Extracto
agresividad de la enfermedad sigue siendo un factor crucial para la progresión del cáncer de próstata. La transformación de células epiteliales a linaje mesenquimal, asociados a la pérdida de E-cadherina, ofrece un potencial invasivo y significativa capacidad de migración. Recientemente, la proteína de unión especial rica en AT (SATB1) se ha relacionado con la progresión tumoral. SATB1 es un tipo de célula restringida proteína nuclear, que funciona como un organizador específica del tejido de secuencias de ADN durante la diferenciación celular. Nuestros resultados demuestran que SATB1 juega un papel importante en la invasión tumoral de próstata y la migración y su localización nuclear se correlaciona con la agresividad de la enfermedad. el análisis de muestras clínicas mostraron que SATB1 se expresa predominantemente en el núcleo de tumores de alto grado en comparación con los tumores de bajo grado y el tejido benigno. Un aumento progresivo de los niveles nucleares de SATB1 se observó en los tejidos de cáncer en comparación con las muestras benignas. Del mismo modo, los niveles de proteína SATB1 fueron mayores en un número de células de cáncer de próstata
viz
. VPH-CA-10, DU145, Dupro, PC-3, PC-3M, LNCaP y C4-2B, en comparación con PZ-HPV-7 células no tumorigénicas. La expresión nuclear SATB1 fue mayor en subclones biológicamente agresivos de células de cáncer de próstata con sus respectivas líneas celulares de sus padres. Por otra parte, la transfección ectópico SATB1 conferido aumento de la motilidad celular y la invasión de las células epiteliales inmortalizadas de próstata humano PZ-HPV-7 que se correlacionaban con la pérdida de expresión de E-cadherina. En consecuencia, desmontables de SATB1 en células PC-3M de cáncer de próstata humano altamente agresivas inhibe la invasión y el crecimiento tumoral
in vivo
junto con el aumento de la expresión de la proteína E-cadherina. Nuestros hallazgos demuestran que SATB1 tiene capacidad para promover la agresividad del cáncer de próstata a través de la transición epitelio-mesenquimal
Visto:. Shukla S, H Sharma, Abbas A, MacLennan GT, Fu P, Danielpour D, et al. (2013) La regulación positiva de SATB1 se asocia con el cáncer de próstata La agresividad y la progresión de la enfermedad. PLoS ONE 8 (1): e53527. doi: 10.1371 /journal.pone.0053527
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Agosto, 2012; Aceptado: 3 de diciembre de 2012; Publicado: 7 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Shukla et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Financiación proporcionada por fondos de Estados Unidos Servicio de Salud Pública de Subvenciones RO1CA115491 y la dotación a SG. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la segunda causa de muerte por cáncer entre los hombres en los Estados Unidos, con cerca de 33.720 muertes se produjeron en el año 2011 [1]. Mal pronóstico del cáncer de próstata está asociada con la agresividad de las células tumorales que los dota de mayor capacidad para intravasate en los compartimentos vasculares y linfáticos, metástasis a sitios distantes, y causar la repetición incluso después de terapias definitivas como la cirugía y la radiación [2], [3 ]. transición epitelio-mesenquimal (EMT) es un evento clave en el proceso de invasión tumoral mediante el cual el tumor derivado de las células epiteliales adquiere características mesenquimales, pierden su polaridad y contactos célula-célula y someterse a una profunda remodelación del citoesqueleto [4] - [6]. La pérdida de expresión de E-cadherina es un sello distintivo de la EMT [7], [8]. E-cadherina (CDH1) desempeña un papel central en las uniones de adhesión célula-célula en el mantenimiento de la polaridad celular y el medio ambiente [7]. La pérdida de expresión de E-cadherina se asocia comúnmente con la invasión tumoral, metástasis y mal pronóstico en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata humanos [8], [9]. Identificación de proteínas que causan la reprogramación molecular de la EMT podría conducir a su identificación como biomarcadores pronósticos y dianas terapéuticas, lo que permite el desarrollo de nuevas estrategias para reducir la agresividad del cáncer de próstata.
Especial rica en AT proteína de unión 1 (SATB1) es un factor de transcripción que funciona como un organizador genoma [10], [11]. Se tiende a unirse con AT ricos secuencias no apareadas de bases del gen diana [11]. SATB1 adquiere una estructura "3 D de gallinero" mediante la formación de anclaje se enrolla alrededor de la cromatina, recluta a los complejos de remodelación de la cromatina en los sitios de anclaje, y regula las modificaciones de histonas mediante la prestación de secuencias de ADN accesibles o inaccesibles para la transcripción [12], [13]. Transcripción GenBank hace referencia a dos variantes de la transcripción de ARNm SATB en los seres humanos: SATB1 y SATB2 [14]. La activación constitutiva de SATB1 se ha demostrado principalmente en las células de linaje hematopoyético y está implicado en las etapas de desarrollo de las células T y la diferenciación de control de la expresión del gen BCL-2 a través de la gran región de punto de interrupción BCL-2 (mbr) situado dentro de la 3 ' UTR [15], [16]. SATB2 está implicada como un regulador del desarrollo de la diferenciación neuronal [17]. Estudios recientes han demostrado la expresión aberrante de SATB1 en una variedad de cánceres epiteliales, incluyendo melanoma, carcinoma de células escamosas de la laringe, y carcinomas de la mama, colon, pulmón, ovario, y el hígado [18] - [24]. La sobreexpresión de SATB1 se ha identificado como un marcador de pronóstico independiente para el cáncer gástrico [25], y se ha demostrado que desempeñan un papel en la progresión de tumor de mama a través de un proceso de reprogramación de la expresión génica y promoviendo así el crecimiento del tumor y la metástasis [26]. poco se sabe acerca de la influencia de la expresión SATB1 en el comportamiento biológico del cáncer de próstata.
Aunque SATB1 ha informado que ser activado en varios tipos de cáncer, su papel en la progresión del cáncer no está claro. Un análisis de expresión génica global de los especímenes de cáncer de próstata clínico reveló distinta reprogramación transcripcional asociado con potencial metastásico [27]. perfilado funcional de genes sugiere la asociación de SATB1 con modificación de la cromatina que afectan la regulación transcripcional de los genes que regulan las moléculas de adhesión celular y EMT [9], [12]. Teniendo en cuenta el importante papel de la EMT en la invasividad del cáncer de próstata, se ha planteado la hipótesis de que la sobre-expresión de SATB1 en el cáncer de próstata podría promover la invasividad del cáncer de próstata mediante la regulación por disminución de la E-cadherina. Hasta el momento, no ha habido datos sobre el papel de SATB1 en el cáncer de próstata. En este estudio de la expresión SATB1, su localización nuclear y citoplásmica se evaluó en una serie de muestras de tejido de cáncer de próstata primario y líneas celulares establecidas a través de una combinación de técnicas de inmunohistoquímica y transferencia Western. Nuestros resultados demuestran que la presencia nuclear de SATB1 significativamente correlacionado con la agresividad del cáncer de próstata y progresión de la enfermedad. De acuerdo con resultados clínicos, alteraciones en la expresión ectópica SATB1 como resultado cambios en la motilidad celular y la invasión, tanto
in vitro
y
in vivo
. Esta línea de evidencia demuestra la importancia pronóstica de SATB1 en el cáncer de próstata y además aclara la influencia de SATB1 en la promoción de la invasividad del cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
Humano células de cáncer de próstata, LNCaP, 22Rv1, DU145, PZ-HPV-7, CA-HPV-10 y PC-3 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). células de cáncer de próstata humano
a saber
. PC-3M fue proporcionada por el Dr. ME Kaighn en el Instituto Nacional del Cáncer [28]; células C4-2B por el Dr. Robert Sikes en la Universidad de Delaware [29], y las células Dupro por el Dr. Rajvir Dahiya de la Universidad de California en San Francisco [30]. Informes anteriores han documentado la creación de estas líneas celulares [28] - [30]. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 con suero bovino fetal inactivado por calor al 10%, 100 mg /ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA), mantenida en una incubadora con una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2 a 37 ° C. Las células cultivadas se hicieron crecer hasta ~ 60% de confluencia y lisados (lisados totales, citosólicas y lisados nucleares) se prepararon de acuerdo con el protocolo anterior para su posterior análisis.
muestras de tejido de próstata humano e inmunohistoquímica
Muestras de tejido de próstata humana fueron descartados recibido del Fondo para Adquisición de tejidos de la Universidad Case de los Hospitales y Centro Médico de la División del Medio Oeste de la Red Cooperativa de tejidos humanos. No se obtuvo el consentimiento para estos tejidos desechados por sus políticas del hospital y los protocolos de la Junta de Revisión Institucional. Estos estudios fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional en el Centro Médico Case de los Hospitales Universitarios. Pacientes de los cuales se adquirieron estos tejidos habían sido sometidos a procedimientos quirúrgicos para la enfermedad prostática y que no habían recibido ningún tipo de terapia adyuvante. El grado de Gleason y puntuación de adenocarcinoma en las muestras de tejido fueron asignados por un patólogo con experiencia en patología quirúrgica genitourinario. Inmediatamente después de la extracción, las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C en la fase de vapor de nitrógeno líquido hasta su uso posterior. Para los estudios de IHC un microarray de tejido de próstata humana (Cat#73-5063) fue adquirido de Zymed Laboratories (San Francisco, CA), incluyendo núcleos de próstata normal, hiperplasia benigna de tejido de la próstata, cáncer de bajo grado y el cáncer de próstata de alto grado. En estas muestras, el análisis inmunohistoquímico se realizó según el protocolo del fabricante (Biocare Medicals, Concord, CA).
transfección transitoria
andrógenos refractario altamente metastásica del cáncer de próstata humano PC-3M, que poseen mayor expresión de SATB1, mientras que, se utilizaron PZ-HPV-7 que tiene muy bajo nivel basal de SATB1in el núcleo en el estudio. En pocas palabras, estas células se sembraron en placas de 100 mm y se dejaron unir durante la noche. Aproximadamente el 70% de células confluentes PZ-HPV-7 fueron transfectadas transitoriamente con 8 & lt; mu & gt; g de cualquiera de pCMV6-AC verdadero clon de ADN plásmido humano con SATB1 expresión (SC320672) se adquirió de OriGene (Rockville, MD) o vector vacío, mientras que, PC-3M células fueron infectadas con el shRNA (SATB1) ADN plásmido humana para derribar la expresión génica SATB1; que contiene la piscina de vector lentiviral 3 objetivo específico de cada codificación 19 a 25 nt (además de horquilla) (SC-36460-SH) y el vector vacío shRNA plásmido-A (SC-108060) (Santa Cruz Biotechnology, CA), utilizando Fugene 6 reactivo de transfección. Después de 6 h, el medio fue suplementado con suero de medio de cultivo, y se incubaron las células a 37 ° C en un incubador humidificado durante 48 h. Más tarde, las células fueron procesadas para el análisis de inmunotransferencia, así como la migración de células y ensayos de invasión.
se prepararon Western Blotting
lisados tumorales, así como lisados de células (total, citosólicas y nucleares) y se sometieron a análisis de inmunoblot. La proteína (40 & lt; mu & gt; g) a partir de lisados de células totales o lisados de tumor de próstata humano se resolvió sobre 4-20% SDS-PAGE y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear con tampón de bloqueo (PBS que contiene 0,1% de Tween-20 y 10% de FBS) durante 2 h, la membrana se incubó con anticuerpo primario durante 2 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos utilizados fueron SATB1 (Cat#ab49061, Abcam, Cambridge, MA); Histona H4 (Cat#07-108, Millipore, Denvers, MA); E-cadherina (Cat#SC-8426); MMP-9 (Cat#SC-10737); & Lt; beta & gt;-actina (Cat#SC-47778) y citoqueratina-18 (Cat#SC-6259) de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA). A continuación, la membrana se incubó con anticuerpo secundario conjugado con HRP durante otras 2 h a temperatura ambiente. La proteína se detectó mediante ECL reactivos sustrato (Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL).
invasión celular Ensayo
transitoriamente transfectar SATB1 en PZ-HPV-7 (células que expresan SATB1over) y PC infectadas (desmontables células SATB1) -3M se tomaron en el estudio para examinar el efecto del gen SATB1 en la invasión celular, así como en la migración. Después de 48 h de infección gen SATB1 en las células, los medios que contienen suero se eliminó de las células y se reponen fresco sin suero medio RPMI durante 6 h. se tripsinizaron además células, se contaron y sembraron en los cultivos polarizados que contienen 1 × 10
6 células /ml. El kit de ensayo de invasión de cámara utilizado fue QCMTM ECMatrix Cell Invasion ensayo, de 24 pocillos (8 & lt; mu & gt; m) (Millipore Corporation, Denvers, MA, Cat#ECM550) basado en el principio de la cámara de Boyden. La capa de colágeno ocluye los poros de la membrana, el bloqueo de las células no invasivas de migración a través de la membrana. células invasoras, por otra parte, migran a través de la capa de colágeno polimerizado y se aferran a la parte inferior de la membrana de policarbonato. células invadidas en la parte inferior de la membrana de inserción se incubaron con solución de tinción de la célula, después se extrajo y se detectó en un lector de microplacas estándar (560 nm) posteriormente. Todo el procedimiento se siguió de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Ensayo de Migración Celular
Migración de ensayo se realizó en PZ-HPV-7 (células que expresan SATB1over) y PC-3M infectados (SATB1 desmontables células) mediante el uso de células QCMTM, de 24 pocillos kit de ensayo de migración celular colorimétrico (Millipore Corporation, Denvers, MA, Cat#ECM508) siguiendo el protocolo del proveedor.
Transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa
Semi se realizó -cuantitativo reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) para determinar los niveles de transcripción de SATB1 en muestras de tejido de próstata humano de diferentes grados de Gleason y la amplificación de los transcritos de GAPDH fueron utilizados como control para normalizar los niveles de transcripción de SATB1. Los tejidos se cortaron en trozos pequeños y se colocaron en Melt, un sistema de aislamiento de ácido nucleico total (Ambion, Austin, TX), según el protocolo de los fabricantes. RT se realizó utilizando el cebador oligo-dT (Invitrogen), y 0,5 & lt; mu & gt; g de ARN total en un lt 25 y; mu & gt; mezcla de reacción l, que contiene 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), KCl 75 mM, 10 mM TDT, 5 mM de MgCl
2, 2,5 ml de dNTP (10 mM), 10 U RNasin, y 200 U MMLV transcriptasa inversa (Invitrogen) a revertir. La reacción de RT se llevó a cabo a 39 ° C durante 1 h para sintetizar ADNc. A continuación, se realizó una PCR para amplificar los ADNc en un lt 25 y; mu & gt; l mezcla de reacción que contiene 50 nmol de cada cebador específico de gen, 3 producto ml RT, dNTP 2,5 mM, tampón de PCR 1X (Tris-HCl 5 mM pH 8,3, KCl 42,5 mM , 0,1% de Triton X-100), 0,5 ml de Taq polimerasa (Promega, Madison, WI) MgCl 2 mM
2 junto con los cebadores utilizados en la reacción de PCR. Las secuencias de los cebadores específicos del gen para la SATB1 hacia adelante: 5'-GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3 'y revertir: 5'-CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3'; GAPDH hacia adelante: 5'-ATGACC CCTTCATTGACCTCA-3 'y revertir: 5'-GAGATGATGA CCCTTTTGGCT-3'. transcripciones SATB1 se amplificó durante 30 ciclos (1 min a 94 ° C, 1 min a 59 ° C, y 1 min a 72 ° C), y los ADNc de los transcritos de GAPDH se amplificaron durante 25 ciclos (1 min a 94 ° C, 1 min a 55 ° C, y 1 min a 72). Los números de los ciclos de PCR se han optimizado para evitar la saturación de amplificación. Diez microlitros del producto de RT-PCR se separaron en geles de agarosa al 2%, que se tiñeron posteriormente con bromuro de etidio. Los geles se visualizaron y las intensidades de banda se miden en la estación de imágenes Kodak 2000R.
SATB1 Derribo
PC-3M células fueron transducidas por SATB1 ARNhc lentiviral partículas, lo cual es un grupo de partícula viral que contiene 3 focalización constructos específicos que codifican 19-25 nt (además de horquilla) shRNA diseñada para derribar la expresión génica (Santa Cruz Biotechnology, CA; sc36460-v). células PC-3M se cultivaron en placas de pocillos a 12 24 horas antes de la infección viral. Transducciones se llevaron a cabo en medio RPMI que contiene 10% de medio completo (con suero y antibióticos) y se incuban las células durante la noche. El medio completo RPMI se retiró y suplementado con polibreno (5 & lt; mu & gt; g /ml) medio completo RPMI. PC-3M células fueron infectadas con añadiendo las partículas lentiviral shRNA a las células que contienen el medio. Todo el procedimiento se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Colonia Ensayo de Formación
Aproximadamente 400 células de PC-3M y PC-3M (SATB1 Knock Down) se tomaron células en placa de Petri de 100 mm ( Falcon; Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) y se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire. Después de 12 días las células se lavaron con tampón de fosfato y después se tiñeron con azul de Coomassie. Células se contaron las colonias y se fotografiaron.
Estudios de xenoinjertos de tumores
Los ratones desnudos fueron adquiridos de Comprehensive Cancer Center de la caja, las instalaciones ratones desnudos atímicos y se mantuvieron en jaulas microisolator. Todos los animales se utilizan de acuerdo con las directrices institucionales y los experimentos actuales fueron aprobados por el Comité de Uso de Cuidado de Animales de la Universidad Case Western Reserve. Las células tumorales, PC-3M y PC-3M (SATB1 knockout) se suspendieron en RPMI 1640 medio de cultivo completo con 25% de Matrigel (BD Biosciences) y se inocularon 1 x 10
6 células por vía subcutánea en la derecha y los flancos izquierdos de 6 a 7 semanas de edad ratones desnudos. Los ratones se controlaron diariamente para la formación de tumores palpables y tumores se midieron dos veces por semana usando un calibrador Vernier, se pesaron y se fotografiaron.
Análisis estadístico
Los datos de expresión nuclear SATB1 fueron resumidos por media (rango ), así como diagrama de caja. Los cambios en el volumen del tumor y el peso corporal durante el curso de los experimentos se visualizaron por diagrama de dispersión. Las diferencias de expresión SATB1 nuclear (por 1.000 núcleos), el volumen del tumor (mm3) y el peso corporal en la terminación del experimento entre los distintos grupos se examinaron mediante análisis de varianza (ANOVA) seguido por el procedimiento de comparación múltiple de Tukey. La significación estadística de las diferencias entre el grupo control y el tratamiento se determinó por la prueba t para datos de muestras independientes o emparejado prueba t para datos de muestras correlacionadas. Todas las pruebas fueron de dos colas y los valores de p inferior a 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Expresión de la proteína SATB1 en benigna del tumor y muestras
La expresión perfil de SATB1 se determinó en las muestras clínicas extirpado quirúrgicamente. Se realizó el análisis de Western blot para SATB1 y CK18 como control de carga epitelial en 14 benigna, 14 de bajo grado del cáncer de próstata (puntuación de Gleason ≤7), y 6 muestras de tumores de alto grado (puntuación de Gleason & gt; 8-10). Una transferencia típica se muestra en la figura 1A, SATB1 se encontró que se expresa en ambos tejidos de cáncer de próstata benignas y cancerosas. Los niveles de SATB1 fueron significativamente mayores en las muestras de cáncer en comparación con el tejido benigno. El análisis densitométrico demostró aumento de 1,6 veces en la expresión SATB1 en muestras de tumores de bajo grado y 2,62 veces mayor en muestras de tumores de alto grado, en comparación con el tejido benigno. A continuación determinamos si SATB1 está regulada positivamente en el nivel de mensaje. Se realizó RT-PCR para la expresión de ARNm para SATB1 y GAPDH como control de carga. Como se muestra en la figura 1B, el transcrito de ARNm para SATB1 se upregulated significativamente en tumores de alto grado en comparación con los tumores de bajo grado y el tejido benigno. El análisis densitométrico demostró aumento de 1,64 veces en la expresión de ARNm SATB1 en muestras de tumores de bajo grado y 1,51 veces mayor en los tumores de alto grado, en comparación con el tejido benigno. Desde SATB1 es una proteína nuclear y promueve una estructura de la cromatina transcripcionalmente activa mediante la interacción con secuencias de ADN ricas en AT, upregulated en el cáncer, por lo tanto, determinamos los niveles de esta proteína en el citosol y la fracción nuclear en muestras benignas y tumorales obtenidas de un mismo individuo. De hecho, los niveles más altos de proteína SATB1 estaba presente en la fracción nuclear en comparación con citosol en el tejido tumoral en comparación con el tejido benigno (Figura 1C).
(A) Expresión de proteínas de SATB1 en diversos grados de los tumores de próstata y tejido benigno se analizó por transferencia Western; cytokeratin18 expresión sirvió como control de carga. (B) la expresión SATB1 mRNA en diversos grados de los tumores de próstata y tejido benigno; la expresión de ARNm de GAPDH sirvió como control de carga. expresión de la proteína (C) SATB1 en muestras pareadas benignas y cancerosas de un mismo individuo se analizó la distribución citoplasmática y nuclear. El análisis densitométrico de cada transferencia se muestra en el panel derecho. Los detalles se describen en la sección "Materiales y métodos".
A continuación analizamos la expresión SATB1 por tinción inmunohistoquímica de las secciones de tejido incluidas en parafina que consisten en 19 5 tumor benigno, de bajo grado (Gleason 5- 6), 10 tumoral medio grado (Gleason 7-8) y 5 tumores de alto grado (Gleason 9-10) en los microarrays de tejidos (Figura 2). se observó expresión SATB1 ya sea en el núcleo o en el citoplasma o ambos, pero predominantemente visto en el núcleo de las células cancerosas. En comparación con el tejido benigno, se observó un aumento progresivo en la expresión SATB1 en el núcleo con el aumento de grado tumoral. se observó bajos niveles de expresión en los tumores SATB1 moderadamente diferenciados. inmunotinción imágenes representativas de la expresión SATB1 en los grados de tumores benignos y diversas se muestran en la figura 2A. También se evaluó los niveles nucleares de SATB1 en diversos componentes histológicos de las muestras de tejido mediante el recuento del número de núcleos que muestran expresión SATB1 positiva con un aumento de X40, y se analizaron los recuentos estadísticamente por media y la desviación estándar, así como el análisis gráfico de caja (Figura 2B). Las diferencias de expresión nuclear SATB1 (por 1000 núcleos) entre las muestras de tumor de grado benignos y otros se examinaron por análisis de varianza (ANOVA) seguido de pares procedimiento de comparación múltiple de Tukey. espécimen benignos (n = 15) presentaron una media de 56,93 núcleos teñidos (rango 37-79), tumores de bajo grado con puntuación de Gleason de 5-6 (n = 13) mostraron una media de 90.54 núcleos teñidos (rango 56-115) ; tumores moderadamente diferenciados con puntuación de Gleason de 7-8 (n = 12) presentaron una media de 146.33 núcleos teñidos (rango 93-198); y el tumor de alto grado con Gleason 9-10 (n = 11) mostró una media de 205,27 (158-298) los núcleos teñidos para SATB1. La expresión SATB1 nuclear entre 4 grupos fue estadísticamente muy significativa (P & lt; 0,0001). Por otra parte, por pares procedimiento de comparación múltiple de Tukey demostraron que la expresión SATB1 en muestras tumorales de puntuación más alta fue significativamente mayor que en las muestras de baja puntuación (P & lt; 0,05).
embebidas en parafina (4,0 micras) secciones (A) de cáncer de próstata benigna y de diversos grados de Gleason se utilizaron para la expresión SATB1 por inmunohistoquímica. Se observó una fuerte tinción nuclear y citoplasmática en la puntuación de Gleason 3 + 3, mientras que el aumento de la tinción nuclear SATB1 se observó en el cáncer de alto grado (puntuación de Gleason 3 + 4 + 5 y 4, respectivamente). Ampliada en x20 y x40 El análisis estadístico (B) de la presencia nuclear SATB1 se llevó a cabo mediante la comparación de SATB1 células teñidas positivas nucleares de varias poblaciones de benigna, la puntuación de 5-6, 7-8 puntuación y la puntuación de 9-10 ejemplares. Los datos representan la media ± SE. *
P Hotel & lt; 0,05
frente
correspondiente control. P & lt; 0,05, detalles se describen en la sección "materiales y métodos"
SATB1 Expresión en Células de cáncer de próstata humano
Se examinó la expresión SATB1 en líneas de células epiteliales de la próstata 8, incluidos los que no. células transformadas viralmente -tumorigenic de próstata humano epiteliales (PZ-HPV-7) y su contraparte cáncer (CA-HPV-10), 3 líneas de células de cáncer de próstata primario viz. DU145, LNCaP y PC-3 y sus subclones biológicamente agresivos: Dupro, C4-2B y PC-3M, respectivamente. Como se muestra en la figura 3A, los niveles de proteína SATB1 fueron más altos en todas las líneas celulares de cáncer de próstata en comparación con los PZ-HPV-7 células no tumorigénicas. Las líneas celulares de cáncer primario a saber. células CA-HPV-10, DU145, LNCaP y PC-3 expresan aumento 7.94- a 16,82 veces en la expresión en comparación con SATB1 PZ-HPV-7 células. La exposición subclones agresivos 17.0- a aumento 20,53 veces en la expresión SATB1, en comparación con las células no tumorigénicas. También se comparó la citosólica y expresión nuclear de SATB1 en LNCaP y PC-3 subclones sus respectivos C4-2B, y las células PC-3M. Como se muestra en la figura 3B, la expresión de SATB1 en LNCaP y células PC-3 fueron relativamente similar en citosólica y las fracciones nucleares. Por el contrario, se observó un alto nivel de expresión de la proteína SATB1 en la fracción nuclear de la C4-2B subclón agresivo y células PC-3M. Estos resultados están de acuerdo con las muestras de tejido donde la expresión SATB1 significativamente alto nuclear correlacionada con la agresividad de la enfermedad
(A) transferencia Western para la expresión de proteínas SATB1 en diversas células de cáncer de próstata.; CA-HPV-10, DUPRO, DU145, PC-3 epitelial, PC-3M, LNCaP y C4-2B incluyendo transformadas (PZ-HPV-7), células. (B) citoplasmática y nuclear de expresión de la proteína SATB1 se analizó en el cáncer de próstata linaje celular de sus padres y sus subclones agresivos LNCaP y C4-2B; PC-3 y PC-3M que representó mayor presencia nuclear de SATB1 en subclones agresivos. Histona H4 sirvió como control de carga. El análisis densitométrico de cada transferencia se muestra en el panel derecho. Los detalles se describen en "materiales y métodos" sección.
SATB1 Derribo Reduce la agresividad de las células del cáncer de próstata
Hemos investigado si se requiere SATB1 para el fenotipo invasivo de las células del cáncer de próstata. En el experimento, se usaron células PC-3M que expresan altos niveles constitutivos de SATB1 y ARN de horquilla corto (ARNhc) a desmontables expresión SATB1. Utilizamos shRNA a partir de dos secuencias diferentes SATB1 (shRNA1 y shRNA2) y el control shRNA en las células PC-3M altamente agresivos. Como se muestra en la figura 4A, la expresión SATB1 se redujo significativamente por 85,5% y 77,5% en ambos SATB1 shRNA1 y shRNA2, respectivamente, mientras que no hay alteraciones significativas en la expresión SATB1 se observó en las células PC-3M tratados con control de shRNA. Por otra parte, SATB1 caída disminuyó las capacidades de migración e invasión de células PC-3M en comparación con la línea celular de sus padres y las células shRNA de control. La migración y capacidad de invasión in vitro de células SATB1 de ARNm se redujo en un 68 a 80%, lo que correlaciona con aumento de la expresión de E-cadherina y disminución de los niveles de MMP-9 después de shRNA desmontables (Figura 4B). Reducción de los niveles SATB1 en las células PC-3M disminución de la proliferación celular, restaura el crecimiento dependiente de anclaje y volvió a las células a una morfología polarizada como se observa bajo microscopio de luz (Figura 4C).
Se transfectaron células PC-3M cáncer de próstata con y sin ADN (simulacro), o la orientada SATB1 vector de ARNhc 1 y 2 y continuó en cultivo durante 24 h. (A) SATB1, E-cadherina, MMP9 y & lt; beta & gt;-actina expresiones de proteínas totales se analizaron por transferencia Western. (B) SATB1 silenciamiento en células PC-3M se asoció con bajo potencial invasivo y la migración. Barras representan la media ± SE de tres ensayos diferentes. **
P Hotel & lt; 0,001
frente
control. (C) representativos PC-3M células imágenes se muestran con y sin SATB1 shRNA transfección. Los detalles se describen en la sección "Materiales y métodos".
SATB1 Promueve fenotipo agresivo en la próstata Las células epiteliales
A continuación examinó si la expresión ectópica de SATB1 es suficiente para inducir la actividad invasiva en forma viral transformado células epiteliales de próstata humanos no tumorigénicas. PZ-HPV-7 Control de las células fueron transfectadas transitoriamente con pCMV6-A6 verdadera clon de ADN plásmido que contiene SATB1 humana y con SATB1 ARN simulacro. La transfección con el plásmido de expresión SATB1 aumentó la expresión de SATB1 en PZ-HPV-7 células y el aumento de las capacidades de migración y la invasión
in vitro fotos: por 50-67%. SATB1 sobreexpresión en PZ-HPV-7 células dio como resultado la disminución de expresión de E-cadherina y aumento de los niveles de MMP-9 en estas células (Figura 5A-C).
células PZ-HPV-7 fueron transfectadas con y sin ADN (simulacro), o el vector 1 SATB1-específica y continuada en cultivo durante 24 h. (A) SATB1, E-cadherina, MMP9 y la histona H4 expresiones de proteínas se determinaron de la citosólica y la fracción nuclear mediante transferencia de Western. SATB1 sobreexpresión originó un descenso de la expresión de E-cadherina y la expresión regulada por incremento MMP9. (B) La sobreexpresión de SATB1 en PZ-HPV-7 células se asoció con mayor potencial invasor. Barras representan la media ± SE de tres ensayos diferentes. **
P Hotel & lt; 0,001
frente
control. (C) Representante PZ-HPV-7 imágenes con y sin SATB1 sobreexpresión del vector trasfection. Los detalles se describen en la sección "Materiales y métodos".
SATB1 agotamiento inhibe el crecimiento tumoral en ratones desnudos atímicos xenoinjerto
Hemos probado si SATB1 el agotamiento de las células PC-3M inhibió el crecimiento del tumor. Para estos estudios, hemos desarrollado líneas celulares que fueron silenciados de forma estable para la expresión SATB1 usando un sistema de liberación shRNA-lentiviral. Las células se seleccionan hasta 10 pasajes y se utilizaron células anteriores pasaje 11 para los estudios. Se observó una disminución significativa en la expresión SATB1 en las células PC-3M-KO. Desmontables de SATB1 fue más prominente en la fracción nuclear en estas células. células SATB1-KO mostraron un aumento en el tiempo de duplicación de 26,86 ± 4,89 h, en comparación con las células PC-3M con 20,04 ± 4,34 h, respectivamente. También se determinó la capacidad invasiva
in vitro de las células
SATB1-KO. el agotamiento consistente de SATB1 redujo la formación de colonias de estas células en agar blando, lo que indica que la pérdida de SATB1 restaura su crecimiento dependiente de anclaje (Figura S1 A-C).
A continuación procedió a
in vivo
estudios. Las células de control PC-3M y células SATB1 KO se inyectaron a los costados de ratones desnudos para formar tumores. El volumen del tumor se registró en días alternos y el experimento se terminó en 31 días como el tamaño del tumor de los tumores PC-3M era grande, mientras que los ratones inyectados con SATB1 KO clon dado como resultado el crecimiento del tumor se reduce con una disminución en el peso del tumor y el volumen (P & lt ; 0,003) (Figura 6 A-C). También se midió la expresión de la proteína del antígeno de proliferación celular (PCNA), E-cadherina, MMP9 y SATB1 en estos tumores. Como se muestra en la figura 6 D; SATB1 caída resultó en reducción marcada en la expresión de la proteína de PCNA en los xenoinjertos tumorales. Se observó un aumento en la expresión de E-cadherina en los tumores SATB1-KO en comparación con los tumores PC-3M. Estos resultados indican que la expresión SATB1 en las células PC-3M puede ser un requisito para el crecimiento del tumor y la agresividad de estas células.
(A) SATB1 knockout en las células PC-3M resultó en disminución en el volumen del tumor. (B) Fotografía de xenoinjerto de tumor en el PC-3M y tumores SATB1-KO. (C) Los tumores se extirparon, se pesaron y se midieron a la terminación del estudio. El peso del tumor se redujo significativamente en los tumores SATB1-KO en ratones desnudos atímicos. Aproximadamente 1 × 10
se inyectaron 6 células en los flancos de cada ratón para iniciar tumor prostático ectópico como se describe en materiales y métodos ''. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana en dos dimensiones a lo largo del estudio. El volumen del tumor (mm3) y el peso húmedo de los tumores son representados como la media de 8-10 tumores en el control de PC-3M y tumores SATB1-KO PC-3M.