Extracto
El objetivo de este estudio fue determinar el efecto citotóxico y apoptóticos de erythrocarpine E (CEB4), un limonoides extraído de
chisocheton erythrocarpus
sobre el carcinoma de células escamosas oral humana. Basado en bromuro preliminar dimetil-2-tiazolil-2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT) ensayos, se trató CEB4 HSC-4 células demostraron un efecto citotóxico y inhibe la proliferación celular de una manera dependiente del tiempo y de la dosis con una CI
50 valor de 4,0 ± 1,9 micras dentro de 24 h de tratamiento. CEB4 También se encontró que tienen efectos citotóxicos mínimos sobre la línea celular normal, NHBE con niveles de viabilidad celular mantenido por encima del 80% en el momento del tratamiento. Anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC), poli-ADP ribosa polimerasa (PARP) de escisión y de fragmentación de ADN resultados del ensayo mostró que CEB4 induce la apoptosis mediada por la muerte celular. resultados de transferencia Western demostraron que la inducción de apoptosis por CEB4 parecía estar mediada mediante la regulación de la vía de señalización de p53, ya que había un aumento en los niveles de fosforilación de p53. CEB4 también se encontró a un máximo de regular la proteína pro-apoptótica, Bax, mientras que la regulación negativa de la proteína anti-apoptótica, Bcl-2, lo que sugiere la participación de la vía mitocondrial intrínseca. También se observaron niveles reducidos de iniciador de la procaspasa-9 y verdugo caspasa-3 zimógeno después de la exposición CEB4, por lo tanto, lo que indica la participación de citocromo c apoptosis mediada. Estos resultados demuestran la capacidad citotóxica y apoptótica de erythrocarpine E, y sugieren su desarrollo potencial como agente quimiopreventivo del cáncer
Visto:. Nagoor NH, Shah Jehan Muttiah N, Pronto Lim C, En LLA, Mohammad K, Awang K (2011) Reglamento de efectos apoptóticos por Erythrocarpine E, un limonoides citotóxica de
chisocheton erythrocarpus Hoteles en HSC-4 células de cáncer oral humana. PLoS ONE 6 (8): e23661. doi: 10.1371 /journal.pone.0023661
Editor: Paul C. Driscoll, Instituto Nacional para la Investigación Médica MRC, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Mayo, 2011; Aceptado: July 22, 2011; Publicado: 17 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Nagoor et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Universidad de Malasia de Investigación de posgrado Grant (PPP) (PS166-2008B), el Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación Fondo eScience (MOSTI) (12-02-03-2022), la Universidad de Malaya Beca de Investigación (UMRG ) (RG0008 /09BIO), y el Centro de Investigación de productos Naturales y descubrimiento de fármacos (CENAR) Grant (4.911.274). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Varios fitocompuestos naturales han sido seleccionados y ampliamente investigado como potenciales agentes anticancerosos. Aproximadamente el 74% de los medicamentos que fueron aprobados para el tratamiento del cáncer han sido extraídos de fuentes naturales, ya sea creados por la modificación estructural o sintetizados y diseñados a base de compuestos naturales como modelo [1]. La mayoría de los agentes anticancerígenos naturales disponibles hasta la fecha son derivados de plantas, animales, microorganismos y organismos marinos. Algunos ejemplos que se utilizan actualmente de compuestos derivados de plantas con potenciales actividades anticancerígenas son acetato 1'S-1'acetoxyeugenol y acetato 1'S 1 'acetoxychavicol [2], vincristina, irinotecan, paclitaxel y etopósido, mientras que la bleomicina y la doxorrubicina son compuestos antimicrobianos derivados, y citarabine, derivados de fuentes marinas [3].
Un subgrupo de compuestos naturales conocidos como limonoides, están altamente oxigenada derivados triterpénicos tetracíclicos y se han reconocido poseer actividades biológicas interesantes. Hasta la fecha, muchos limonoides se han aislado de una amplia gama de implicaciones biológicas incluyendo insectos anti-feedant, las características inhibidoras de crecimiento y agentes anti-inflamatorios [4]. Varios agliconas cítricos limonoides como limonina, nomilina, obacunona, ácido isoobacunoic y ichangin han sido recientemente sometidos a procedimientos de detección contra el cáncer, y se encontró que induce actividad significativa de quinina reductasa (QR) glutatión-S-transferasa (GST) y en el hígado y la mucosa intestinal de los ratones y las ratas, respectivamente, [5] - [6]. Otros informes incluyen indicaciones que las mezclas de agliconas limonoides con glucósidos limonoides fueron equipotentes al tamoxifeno para inhibir la proliferación de células de cáncer de mama positivo ER, y una potencia aún mayor contra las células de cáncer de mama estrógeno-independiente [7]. También se encontraron Limonoides del extracto etanólico de
Azadirachta indica
(corteza de nim, las hojas y el aceite de semilla) para causar la muerte celular de las células de cáncer de próstata (PC-3) mediante la inducción de la apoptosis a través de una reducción en la expresión de Bcl-2 niveles que corresponden con un aumento en los niveles de Bax [8].
Actualmente, el proceso de apoptosis y su importancia en el cáncer como el modo preferido de la muerte debido a la distancia efectiva de células apoptóticas sin desencadenar la inflamación se ha convertido en una de los campos prioritarios en la investigación del cáncer [9]. Estudios recientes realizados sobre limonoides extraídos de
Citrus aurantifolia
mostraron que la aparición de apoptosis fue mediada a través de la inducción de la caspasa-3, impulsado por la vía intrínseca y la liberación de citocromo-c en las células de cáncer de páncreas humanos [10 ]. El limonoide natural, E erythrocarpine (CEB4) que se utilizó en este estudio, es un A, B, limonoide heptacyclic D-seco con un grupo cinamoílo como la cadena lateral en C-3 extraído de la corteza de
chisocheton erythrocarpus
Hiern de la familia Meliaceae, comúnmente conocido como 'Rongga' en Malasia. Recientemente se ha demostrado que CEB4 induce la actividad citotóxica frente a P-388 células de leucemia murina en IC
50 de 16,0 mg /ml [11]. En este estudio, se investigó CEB4 por su potencial para inducir la apoptosis en las CEH-4 carcinoma de células escamosas oral humana (SCC).
Materiales y Métodos
Material vegetal
chisocheton erythrocarpus
Hiern se recogió de Hutan Simpan Terenas, Kedah, Malasia. La muestra fue identificado por el Sr. Teoh Leng Eng del Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad de Malaya. Un ejemplar de muestra (KL 4863) fue depositado en el Departamento de Química Herbario de la Universidad de Malaya.
Reactivos
medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) con 4,5 g de glucosa /L, 300 mg /l de L-glutamina, 2,5% (v /v) de tripsina en solución salina equilibrada de Hank modificada (HBSS) sin calcio o magnesio, suero bovino fetal (FBS) y todos los antibióticos se adquirieron de Lonza Inc., EE.UU.. Dimetil-2-tiazolil-2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro (MTT) de reactivo, anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC) kit de detección de apoptosis, yoduro de propidio (PI), ARNasa y kit de aislamiento de ADN de escalera SuicideTrack ™ se compraron de Calbiochem (CA, EE.UU.).
Extracción y aislamiento Compuesto Natural History
Dried corteza molida (1,3 kg) de
chisocheton erythrocarpus
se extrajeron sucesivamente con hexano, diclorometano y metanol. A continuación, cada extracto se secó
a vacío
. El extracto de diclorometano se secó (4,0 g) se sometió a fraccionamiento por cromatografía en columna de gel de sílice utilizando una mezcla disolvente de hexano-acetato de etilo. La polaridad de la fase móvil se aumentó gradualmente a acetato de etilo 100%. La fracción eluida de 30% de acetato de etilo, que contenía el compuesto objetivo, se separó por cromatografía preparativa en capa fina (TLC) con hexano-acetato de etilo (7: 3). Para dar erythrocarpine E (4,7 mg)
líneas celulares y condiciones de cultivo
Un conjunto de cinco líneas de células tumorales humanas se utilizaron en este estudio, que comprende HSC-4, 2-HSC líneas celulares de tumores orales y la línea celular tumoral cervical Ca esquí obtiene de la Investigación del cáncer iniciativa de la Fundación (CARIF, Malasia), MCF-7 de adenocarcinoma de mama y hepatocarcinoma HepG2 que se obtuvieron de la Universidad de Malaya Medical Center (UMMC), y las células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE) (Lonza Inc., EE.UU.) utilizados como normales control de células. Para el mantenimiento de rutina HSC-4, HSC-2, las células Ca esquí y HepG2 se cultivaron en DMEM y las células MCF-7 se cultivaron en medio RPMI-1640, con los dos tipos de medios suplementados con 10% (v /v) FBS, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. células NHBE se cultivaron con medio epitelial bronquial basal (BEBM) con 10% (v /v) FBS, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. Las células fueron cultivadas como monocapas a 37 ° C en atmósfera humidificada con 5% de CO
2/95% de aire.
MTT viabilidad celular Ensayo
Los efectos citotóxicos de CEB4 en todas las líneas celulares se determinaron utilizando el método de ensayo de MTT. CEB4 se disolvió en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a una concentración final de 10 mM. Brevemente 1,0 × 10
4 células por 100 l de medios de comunicación se sembraron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en presencia o ausencia de CEB4 a concentraciones finales de 5 mM a 40 mM para un máximo de 24 h. Se añadió MTT (5 mg /ml) a cada pocillo (10 l /pocillo) y las placas se incubaron a 37 ° C durante 2 h. Después de la incubación, el medio se reemplazó con 200 l de DMSO y la absorbancia se midió a 570 nm para cada pocillo utilizando un lector de microplacas (Tecan Sunrise®, Suiza).
Anexina V-FITC /PI Análisis
detección de la apoptosis se realizó usando el kit de detección de Anexina V-FITC /PI apoptosis de acuerdo con el protocolo del fabricante. En pocas palabras, tanto CEB4 tratada y células HSC-4 y NHBE no tratadas fueron cosechadas por tripsinización, se lavaron en 1 x PBS y teñidas con anexina V-FITC y PI. Las células fueron analizadas por citometría de flujo (BD FACSCalibur ™, EE.UU.), utilizando el software de adquisición y análisis BD CellQuest.
Fragmentación del ADN de ensayo
ADN total se extrajo de ambos tratados y no tratados células con CEB4 para 12 y 24 h utilizando el kit de aislamiento de ADN SuicideTrack ™ de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN aislado se analizó en un 1% (w /v) de electroforesis en gel de agarosa y se tiñó con bromuro de etidio. Se observó fragmentación de ADN bajo iluminación UV usando un sistema de documentación de gel (Alpha Inotech, EE.UU.).
Western Blotting
tratada CEB4 HSC-4 células fueron cultivadas a una densidad celular de 80 a 90 % de confluencia, se lavaron con helado de PBS 1x y proteínas extrajo utilizando el Kit NE-PER® nuclear y citoplasmática de extracción (Pierce, EE.UU.). Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el ensayo de proteínas Bio-Rad DC (Bio-Rad Laboratories, USA). Igual cantidad de proteína se sometieron a 12% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron subsiguientemente con nueve anticuerpos primarios contra β-actina, poli-ADP ribosa polimerasa (PARP), p53, fosfo-p53, murino doble minuto 2 (MDM2), Bax, Bcl-2, procaspasa-3 y procaspasa-9 . Después del lavado en solución salina tamponada con Tris y Tween-20 (TBST), peroxidasa de rábano picante (HRP) -vinculada se añadieron anticuerpos secundarios y las proteínas unidas se detectaron a través de señales de aumento de quimioluminiscencia utilizando películas de rayos x. intensidades relativas de todas las bandas se cuantificaron utilizando el software de análisis de imágenes (NIH ImageJ v1.43, Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.).
Análisis estadístico
Todos los resultados se expresaron como media ± S.D.. de los datos obtenidos a partir de tres experimentos independientes. La significación estadística entre los diferentes grupos se determinó usando un modelo lineal. Las diferencias significativas fueron considerados como p = 0.05.
Resultados
Aislamiento y Caracterización de Erythrocarpine E (CEB4)
CEB4 (erythrocarpin E) se aisló en forma de polvo blanco amorfo. La fórmula molecular es C
36H
40O
10, que se determina a partir del [M + H]
+ pico am /z 633,2703 en el bombardeo de átomos rápido espectrometría de masas de alta resolución (HRFABMS) . Las absorciones de infrarrojos a 3413 cm
-1 y 1700-1730 cm
-1 indicaron la presencia de hidroxilo y varios grupos carbonilo. En el
espectro de 1H RMN, se identificaron los picos típicos asociados con el esqueleto de limonoides. La cadena lateral de furano en δ 7,64 (
s
), δ 6,29 (
br s
), y δ 7,30 (
d
, J = 1,5 Hz) se atribuyeron a H-21, H-22 y H-23, respectivamente. Las señales que surgen de protones de metino oxigenados de H-3 en δ 4,91 (
d
, J = 10,2 Hz) y H-17 a δ 5,46 (
s
) eran fácilmente diferenciado y asignado sobre la base de la multiplicidad de señales. Por otro lado, la aparición de un puente de oxígeno que une C-1 a C-29 se consideró rara [11]. Los aislados protones de metileno diasterotopic de H
2 a 29 se detectaron como un par de dobletes a δ 3,46 y δ 3,88, con una constante de acoplamiento de 9,3 Hz. En la subestructura alcohol alílico, la señal olefínico fue encontrado en δ 5,53 (dd, J = 1,7, 7,1 Hz). La cadena lateral cinamato en C-3 se confirmó por la presencia de cinco protones aromáticos en la región δ 7,10-delta 7,20 y la característica de señales de doblete de H-2 'y H-3' en δ 6,25 (
d
, J = 16,0 Hz) y δ 7,58 (
d
, J = 15,7 Hz). La estructura estérea relativa de erythrocarpin E se estableció a través de la espectroscopia de efecto nuclear Overhauser (NOESY). La estructura química de CEB4 se muestra en la Figura 1.
CEB4 inhibe la proliferación de HSC-4 células
Se llevaron a cabo ensayos de MTT para evaluar los atributos citotóxicos y concentración inhibitoria (IC
50) de CEB4 en cinco tumores humanos y líneas de células normales NHBE. Los resultados indicaron que CEB4 induce citotoxicidad de una manera dependiente de la dosis y el tiempo de más de un régimen de tratamiento 40,0 mu M y 24 h de exposición (Fig. 2A y 2B). Se observaron efectos mínimos citotóxicos en las células NHBE, donde se observó aproximadamente 20,0% de destrucción en condiciones de tratamiento similares, en comparación con 95% de destrucción en las células HSC-4 con el IC
50 valor más bajo registrado de 4,0 ± 1,9 M entre todos célula líneas ensayadas (Tabla 1). La viabilidad de las células tratadas con DMSO sin CEB4 se vieron afectados de manera insignificante (& lt; 1,0%) (Fig. 2A y 2B) de este modo de descartar la participación de la citotoxicidad inducida por disolvente. Ambos ensayos dependientes del tiempo y la dosis apoyaron la necesidad de investigar más a fondo los efectos apoptóticos de CEB4 y su potencial como fármaco antitumoral para el tratamiento de cáncer oral. Todos los siguientes experimentos se llevaron a cabo sobre la base de IC
50 valores como los obtenidos a partir de nuestros datos actuales MTT, y se resumen en la Tabla 1.
(A) Dosis gráfica ensayo MTT depende de las 24 h de CEB4 exposición. gráfico ensayo MTT dependiente (B) Tiempo tras el tratamiento con 40,0 M CEB4. Todos los resultados se expresaron como porcentaje total de células viables con una media ± SD de tres determinaciones independientes. controles de disolvente utilizando DMSO se realizó en células HSC-4 como representante de todas las otras líneas celulares.
CEB4 induce la apoptosis mediada por la muerte celular en células HSC-4
A continuación se determinó si los efectos citotóxicos CEB4 se mediada por apoptosis. Un aumento en la tinción celular con FITC conjugado con anexina-V sirve como un marcador temprano de la apoptosis. Las células se tiñeron simultáneamente con PI para investigar la pérdida de integridad de la membrana celular. Este procedimiento de doble tinción distingue las células apoptóticas en etapa temprana (anexina V-positivo) a partir de células apoptóticas en fase avanzada (anexina V-positivo, PI positivo). El tratamiento de la HSC-4 células en IC se encontró
50 concentraciones de CEB4 para inducir la muerte celular por apoptosis a través de la observación de un cambio en la población de células viables a partir de principios de etapa tardía de la apoptosis, seguida de necrosis secundaria (Fig. 3B). El porcentaje de células viables se redujo de 99% a 51%, mientras que las células apoptóticas tempranas y tardías de la etapa aumentó a 21% y 45%, respectivamente. El porcentaje total de apoptosis HSC-4 células fue del 63% después de 12 h. No se observaron cambios en la población en las células después del tratamiento NHBE CEB4 similares (Fig. 3A).
Las células no tratadas (panel superior) y células tratadas (panel inferior) después del tratamiento CEB4 en IC
50 concentraciones de 12 marido. Cuadrantes fueron diseñados como sigue, I: células no teñidas indica células viables; II: anexina V-FITC células que indican apoptosis temprana manchada; III: anexina V-FITC y PI células teñidas que indican la apoptosis tardía; y IV: PI células que indican necrosis secundaria manchado. Todos los gráficos de puntos son una representación de las poblaciones de células iguales (n = 10.000).
CEB4 Induce Endonuclease- y la caspasa-mediada por escisión del ADN y PARP Respectivamente
Debido a la forma diversa y punzones en el que el proceso de apoptosis se pueden manifestar, que también examinó la inducción de la apoptosis en las HSC-4 células a través de la aparición de la fragmentación del ADN y la escisión de proteínas PARP. Hemos observado que el ADN extraído de no tratados HSC-4 células no mostró la fragmentación, mientras que el ADN de HSC-4 células CEB4 tratadas (12 y 24 h) mostró DNA laddering con intervalos de aproximadamente 200 pb presumiblemente como resultado de la acción de endonucleasas en los sitios entre nucleosomas (Fig. 4A). La sospecha de que la activación de la caspasa-3 en la apoptosis inducida por CEB4 también fue validado a través de la expresión y la degradación de una proteína nuclear, PARP. La escisión proteolítica de PARP de longitud completa de un polipéptido de 116 kDa a un fragmento de 85 kDa es un marcador típico para el inicio de la apoptosis, y se observó de una manera dependiente del tiempo en HSC-4 células tratadas con CEB4 (Fig. 4B). Por lo tanto, se confirmó los efectos inductores de la apoptosis de CEB4 en HSC-4 células.
Sin embargo, no se observaron fragmentaciones distintas en el carril 1 indica la ausencia de apoptosis en comparación con los carriles 2 (12 h) y 3 ( 24 h). degradación (B) PARP se observó en diferentes períodos de incubación CEB4. Igual cantidad de proteínas celulares se sometieron a SDS-PAGE, y la degradación de PARP de su forma nativa (116 kDa) a la forma escindida (89 kDa) se detectó mediante análisis de transferencia Western.
Expresión de p53 y otra p53-apoptóticos proteínas relacionadas
Western Blot análisis de CEB4 tratada HSC-4 células se llevó a cabo para examinar el estado de las proteínas p53 y p53-apoptóticos relacionados. Los resultados mostraron que tras el tratamiento CEB4, p53 fosforilada fue elevado, mientras que el nivel del inhibidor de p53, MDM2, se redujo de más de 12 h (Fig. 5A). El nivel de p53 total fue constante en HSC-4 células y se mantuvo sin cambios después de la exposición CEB4. los niveles de expresión de proteínas de la proteína pro-apoptótica Bax se incrementaron después de 12 h de tratamiento CEB4. Por otra parte, se encontró que el nivel de anti-apoptóticos proteína Bcl-2 a disminuir de forma concomitante con el cambio de Bax (Fig. 5B). También se investigó caspasas aguas abajo, y se encontró que la cantidad de iniciador de la procaspasa-9 y verdugo caspasa-3 zimógeno disminuyó simultáneamente con la exposición CEB4, lo que indica la disociación activada de la procaspasa-9 y la caspasa-3 zimógeno (Fig. 5C).
Las células se incubaron con CEB4 para 6 y 12 h, se recogieron en tampón de lisis y se sometió a SDS-PAGE. los niveles de expresión de proteínas se examinaron por análisis de transferencia Western y cuantificados utilizando el software ImageJ empleo de β-actina como control de normalización. (A) Análisis de los niveles de p53 y el inhibidor de MDM2. (B) Análisis de Bcl-2 y pro-apoptóticos los niveles de proteína Bax anti-apoptóticos. (C) Análisis de iniciador procaspasa-9 y el efector caspasa-3 zimógeno niveles. La cuantificación de los niveles de proteína normalizado contra β-actina se muestran en paneles de la derecha.
Discusión
El proceso de apoptosis se ha convertido en la ruta deseada para las células cancerosas a morir, y normalmente se caracteriza por los cambios morfológicos y bioquímicos, tales como formación de ampollas en la membrana, el encogimiento celular, la condensación de la cromatina, la activación de cascadas de proteasas tales como caspasas y endonucleasas, la escisión de PARP [12] y la fragmentación de ADN genómico [13]. La muerte celular apoptótica se ve favorecida, ya que no implica la liberación repentina de mediadores pro-inflamatorios, como en el proceso de necrosis [14]. La inducción de la apoptosis y la inhibición de la proliferación de células de cáncer se han usado como puntos de referencia en la evaluación de las actividades contra el cáncer fitoquímicos, donde en el pasado muchos agentes quimioterapéuticos se han encontrado para efectuar una alteración en la progresión del ciclo celular o la inducción de la apoptosis en las células tumorales [15].
En este estudio, la evidencia de las pruebas de viabilidad de células basado en MTT mostró que erythrocarpine e (CEB4) induce tanto tiempo y dependiente de la dosis efectos citotóxicos en todas las líneas celulares tumorales humanas analizadas, con eficacia siendo el más alto en HSC-4 células. Esta observación invita a una mayor investigación de los efectos apoptóticos de CEB4 y su potencial como fármaco antitumoral para el tratamiento de los cánceres orales. En esta etapa, el origen epitelial de NHBE que tiene similitudes con HSC-4 simplemente sirve como una inicial
in vitro
de control con fines de detección de drogas, mientras que los efectos secundarios fisiológicos reales de CEB4 sólo puede ser evaluada a través
in vivo
estudios. Los efectos citotóxicos de mínimos sobre las células NHBE CEB4 (donde los niveles de viabilidad celular se mantuvo por encima del 80% en el momento del tratamiento) proporcionan una indicación preliminar de la seguridad para su desarrollo como un agente quimioterapéutico. También se llevaron a cabo tres tipos de ensayos para confirmar el mecanismo de la muerte celular de CEB4 en HSC-4 células: anexina V-FITC, la escisión de PARP y ensayos de fragmentación del ADN. Los resultados combinados de estos ensayos indican que la citotoxicidad inducida por los resultados CEB4 de la inducción de la apoptosis.
La siguiente pregunta pertinente sería determinar cómo está mediada apoptosis CEB4 dependientes a nivel molecular? Dos rutas principales de muerte celular programada se pueden distinguir: la vías extrínseca e intrínseca. La acción de p53 se relaciona indirectamente con la vía de la muerte celular intrínseca donde estimula una amplia red de señales que actúa, en parte, a través de la familia Bcl-2 cascada de señalización [16]. Informes anteriores han indicado que las mutaciones en p53 desempeñan un papel fundamental en la iniciación del cáncer y son muy prominente en su vinculación con cánceres como el de colon, pulmón, esófago, mama, hígado, cerebro, tejidos reticuloendotelial y tejidos hematopoyéticos [17].
los resultados de transferencia de Western demuestran un aumento en el nivel de p53 fosforilada y una reducción de su inhibidor, MDM2 lo que sugiere que el modo de la inducción de la apoptosis por CEB4 está mediada a través de la vía intrínseca. Esto se ve reforzado por las observaciones sobre las proteínas mitocondriales, donde Bcl-2 se observó un aumento de los niveles de proteínas pro-apoptóticas, Bax y la reducción de los niveles de proteínas anti-apoptóticas,. La relación entre Bcl-2 y Bax regula la inducción de apoptosis por dimerización entre sí, iniciando así la liberación de citocromo c de la mitocondria [18] - [19]. Además de CEB4, otros compuestos naturales que han mostrado efectos sobre la inducción de la apoptosis mediada por p53 eran curcumina, resveratrol, antocianinas y capsaicina [20]. Estudios anteriores sobre compuestos basados en limonoides de
Citrus aurantifolia
también se han mostrado para inducir la apoptosis a través de p53 inactivación [10], [20].
El mecanismo de acción de los fármacos citotóxicos no lo hace únicamente incluir características tales como el encogimiento celular y la fragmentación del ADN, sino también la activación de moléculas de señalización de p53 conduce a la activación de una cascada de acción de la caspasa [21]. cascadas de caspasa se pueden activar a través de dos ramas principales, ya sea a través de receptores de muerte del TNF-superfamilia de la superficie celular y la proteína pivotal adaptador Fas activa dominio de muerte (FADD) que conduce a la activación de la caspasa-8 y en última instancia, la caspasa-3, o por medio de la liberación de citocromo c (CYTC) de las mitocondrias resultantes de la actividad de la caspasa-9 y la posterior acción de la caspasa-3. Caspasa-3, representa un punto de convergencia entre las dos vías, ya su vez induce la escisión de PARP, roturas en el ADN cromosómico y, finalmente, la ruptura de la célula en cuerpos apoptóticos [22]. Nuestros resultados sugieren que CEB4 ejerce sus efectos apoptóticos actuando sobre caspasas-9 y -3, donde el nivel de longitud completa procaspasa-9 y la caspasa-3 zimógeno se disminuye después de la exposición CEB4, lo que resulta en formas escindidas, activadas de la caspasa-9 ( 37 kDa y 10 kDa) de la caspasa-3 (17 kDa y 12 kDa). Sin embargo, la transducción de señales de apoptosis que implica la señalización del receptor de muerte que resulta en iniciador activado caspasa-8, que a su vez activa zimógeno caspasa-3 no se puede descartar. La mediación de la muerte celular a través de esta ruta podría explicar la observación de una disminución temprana (& lt; 6 h) en procaspasa 3-niveles antes de los cambios en la Bcl-2 y Bax que se producen a las 12 h (Fig 5B y 5C.). Esto también podría significar que la participación de la vía intrínseca sirve como una etapa de amplificación hacia la muerte inicial de señalización a través de la vía extrínseca tras la exposición CEB4.
Llegamos a la conclusión de que CEB4 induce citotoxicidad mediante la muerte celular por apoptosis en las CEH-4 cáncer oral células, y que la inducción de la apoptosis se produce por la activación de p53, lo que desencadena la vía intrínseca a través de Bcl-2 y Bax, y finalmente a través de la caspasa-9 y -3 de activación. Nuestros datos indican el potencial para el desarrollo de CEB4 como un nuevo fármaco potencial contra el cáncer contra el cáncer oral humana, si bien los trabajos en
in vivo
efectos de seguridad y farmacocinética es necesaria antes de CEB4 puede evaluarse plenamente en una clínica ajuste.
Reconocimientos
Nos gustaría reconocer Datuk Prof. Dr. A. Hamid A. Hadi, del Centro de Investigación Natural del producto y de Descubrimiento de Medicamentos, Universidad de Malasia por su contribución a la descubrimiento del compuesto CEB4. Además, la Sra Norahayu Othman y la Sra. Yap Seow Hui, del Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad de Malasia por sus contribuciones durante la proyección citotoxicidad y la vía de análisis de esta investigación.