la actualidad, la mayoría de los pacientes con cáncer de próstata eligieron una hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) agonista /antagonista en lugar de la castración quirúrgica, y ADT se aplica principalmente como terapia sistémica en pacientes con metástasis. Sin embargo, muchos pacientes de cáncer de próstata finalmente experimentan recurrencia y andrógenos independencia, que conduce a la progresión de la enfermedad acelerada y la muerte [4], [5]. Por lo tanto, necesitan nuevos objetivos para estrategias de tratamiento del cáncer de próstata eficaces urgentemente ser identificado
.
Aunque tanto los factores genéticos y ambientales se considera que son los principales factores, los mecanismos moleculares del desarrollo del cáncer de próstata y la progresión siguen siendo en gran medida desconocido. Los tumores malignos se caracterizan por una actividad desregulada en las vías de regulación que controlan la proliferación y /o apoptosis. La capacidad de inhibir uno o más objetivos clave dentro de estas vías de señalización puede proporcionar los nuevos avances en el tratamiento del cáncer. Varias vías de regulación, tales como el receptor de andrógenos (AR) y la vía de señalización Akt /proteína quinasa B (PKB) vía de señalización desempeñan un papel clave en la regulación de la apoptosis y la proliferación en células de cáncer de próstata 6-10. Por lo tanto, es de suma importancia para entender estas vías, como el descubrimiento de los reguladores clave no sólo puede generar información de pronóstico preciso, pero también puede proporcionar nuevas estrategias de tratamiento para el cáncer de próstata.
La Akt /PKB vía promueve la supervivencia celular mediante la regulación de una serie de factores de transcripción, incluyendo el factor de transcripción forkhead superfamilia [11], tal como caja forkhead proteínas O1 (FoxO1, también conocida como la cabeza tenedor en rabdomiosarcomas [FKHR]), FoxO3a (FKHRL1), foxo4 (AFX) y FoxO6 . Desde el aislamiento del gen forkhead en
Drosophila melanogaster
, más de 100 factores de transcripción forkhead estructuralmente relacionados se han identificado [12]. Los miembros de la subfamilia FOXO son activadores de la transcripción conservadas evolutivamente, caracterizadas por un dominio forkhead altamente conservada que contiene una unión a ADN motivo [13]. FoxO1 fue identificado durante el estudio de la t (2,13) (q35; q14) y t (1,13) (p36; q14) translocaciones cromosómicas, que se encuentran comúnmente en rabdomiosarcoma alveolar, un tumor del músculo esquelético frecuente en niños [ ,,,0],14]. proteínas FOXO desempeñan un papel central en una variedad de procesos biológicos, incluyendo la apoptosis, el ciclo celular, la diferenciación, las respuestas de estrés, daño en el DNA de reparación y metabolismo de la glucosa [15]. La activación de los miembros de la subfamilia FOXO puede regular al alza la inhibidores del ciclo celular p21
Cip1 y p27
Kip1, y regular a la baja la ciclina regulador del ciclo celular D1 /2, en consecuencia, conduce a G1 /detención del ciclo celular S [16] - [ ,,,0],18]. Por lo tanto, los factores de transcripción son FOXO supresores tumorales clave. La creciente evidencia sugiere que la activación de la FOXO1 induce la apoptosis en células de cáncer de próstata [18] - [23]. Brunet et al. indicó que, mediante la interacción con las proteínas 14-3-3 chaperón, la fosforilación puede inducir la translocación nuclear de los factores de transcripción FOXO [13]. Sin embargo, las razones por las FOXO es downregulated en las células cancerosas están pobremente caracterizados. Por lo tanto, la hipótesis de que un mecanismo alternativo puede regular la expresión de proteínas en células de cáncer FOXO.
Los microARN (miRNA) son una clase de los pequeños no codificantes, ARN de cadena simple que puede regular negativamente la expresión génica en el puesto nivel -transcriptional, principalmente mediante la unión a la región no traducida 3 '(UTR) de sus ARNm diana [24] - [26]. Numerosos estudios han demostrado que la expresión aberrante de miRNAs está estrechamente asociada con la proliferación, invasión, metástasis y el pronóstico de varios cánceres, incluyendo el cáncer de próstata, cáncer de mama, glioma y cáncer de pulmón [27] - [30]. La expresión aberrante de los resultados de miRNAs en los cambios de expresión de genes, las modificaciones epigenéticas y la abundancia de la enzima alterada miARN-procesamiento de Dicer. la progresión del cáncer de próstata está asociada con la expresión alterada de varios oncogenes y supresores de tumor, y miRNAs potencialmente pueden regular estos genes; sin embargo, la relación entre miRNAs y el cáncer de próstata sólo ha empezado a ser dilucidado en los últimos años [31]. Según informes, más de 50 miRNAs estar implicado en el cáncer de próstata; Sin embargo, la mayoría de los datos actuales indican que sólo un pequeño número de ellas se relacionan con la patogénesis del cáncer de próstata. Curiosamente, de los miRNAs que son conocidos para alterar el fenotipo de las células del cáncer de próstata, algunos son considerados oncogénico (por ejemplo, el miR-221 /-222, miR-21 y miR-125 ter), mientras que otros son considerados como los supresores de tumores (por ejemplo, , miR-101, miR-126 *, miR-146a, miR-330, el cúmulo de miR-34 y miR-200 de la familia). Sobre la base de estos hallazgos, se cree que los miRNAs tener un número de potenciales aplicaciones clínicas en el cáncer de próstata como biomarcadores y dianas terapéuticas [27], [30], [32] - [38].
En el estudio actual , algoritmos disponibles públicamente (TargetScan, PicTar, Miranda) indicaron que el miR-370 puede dirigirse directamente a la 3`-UTR de
FoxO1
. Hemos demostrado que el miR-370 promueve la proliferación de células de cáncer de próstata atacando directamente a la 3'-UTR de
FoxO1
ARNm, que posteriormente se redujo la expresión de la quinasa dependiente de ciclina inhibidores (CDK),
p27
Kip1
y
p21
Cip1
, y upregulated el regulador del ciclo celular
ciclina D1
. Nuestros resultados sugieren que el miR-370 puede desempeñar un papel importante en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
células epiteliales normales de la próstata (PrEC ) se obtuvieron de Clonetics-Biowhittaker (Walkersville, MD, EE.UU.) y se cultivaron en medio PrEMB (Clonetics-Biowhittaker). líneas celulares de cáncer de próstata Tsu-Pr1, PC3, DU145, LNCaP y 22Rv1 líneas celulares se obtuvieron de la ATCC (Manassas, VA, EE.UU.). PC3 se mantuvo en F-12K Medio (Invitrogen), DU145 se cultivó en medio esencial mínimo de Eagle (Invitrogen), y Tsu-Pr1,22Rv1 y LNCaP fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Invitrogen), complementado con suero bovino fetal 10% (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.) y 1% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen).
plásmidos y transfección
La secuencia del clon
FoxO1
3'UTR es tan siguiendo: CTTCAGATTGTCTGACAGCAGGAACTGAGAGAAGCAGTCCAAAGATGTCTTTCACCAACTCCCTTTTAGTTTTCTTGGTTAAAAAAAAAAACAAAAAAAAAAACCCTCCTTTTTTCCTTTCGTCAGACTTGGCAGCAAAGACATTTTTCCTGTACAGGATGTTTGCCCAATGTGTGCAGGTTATGTGCTGCTGTAGATAAGGACTGTGCCAT.
This secuencia se amplificó por PCR a partir de ARN PREC y se clonó en el
Sac de
/
XmaI sitios
I del plásmido pGL3-control de indicador de luciferasa (modificado mediante la adición de
Sac I
/
Xma
que los sitios a los plásmidos de Promega, Madison, WI, EE.UU.) y el
Sac
/
XmaI sitios
I de pGFP-C3 (modificado mediante la adición de
Sac
/
XMA
sitios a los plásmidos de Clontech, Mountain View, CA, EE.UU.). Hemos modificado el vector pGL3-Control original, digiriendo el sitio XbaI de 1934 y la destrucción de los sitios se multiplican clonación (MCS), que se encuentra en la corriente arriba del promotor de SV40, por lo que los sitios originales de
Sac
/
Xma
que se pierden. Y a continuación, se han sintetizado una sección de la secuencia que incluye
Sac
/
Xma
sitios. Más tarde añadimos esta secuencia para el sitio XbaI de 1934. La secuencia de pGL3-control modificado es de la siguiente manera:
TCTAGA AA GAGCTC AACCAATGCATTGGTCC CCCGGG GGAGCTCTAGA
Después de todo esto, FoxO1 3'UTR se clona en el 3'UTR de luc + no el de aguas arriba del promotor SV40.
en pGFP-C3 plásmido, MCS se encuentra en el 3'UTR de GFP, incluyendo las siguientes sequence:
TACAAGTACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCA.
The cebadores fueron:
FoxO1
-3'UTR-peso-up: 5'-GCCCCGCGGCTTCAGATTGTCTGACAGCAGGAAC-3 ';
FoxO1
-3'UTR-peso-dn: 5'-GCCCTGCAGATGGCACAGTCCTTATCTACAGC-3 ';
FoxO1
-3'UTR-mu-up: 5'-GCCCCGCGGCTTCAGATTGTCTGACAGCACCAAC-3 'y
FoxO1
-3'UTR-mu-dn: 5'-CCG CTGCAGATGGCACAGTCCTTATCTACAGC-3'. El plásmido IRS-MLP-luc P3X se construyó como se describe anteriormente [19]. Los miméticos de miR-370, control negativo y anti-miR-370 inhibidor fueron adquiridos de RiboBio (Guangzhou, Guangdong, China). La transfección del inhibidor de microARN y microRNA se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
Western blotting
análisis de transferencia Western se realizó de acuerdo con los métodos estándar utilizando anti-FoxO1, anti -p21, anti-p27, anti-ciclina D1, anti-Ki-67 anticuerpos (señalización celular, Danvers, MA, EE.UU.), anti-Rb y anticuerpos anti-Rb fosforilada (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.). Las membranas fueron despojados y re-borró con un anticuerpo monoclonal anti-ß-tubulina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) como control de carga.
extracción de RNA y en tiempo real PCR cuantitativa
miRNAs totales se extrajeron a partir de células cultivadas utilizando el kit de aislamiento de mirVana miRNA (Ambion, Austin, TX, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante, a continuación, se sintetizó ADNc a partir de 5 ng de ARN total usando el kit de transcripción inversa Taqman miRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Los niveles de expresión de miR-370 se cuantificaron utilizando un kit TaqMan Mirna Ensayo-miARN específico (Applied Biosystems). Los niveles de expresión de los genes miARN se definen basándose en el umbral del ciclo (C
t), y los niveles relativos de expresión se calcularon como 2
- [(Ct de miR-370) - (Ct de U6)].
-PCR en tiempo real se realizó utilizando el sistema de detección de secuencia 7500 de Applied Biosystems usando los siguientes cebadores para
p21
Cip1
, (adelante, 5'-CGATGCCAACCTCCTCAACGA-3 'y revertir, 5' TCGCAGACCTCCAGCATCCA-3 ');
p27
Kip1 gratis (adelante, 5'-TGCAACCGACGATTCTTCTACTCAA-3 'y revertir, 5'-CAAGCAGTGATGTATCTGATAAACAAGGA-3') y ciclina D1 mRNA (adelante, 5'-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3 'y revertir, 5 '-CCACTTGAG CTTGTTCACCA-3'). Los datos de expresión se normalizaron al nivel de expresión media geométrica de la limpieza de genes
GAPDH gratis (adelante, 5'-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3 '; inversa, 3'-AGAGGCAGGGATG ATGTTCTG -5') y se calculará utilizando 2
- [(Ct de
p21, p27 o ciclina D1
) - (Ct
de
GAPDH
)], donde C
t representa el ciclo umbral para cada transcripción .
3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil-2H-tetrazolio bromuro (MTT) ensayo de
Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos. En los puntos de tiempo indicados, las células se incubaron con 100 l de MTT estéril (0,5 mg /ml, Sigma) durante 4 horas a 37 ° C, a continuación, se retiró el medio y se reemplazó con 150 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sigma). Se midió la absorbancia a 570 nm, con 655 nm como longitud de onda de referencia. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
independiente del anclaje capacidad de crecimiento ensayo
Quinientos células se trataron con tripsina y se resuspendieron en 2 ml de medio completo que contiene 0,3% de agar (Sigma). La mezcla de células de agar se cultivó en placas sobre medio completo que contiene 1% de agar. Después de 10 días, las colonias viables se midieron usando un micrómetro ocular y las colonias que contienen más de 50 células y colonias más grandes de 0,1 mm de diámetro fueron contados. El experimento se realizó tres veces independientes para cada línea celular.
ensayos de formación de colonias
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (0,5 x 10
3 células por placa), se cultivaron durante 10 días, se fijaron con formaldehído al 10% durante 5 minutos, se tiñeron con cristal violeta al 1,0% durante 30 s y se contaron.
etiquetado bromodesoxiuridina y la inmunofluorescencia
Las células cultivadas en cubreobjetos (Fisher, Pittsburgh, PA , EE.UU.) se incubó con bromodesoxiuridina (BrdU) durante 1 h después se tiñeron con un anticuerpo anti-BrdU (Upstate, Temecula, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. imágenes de nivel de gris fueron adquiridos utilizando un microscopio de barrido láser (2 Axioskop además, Carl Zeiss Co. Ltd., Jena, Alemania).
Los ensayos de luciferasa
células de cáncer de próstata (3,5 × 10
4) se sembraron por triplicado en placas de 24 pocillos, se deja reposar durante 24 horas y después se co-transfectaron con 100 ng P3X IRS-MLP plásmido ADN de luciferasa, 100 ng de pGL3-FOXO1-3'UTR) plásmido (peso /mu ADN o 100 ng pGL3 de control-luciferasa plásmido y 1 ng del control Renilla plásmido pRL-TK (Promega) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Luciferasa y la actividad de Renilla se midieron 48 h después de la transfección usando el Dual Luciferase Assay Kit reportero (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tres experimentos independientes se realizaron y los datos se presentan como la media ± desviación estándar. los valores de actividad de luciferasa se normalizaron a la actividad de Renilla.
Citometría de flujo análisis
Las células se cosecharon por tripsinización, se lavaron en hielo frío PBS, se fijaron en etanol helado al 80% en PBS, se centrifugaron a 4 ° C y se resuspendieron en PBS frío. Se añadió ARNasa pancreática bovina (Sigma-Aldrich) a una concentración final de 2 mg /ml, se incubaron a 37 ° C durante 30 min, a continuación, 20 g /ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich) se añadió y se incubó durante 20 min a la habitación temperatura. En cada grupo, 50.000 células fueron analizadas por citometría de flujo. (FACSCalibur; BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.)
El análisis estadístico
de Student de dos colas
t
-test se utilizó para evaluar la significación de las diferencias entre los dos grupos;
P
valores & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
miR-370 es upregulated en líneas celulares de cáncer de próstata
En tiempo real PCR análisis reveló. que la expresión de miR-370 se incrementó notablemente en todas las líneas celulares de cáncer de cinco de próstata analizadas (Tsu-Pr1, PC3, DU145, 22Rv1 y LNCaP), en comparación con epiteliales de la próstata normal (PrEC) células (Figura 1A), lo que indica que miR-370 es upregulated en líneas celulares de cáncer de próstata
a, análisis de PCR en tiempo real de la expresión de miR-370 en las células epiteliales normales de la próstata. (PrECs; como se muestra N1 y N2) y el cáncer de próstata líneas celulares incluyendo PC3, DU145, 22Rv1 y células LNCaP B, ensayos de MTT que indican que la proliferación de las células transfectadas-370 MIR aumenta, en comparación con el control negativo (NC) células transfectadas. C, el ensayo de formación de colonias de miR-370 células que sobreexpresan; micrografías representativas (izquierda) y cuantificación (derecha) de cristal violeta colonias de células teñidas. D, La cuantificación de Ki-67 células positivas en las células PC3 y DU145 transfectadas con el miR-370 de control de imitar o negativo (CN) 48 horas después de la transfección. E, Regulación al alza de miR-370 promueve la próstata tumorigenicidad de las células cancerosas; Micrografías representativas (izquierda) y la cuantificación de las colonias que contienen más de 50 células (medio) o colonias de más de 0,1 mm (derecha) en el ensayo de crecimiento independiente de anclaje. Las barras representan la media ± SD de valores de tres experimentos independientes; *
P Hotel & lt; 0,05
La sobreexpresión de miR-370 aumenta la proliferación y mejora la tumorigenicidad
Con el fin de investigar la función de miR-370 en el cáncer de próstata. , transfectadas una hsa-miR-370 imitan en PC3 y DU145 células de cáncer de próstata y la proliferación celular medida. El uso de ensayos de MTT y de formación de colonias, se observó que la tasa de crecimiento de las células que sobreexpresan miR-370 se aumentó drásticamente, en comparación con el control negativo (NC) transfectadas las células de cáncer de próstata (Figura 1B y 1C). Además, la proporción de Ki-67 células positivas, un indicador conocido de células en proliferación, fue significativamente mayor en las células que expresan ectópica miR-370, en comparación con las células transfectadas-NC (Figura 1D). Estos resultados demostraron que la regulación al alza de miR-370 promueve la proliferación de células de cáncer de próstata.
Por otra parte, la expresión ectópica de miR-370 en células PC3 y DU145 de cáncer de próstata mejora de forma significativa la capacidad de crecimiento independiente de anclaje y dar lugar a una mayor el número de colonias y el tamaño en el ensayo de formación de colonias en agar blando (Figura 1F), lo que sugiere que la regulación al alza de miR-370 aumentó tumorigenicidad de células de cáncer de próstata
in vitro
. Tomados en conjunto, estos experimentos demostraron que la regulación al alza de miR-370 promueve la proliferación y transformación de células de cáncer de próstata.
La sobreexpresión de miR-370 promueve la transición del ciclo celular G1 /S en células de cáncer de próstata
además, investigó el efecto de miR-370 en la proliferación mediante citometría de flujo. células PC3 y DU145 miR-370 que sobreexpresan tenían un porcentaje significativamente menor de células en la fase G1 /G0 y aumento del porcentaje de células en la fase S, en comparación con las células transfectadas-NC (Figura 2A). Además, se observó un aumento del número de células BrdU incorporación en las células transfectadas con el miR-370, en comparación con las células transfectadas-NC (Figura 2B). En conjunto, estos datos sugiere que la sobreexpresión de miR-370 puede aumentar la proliferación de células de cáncer de próstata mediante la promoción de la transición G1 del ciclo celular /S.
, el análisis de citometría de flujo de células PC3 y DU145 transfectadas con el miR-370 imitan o un control negativo (NC) 48 horas después de la transfección. B, las micrografías representativas (izquierda) y cuantificación (derecha) del ensayo de incorporación de BrdU en las células PC3 y DU145 transfectadas con miR-370 o NC 48 horas después de la transfección. C, Western Blot análisis indican una disminución en la expresión de p21
Cip1, p27
Kip1 y el aumento de la expresión de ciclina D1 y Rb fosforilada (p-Rb) en las células PC3 y DU145 transfectadas con el miR-370 o NC 48 horas después de la transfección . α-tubulina se utilizó como control de carga. D, el análisis de PCR en tiempo real de los
p21
Cip1, p27
Kip1 Opiniones y ciclina D1 mRNA en células PC3 y DU145 transfectadas con el miR-370 o NC 48 horas después de la transfección.
GAPDH
se utilizó como control de carga. Las barras representan la media ± SD de valores de tres experimentos independientes; *
P
. & Lt; 0,05
miR-370 disminuye la expresión de los inhibidores del ciclo celular
p21
Cip1
y
p27
Kip1
y aumenta la expresión del regulador del ciclo celular ciclina D1
a medida que el miR-370 promueve la proliferación celular, hemos explorado el efecto de miR-370 en la expresión de los genes que regulan la transición G1 /S [4 ] - [6], incluyendo la CDK inhibidores de p21
Cip1 y p27
Kip1 y el regulador de CDK ciclina D1. El uso de transferencia de Western y el análisis de PCR en tiempo real, se observó que p21
Cip1 y p27
proteína Kip1 y el ARNm se downregulated y la proteína ciclina D1 y el ARNm se upregulated en las células transfectadas con miR-370, en comparación con NC-transfectadas las células (Figura 2C y 2D). Coincidente con la expresión alterada de los reguladores del ciclo celular, el nivel de fosforilación de Rb, una proteína diana aguas abajo de CDK, fue significativamente mayor en las células transfectadas con el miR-370 (Figura 2C), además de confirmar que el miR-370 puede influir en la proliferación de próstata las células cancerosas.
inhibición de miR-370 reduce la proliferación de células de cáncer de próstata
Como se describió anteriormente, miR-370 juega un papel crítico en la proliferación de células de cáncer de próstata. Sin embargo, seguía siendo desconocido si la inhibición de miR-370 podría reducir la proliferación celular. Como era de esperar, la inhibición de miR-370 aumentó la transcripción de
p21
Cip1
y
p27
Kip1
y la reducción de la expresión de ciclina D1 mRNA (Figura 3A). Además, la inhibición de miR-370 aumentó significativamente el porcentaje de células en la fase G0 /G1 y la disminución del porcentaje de células en la fase S (Figura 3B). Por otra parte, utilizando el ensayo MTT, descubrimos que la expresión ectópica del inhibidor de hsa-miR-370 reduce el crecimiento de células de cáncer de próstata PC3 y DU145, en comparación con las células transfectadas-NC (Figura 3C). Además, como se muestra en la figura 3D, la inhibición de miR-370 disminuyó el número de colonias y de colonias tamaños de las células PC3 y DU145 en el ensayo de formación de colonias, y también redujo notablemente la capacidad de crecimiento independiente de anclaje de las dos líneas celulares.
en tiempo real PCR análisis de
p21
Cip1, p27
Kip1 Opiniones y ciclina D1 mRNA en células PC3 y DU145 transfectadas con el miR-370 inhibidor o de control negativo (CN) 48 horas después de la transfección .
GAPDH
se utilizó como control de carga. B, el análisis de citometría de flujo de células PC3 y DU145 transfectadas con el miR-370 inhibidor o NC 48 horas después de la transfección. C, ensayos de MTT reveló que la inhibición de miR-370 reduce el crecimiento celular. D, micrografías representativas (izquierda) y la cuantificación de las colonias que contienen más de 50 células (medio) o colonias mayor de 0,1 mm (derecha) en los ensayos de crecimiento independiente de anclaje. Las barras representan la media ± SD de valores de tres experimentos independientes; *
P
. & Lt; 0,05
miR-370 se dirige directamente el factor de transcripción
FoxO1
en células de cáncer de próstata
Un estudio previo reveló FoxO1 que puede regular una serie de genes relevantes en el ciclo celular a nivel transcripcional, incluyendo
p21
Cip1
,
p27
Kip1
y ciclina D1 mRNA. Al mismo tiempo, nuestro análisis usando tres algoritmos disponibles públicamente (TargetScan, PicTar, Miranda) demostró que el miR-370 puede dirigirse directamente a la 3'-UTR de
FoxO1 gratis (Figura 4A). Estos datos indicaron que el miR-370 puede modular la expresión de p27
Kip1, p21
Cip1 y ciclina D1 mediante la regulación de
FoxO1
. Como se muestra en la Figura 4B, la Figura S2A y la Figura 4C, la expresión ectópica de miR-370 disminución de la proteína y los niveles de mRNA de expresión de FoxO1 en células PC3 y DU145, lo que indica que
FoxO1
es un gen diana potencial miR-370 . FoxO1 está regulado por disminución en las células de cáncer de próstata (Figura S1A y la Figura 1A); lo que es probable que estar vinculadas a la regulación positiva de miR-370 en células de cáncer de próstata (Figura 1), lo que reduciría la expresión de miR-370 gen diana
FoxO1
.
A, Secuencia de
FoxO1
3'UTR de miR-370 semillas región de unión y la mutación de la
FoxO1 semillas región 3'-UTR
para crear FoxO1-mu. B, análisis de transferencia de Western de la expresión de miR-FoxO1 370 o negativo de control (NC) PC3 transfectadas y las células DU145 48 horas después de la transfección. C, actividades reportero FoxO1 relativos en el miR-370 o células NC-transfectadas 48 horas después de la transfección. D, análisis de transferencia de Western de la expresión del gen reportero GFP en el miR-370 o transfectadas-NC células 48 horas después de la transfección. E, la actividad luciferasa relativa de PC3 de próstata DU145 o las células del cáncer de co-transfectadas con cantidades crecientes de miR-370 imitan oligonucleótidos (20, 50 nM), y el reportero de control pGL3, reportero pGL3-FOXO1-3'UTR, o pGL3-FoxO1 reportero -3'UTR-mu, 48 horas después de la transfección, respectivamente. Las barras representan la media ± SD de valores de tres experimentos independientes; *
P
. & Lt; 0,05
Para confirmar la función del sitio de unión de miR-370 putativa en el
FoxO1
3'-UTR, se clonó el
FoxO1
3'-UTR en los plásmidos indicadores pEGFP-C3 y pGL3. expresión de la proteína GFP se inhibió dramáticamente por la expresión ectópica de miR-370 en células PC3 y DU145, en comparación con el plásmido de control GFP-γ-tubulina, lo que sugiere que miR-370 se dirige específicamente a la
FoxO1
3 'UTR. La transfección de miR-370 reduce de manera consistente y dependiente de la dosis de la actividad de la luciferasa de la
FoxO1
3'-UTR de luciferasa plásmido reportero en células PC3 y DU145 de cáncer de próstata (Figura 4E). Por otra parte, el efecto represivo de miR-370 en el
FoxO1
3'-UTR fue abrogada por mutaciones puntuales en la región de semillas de miR-370-unión de la
FoxO1
3'-UTR ( Figura 4E). Estos resultados demostraron que
FoxO1
es un
de buena fe
objetivo de miR-370.
La transfección de un inhibidor de miR-370 restauró la actividad luciferasa de pGL3-FOXO1- 3'UTR plásmido reportero en PC3 y las células de cáncer de próstata DU145 (Figura 5A), y la expresión de proteínas FoxO1 upregulated (Figura 5B). Además, la inhibición de miR-370 de manera consistente y aumentaron dependiente de la dosis la actividad de la luciferasa de pGL3-FOXO1-3'UTR en ambas líneas celulares de cáncer de próstata (Figura 5C). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la inhibición de miR-370 FoxO1 upregulated.
ensayo de actividad de luciferasa relativa de las células PC3 y DU145 co-transfectadas con el plásmido pGL3-FOXO1-3'UTR y cantidades crecientes (20, 50 nM) de miR-370 mimic- o miR-370-inhibidores de oligonucleótidos, 48 horas después de la transfección, respectivamente. B, análisis de transferencia de Western de la expresión de miR-FoxO1 370 o negativo de control (NC) PC3 transfectadas y las células DU145 48 horas después de la transfección. C, ensayo de actividad de luciferasa de las células PC3 y DU145 transfectadas con el plásmido pGL3-FOXO1-3'UTR y cantidades crecientes (20, 50 nM) de miR-370 inhibidores de oligonucleótidos 48 horas después de la transfección. Las barras representan la media ± SD de valores de tres experimentos independientes; *
P
. & Lt; 0,05
Para confirmar el efecto de la sobreexpresión de miR-370 en células de cáncer de próstata (Figura 1), se cuantificó la expresión de FoxO1 en células de cáncer de próstata. Hemos observado que FoxO1 está regulado por disminución en las células de cáncer de próstata (Figura S1A y la Figura 1A); confirmando que la sobreexpresión de miR-370 regula a la baja el gen diana de miR-370
FoxO1
en células de cáncer de próstata.
proliferación de las células del cáncer de próstata inducida por miR-370 es modulada por FoxO1
Para investigar si FoxO1 pudo reprimir la proliferación inducida por el miR-370,
FoxO1 gratis (sin la 3'-UTR) y
FoxO1
3'-UTR (con la 3'-UTR) se transfectaron en células de cáncer de próstata miR-370 que sobreexpresan. Como era de esperar expresión, ectópica de plomo FoxO1 significativamente mayores a los cambios en la expresión de
p27
Kip1
,
p21
Cip1
y ciclina D1 mRNA de FOXO1-3'UTR (Figura 6A). En particular, después de la transfección de un gen indicador FoxO1 y miR-370 en las células de cáncer PC3 y DU145 de próstata, la actividad luciferasa podría ser restaurado por la sobreexpresión de FoxO1 y parcialmente rescatado por transfección de la FOXO1-3'-UTR (Figura 6B). Además, la tasa de crecimiento tanto de las células de cáncer de próstata PC3 y DU145 fue inhibido a un grado significativamente mayor por co-transfección de miR-370 y FoxO1 de co-transfección de FOXO1-3'-UTR y miR-370 (Figura 6C). En conclusión, estos resultados sugieren que la proliferación de células de cáncer de próstata inducida por el miR-370 está directamente mediada por la supresión de los
FoxO1
.
En tiempo real PCR análisis de
p21
Cip1 , p27
Kip1
y ciclina D1 expresión de ARNm en las células indicadas.
GAPDH
se utilizó como control de carga 48 horas después de la transfección. B, la actividad Ensayo de la luciferasa de las células transfectadas se indican con un reportero FoxO1 48 horas después de la transfección. C, el ensayo de MTT de las células de cáncer de próstata transfectadas con el miR-370 imitan, co-transfectadas con el miR-370 y FoxO1, o co-transfectadas con el miR-370 y FOXO1-3'-UTR.
discusión
en este estudio, hemos demostrado que el miR-370 es upregulated en líneas celulares de cáncer de próstata, en comparación con las células epiteliales normales de la próstata primarios. La regulación positiva de miR-370 promueve la transición del ciclo celular G1 /S en células de cáncer de próstata, que se correlacionaban con la regulación a la baja de los inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) p27
Kip1 y p21
Cip1. Por el contrario, la inhibición de miR-370 proliferación de células cancerosas de próstata reducido, upregulated p27
Kip1 y p21
Cip1, y el retraso en la transición G1 /S. MiR-370 regula positivamente el ciclo celular regulador de ciclina D1 atacando directamente a la
FoxO1
3'-UTR, lo que demuestra que FoxO1 está regulada por el miR-370 en células de cáncer de próstata. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la regulación al alza de miR-370 puede promover la iniciación y progresión del cáncer de próstata.
Se ha demostrado que la expresión FoxO1 está regulada por varios microRNAs, como miR-223, miR-182, miR-27a, miR-139 y miR-96 [39] - [43]. De éstos, algunos microRNAs pueden ser dysregulated en el cáncer de próstata, como miR-27a, miR-182 [41], [44]. De hecho, un único ARNm con frecuencia podría ser regulada por varios microRNAs en la regulación de genes.