Extracto
MYC expresión de alto nivel se asocia con casi todos los cánceres humanos. JQ1, un compuesto químico que inhibe la expresión MYC es terapéuticamente eficaz en modelos animales preclínicos en carcinoma de la línea media, y de Burkitt linfoma (BL). Aquí mostramos que JQ1 no inhibe MYC expresión en un grado similar en todas las células tumorales. Las células BL mostraron una disminución ~ 90% en la transcripción MYC tras el tratamiento con JQ1, sin embargo, no la correspondiente reducción se observó en varias células no BL. Molecularmente, estas diferencias aparecen debido a los requisitos de Brd4, la versión más activo de la positiva de la transcripción del factor de elongación B (P-TEFb) dentro de la súper Alargamiento Complex (SEC), y factores de transcripción tales como Gdown1, y MED26 y también otra célula desconocida factores específicos. Nuestro estudio demuestra que la regulación de los altos niveles de expresión de MYC en células de cáncer de diferentes es impulsado por mecanismos de regulación únicos y que tales firmas reguladoras exclusivos en cada las células cancerosas podrían emplearse para terapias dirigidas
Visto:. Fowler T, Ghatak P, Precio DH, Conaway I, J Conaway, Chiang CM, et al. (2014) Reglamento de
MYC
Expresión diferencial y JQ1 sensibilidad en las células cancerosas. PLoS ONE 9 (1): e87003. doi: 10.1371 /journal.pone.0087003
Editor: Arun Rishi, Wayne State University, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Septiembre, 2013; Aceptado: 16 de diciembre de 2013; Publicado: 23 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Fowler et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de CM. C (NIH CA103867, CPRIT RP110471, y Welch Fundación I-1805), y A.L.R (Asociación Americana del Corazón, 12GRNT12180023). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. J.E.B. tiene una asignación de capital minoritario en Tensha Terapéutica. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales
Introducción
Los linfomas se clasifican en dos categorías:. Hodgkin y el linfoma no Hodgkin (LNH) [1]. Las dos formas más comunes de linfoma no Hodgkin agresivo son el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) y el linfoma de Burkitt (BL) [1], [2], [3]. Translocación del proto-oncogen
MYC
en uno de los loci de genes de inmunoglobulinas [
IG-MYC
translocación; la mayoría de la t (8; 14) Q24; tipo q32] resultando en aberrante
MYC
expresión se considera como el evento genético dominante en la génesis de BL y aproximadamente 10% de DLBCL [4]. Además de la translocación,
Myc
puede someterse a la desregulación oncogénica a través de la amplificación de genes de alto nivel, así como mutaciones en cis-elementos reguladores en varios tipos de cáncer (por ejemplo, mieloma, carcinoma de colon y neuroblastoma) [5], [6] . Por otra parte, mientras la mayoría de BLS han desregulado c-
MYC gratis (en adelante,
MYC
) expresión como consecuencia de un
IG-MYC
translocación, la mayoría de los no -BLs no llevan
IG-MYC
translocaciones, pero otras anomalías genéticas que conducen a desregulado
MYC
expresión. A pesar de la alta expresión está restringida a BLS, MYC expresión diana varía en un nivel inferior a través de los linfomas no-BL e intermedios y constituye un marcador pronóstico negativo en estos linfomas.
dimeriza con MYC MAX para unirse a su secuencia diana (E -box) y regular la expresión génica. MYC no sólo activa la transcripción sino que también reprime la expresión del gen diana ya sea a través biding directa (con Miz-1 factor de transcripción) o por medio de la regulación de la micro-ARN (MIR) [7]. Sin embargo, la función de MYC se complica como dos estudios recientes muestran que MYC no tiene una firma transcripcional específico, sino que sirve para amplificar la salida de los programas transcripcionales existentes en una célula dada en lugar de ejecutar su propio programa transcripcional [8], [9] .
MYC
pertenece a una clase de genes llamados genes de respuesta primaria (PRG) muchos de los cuales puerto pausa Pol II en la zona proximal promotor que tras la activación puede cambiar rápidamente a un alargamiento de Pol II y la transcripción funcional [10]. Señal dependiente resultados de la estimulación en la acetilación mejorada en la histona 3 lisina 14 (H3K14Ac) y cualquiera de dos pares de lisina H4, H4K5 /12 o H4K8 /16, un evento que parece ser crucial para la unión de bromodomain (BRD) proteínas que reclutan factores de transcripción necesarios para la transcripción [11], [12]. El reclutamiento de transcripción positivo factor de elongación b (P-TEFb), y, posiblemente, la iniciación Mediador general cofactor, juega un papel importante en la transcripción regulada Brd4 de muchos genes incluyendo
MYC
. De hecho, después de la contratación por Brd4, P-TEFb fosforila el alargamiento factores DSIF (SPT4 y Spt5), factor de elongación negativo (NELF), y Pol II resulta en la liberación de pausa Pol II y la posterior elongación de la transcripción [10], [13] y recientemente revisado en [14]. En conjunto, estos y otros resultados sugieren que la elongación de la transcripción es un punto crítico en la orquestación de regulación
MYC
regulación [10].
A medida que se requieren muchos procesos MYC impulsada para la homeostasis y el crecimiento, terapéutica las estrategias orientadas a la modulación de
MYC
expresión más que la supresión pura y simple parecen atractivas. El Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation describe primero tienodiazepina análogos que inhiben la unión de potentemente bromodomains relacionadas con la familia BET [15] de la cromatina. Posteriormente, un inhibidor de pequeña molécula estrechamente relacionados, JQ1, se ha encontrado que es terapéuticamente eficaz en modelos animales preclínicos [16], [17], [18]. Estas y otras pequeñas moléculas competitivamente ocupan los bolsillos de unión de acetil-bromodomains BET, que resulta en la liberación de proteínas BET (en particular Brd4) a partir de la cromatina [19]. A pesar de estas manifestaciones prometedores, JQ1 no inhibe
MYC
expresión en un grado similar en todas las células tumorales [19]. Por lo tanto, es importante comprender por qué JQ1 es eficaz en sólo ciertos
MYC
dependientes de cánceres, lo que puede en última instancia, determinar la eficacia clínica de este compuesto en los pacientes.
Hemos observado que aunque el tratamiento JQ1 disminuyó Brd4 ocupación en un grado similar en los tipos de células probado, la capacidad de JQ1 para reducir
MYC
transcripción entre células diferentes. En las células JQ1 sensible, la inhibición ocurrió a nivel de la transcripción naciente que afecta Pol II, "pausa" Pol II-Ser5-P, "alargamiento" ocupación Pol II-Ser2-P, y P-TEFb. Además, hay una diferencia en la ocupación de los miembros de la super Alargamiento Complex (SEC), y los factores asociados con la RNA polimerasa II, a
MYC
regiones promotoras en los dos tipos de células. En conjunto, nuestros datos indican altos niveles de
MYC
se mantienen en diferentes células de cáncer a través de mecanismos diferentes a nivel de elongación de la transcripción con diferentes cumplidos de factores de transcripción y por lo tanto están sometidos a diferente sensibilidad JQ1.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
La madura de ratón linfoma de células B BAL17 [20], las líneas BL humanos Akata [21], Raji [22], y Ramos [23], y humana línea epitelial HeLa-S3 [24] se cultivaron en medio RPMI con HEPES (Invitrogen) suplementado con 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, 1 mM de piruvato sódico, solución 0,5 mM 2-mercaptoetanol (Invitrogen) y 10% fetal Becerro Sera (Atlanta Biologicals). Los ensayos basados en ARN utilizaron 1-2 × 10
6 celdas y 2 × 10
se utilizaron 7 células por inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP). JQ1, solubilizado en DMSO, se diluyó en los medios de comunicación a 1 mM y se incubó con las células durante 2 horas a 37 ° C. No se observaron efectos sobre la transcripción con los controles de DMSO (datos no mostrados). Los experimentos mostrados en la Figura S1 (File S1) que implica la estimulación BCR consistieron en un 2 hr pre-tratamiento con JQ1 1 M seguido de 30 minutos de exposición a fragmentos de anticuerpos específicos para cualquiera de BCR humano o de ratón (Jackson Immunoresearch).
Análisis de ARN-PCR en tiempo real
realizaron como se describe anteriormente [25]. Los valores de Ct se promediaron y la señal informaron como la relación de objetivo a lo largo ACTB mRNA a través de ecuaciones lineales específicos para cada par de cebadores. Myc cebadores se enumeran en S3 (Archivo S1) a menos que se muestra a continuación.
ARNm cebadores ratón
Myc Los cebadores que se señalan en la figura S3 (Archivo S1)
In1 /Ex1 5'-AGAGCTCCTCGAGCTGTTTG
5'-CGTCTACATTCAAGACGCAGA
Actb 5'-AGGCATGGAGTCCTGTGGTATC
5'-AGCCACAGGTCCTAAGGCCAG.
Fos-5 'GGATTTGACTGGAGGTCTG
5 'TGGGCTCAGGGTCGTTGA
Los cebadores ARNm humano
Myc Los cebadores que se señalan en la figura S3 (archivo S1)
In1 /Ex2 5'-GCACCAAGACCCCTTTAACTC
5'-TCCTGTTGGTGAAGCTAACGEx2 /In2 5'-AGCGACTCTGGTAAGCGAAG
5'-GTGGCCCGTTAAATAAGCTG
Actb 5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT
5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG
Fos 5'-CTCCGGTGGTCACCTGTACT
5'-GTCAGAGGAAGGCTCATTGC
extrae Western Blot
Nuclear de 2 × 10
6 células fueron sometidas a 10% (Myc) o el 6% (Brd4) SDS-PAGE seguido de transferencia Western. Los anticuerpos primarios (de conejo anti-C-terminal Brd4-C IgG y de conejo anti-Brd4-S484 /488-phos) [26], [27], anti-CREB IgG (señalización de la célula) de conejo y secundario de rábano picante anti-conejo de cabra ( peroxidasa ligada anticuerpos IgG, Invitrogen) a 1:1500. Las transferencias se visualizaron con el kit ECL Novex quimio-luminiscentes Regent Sustrato (Invitrogen) y densitometría realizada con el sistema de imágenes MP ChemiDoc (BioRad).
Strand-específica Detección
380 ng de ARN con se emplearon 1 M primer concentración final para cada reacción de RT utilizando el kit de síntesis clonadas AMV primer capítulo de Invitrogen. cebadores específicos de cadena; para la cadena (+) los cebadores inversos correspondientes al área de TSS (+17 +11 para ratón y humano) y para los de cadena (-) cebadores directos correspondientes al final del gen (+3948 +4791 de ratón y de ser humano, secuencias en la Figura S3, S1 en archivo). Tiempo real la amplificación PCR estándar de la se empleó con los cebadores indicados y sus compañeros, que se muestran en la Figura S2 (File S1), y los valores de Ct resultantes se convirtieron en ng relativa y normalizada a la concentración inicial de ARN cromosómico.
inmunoprecipitación de cromatina (cHIP)
Un chip de ensayo estándar se realizó y se ha descrito anteriormente [25]. cebadores de PCR y el esquema se muestran en la Figura S3, S1 en Archivo. Los valores de Ct se promediaron y la señal representados como% de ADN de entrada a través de ecuaciones lineales específicos para cada par de cebadores.
chip anticuerpos
policlonal de conejo anti-ratón de ARN Pol II (N-20, sc -899, Santa Cruz), ARN Pol II-Ser5P monoclonal de ratón (SC-47701, Santa Cruz), ARN Pol II-Ser2P H5 ascitis de ratón (Covance), H3K36me3 policlonal de conejo (ab9050, Abcam), anti-ciclina T policlonal de conejo (H-245, SC-10750, Santa Cruz), de conejo anti-C-terminal BRD4 IgG [27], MED26 ratón anti-MED26 /CRSP7 (Ab50619, Abcam), Gdown1 oveja anti-IgG Gdown1 [28], anti- AFF4 de anticuerpos [29] y anti-anticuerpo ELL2 [29].
Análisis de secuenciación
Figura S2 (archivo S1) muestra la secuencia de datos derivados de la Universidad de California en Santa Cruz Genome Browser (UCSC GB) datos de pistas "wgEncodeUtaChIPseqBaseOverlapSignalHelas3Pol2" (HeLa S3) y GEO establecen GSM920942 (Raji), mapeado en el genoma hg18 acumulación humana. La Universidad de California Navegador Web Santa Cruz Genoma ajuste normalizado al pico más alto en el SAT.
Resultados
JQ1 diferencial de sensibilidad
Hemos realizado pruebas de dosis-y tiempo-dependiente de la inhibición Brd4 con JQ1 y observó el efecto sobre
MYC
la transcripción en una variedad de células incluyendo las células HeLa-S3, cuya expresión MYC se informó [19] para ser resistente al tratamiento JQ1. Se muestra en la Fig. 1A, las líneas celulares ensayadas expresan
MYC
en niveles altos, comparables a los niveles detectados en el pico de la inducción de células B en reposo naïve primario (datos no mostrados). los niveles de mRNA en el estado estacionario de
MYC
en un murino línea de linfoma de células B no BL (BAL17) que más rápidos
MYC
en niveles similares a las células HeLa y células BL no mostraron una sensibilidad significativa a JQ1 (Fig. 1A). Tanto HeLa y células continuaron BAL17 esta resistencia a concentraciones de hasta 5 M (datos no mostrados), mientras que
MYC
RNA en células BL se redujo de manera uniforme por ~ 90% cuando son tratados con 1 M de JQ1 por un período de dos horas (Fig. 1A). se reportan las células BL expresar de 2 a 5 veces más
MYC
ARN específico de que las líneas de células B sin una translocación [30]. Aunque la transferencia Western d indica la línea Raji BL expresa más proteína MYC, consistente con los datos de ARNm (Fig. 1A), el tratamiento JQ1 disminución de la expresión de proteínas MYC en Raji pero no HeLa y BAL17 (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados demostraron que la resistencia JQ1 se produjo en ambas líneas celulares no Hodgkin y linfoma representa especies tanto murinos y humanos.
BAL17 (murino de células B), HeLa humana, y humana BL Raji células y, o bien no tratados o tratados con 1 M de JQ1 durante 2 horas. análisis (A) mRNA se realizó por triplicado, informó en relación con la expresión de mRNA ACTB y se muestra como la media y la desviación estándar de tres experimentos. (B) Detección de la transcripción primaria mediante amplificación por PCR usando los cebadores a través de exón interna /fronteras intrón de
MYC
se realizó tres veces y informó en relación con la expresión de mRNA ACTB. (C) la transcripción Strand-específica se detectó mediante amplificación por transcripción inversa específica hebra como se detalla en Material y Métodos seguido de métodos de PCR estándar. Estos experimentos se realizaron dos veces.
Debido a que la producción de ARNm no necesariamente se correlaciona con la producción transcripción primaria [25], [31], hemos probado el efecto de JQ1 en la transcripción primaria. Análisis de transcripción primaria, realizada con los cebadores contra las fronteras exón /intrón de
MYC
(representado esquemáticamente en la Supplemental Fig. 3 y /o indica en Materiales y Métodos), mostró que la sensibilidad de la transcripción primaria a JQ1 fue paralela a la de mRNA (Fig. 1B). Por lo tanto, mucho tiempo, y, presumiblemente, de larga duración, transcritos primarios eran o resistentes (BAL17 o HeLa) o sensibles (Raji) para JQ1. Por lo tanto, la diferencia en las respuestas JQ1 correlacionada con la transcripción primaria y no se produjo en el nivel de modificación post-transcripcional, tales como corte y empalme y el ARNm o la estabilidad de proteínas.
transcripción divergente es común de muchos promotores en los organismos y obras de teatro un papel importante en la regulación de genes [32]. De hecho, la transcripción antisentido a partir de la
MYC
locus se ha observado en varias líneas de células [33]. Debido a que sólo mide de ARN total en estado estacionario (Fig. 1A), si la sensibilidad diferencial JQ1 refleja las diferencias en la transcripción posible originario desde el extremo 3 'fue probado. Aunque la transcripción antisentido tanto en células HeLa BAL17 y era pequeña en comparación para detectar la transcripción, que era en gran parte no afectado por JQ1 (Fig. 1C, los paneles de media izquierda y). La amplia diferencia en los niveles de transcritos sentido y antisentido observadas entre diferentes líneas celulares es actualmente inexplicable pero podría reflejar una combinación de efectos transcripcional y post-transcripcional. Independientemente, como la transcripción sentido, la transcripción antisentido procedente de la
MYC
locus en células Raji fue inhibida por JQ1 (Fig. 1C, panel derecho). Por lo tanto, aunque más de transcripción antisentido se observó en las células Raji, la diferencia de sensibilidad JQ1 no era probablemente debido a las diferencias en las transcripciones antisentido.
JQ1 conduce a la disminución Brd4 Ocupación en células resistentes y sensibles
Hemos observado que el reclutamiento Brd4 se redujo en JQ1 en ambos tipos de células, por lo tanto-, la diferencia de sensibilidad entre diferentes células JQ1 no fue debido a la permeabilidad. También se observó que el reclutamiento Brd4 al sitio de inicio de transcripción (TSS) fue aproximadamente 2,5 veces más en Raji (+11) las células en comparación con BAL17 (17) (Fig. 2A). HeLa exhibió Brd4 reclutamiento y la sensibilidad JQ1 similar a BAL17 (datos no mostrados). Por otra parte, una cantidad significativa de ocupación Brd4 se observó a través del cuerpo de
MYC
en todas las células de la prueba, aunque no había un nivel más alto de codificación de ocupación región en BAL17 células. Aunque comúnmente asociados con potenciadores de extremo 5 'y promotores, Brd4 se ha demostrado que ocupar la región de codificación de PRGs como C-
fos
y
MYC
[26].
Las células se dejaron sin tratar o se trataron con 1 M de JQ1 durante 2 horas. (A) Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) a través de
MYC
con el anticuerpo anti-Brd4 C-terminal. Cada experimento se realizó dos veces, se analizaron por triplicado a través de PCR en tiempo real y informado que la media y la desviación estándar de los dos experimentos. Se proporciona una representación de la zona promotora del
MYC
para la orientación. (B) de Western blot para detectar (a la izquierda) Brd4 (~ 180 KD) y (medio) Brd4-S484 /488-Phos (P-Brd4, ~220 KD) se realizó tres veces. Una banda no específica detectada con el anticuerpo phopsho-Brd4 se denota con un asterisco. Los resultados típicos se muestran con análisis de densitometría relativa a la expresión de CREB, que se utiliza como una normalización de control (a la derecha).
Promotor de contratación Brd4 requiere la fosforilación en S484 y S488 y la supresión de esta región en los resultados disminuido CycT y Pol II de ocupación y la transcripción [26]. En consonancia con el chip de ensayo, la transferencia Western mostró un nivel más alto del total Brd4 en extractos nucleares Raji en comparación con HeLa y BAL17, aunque Brd4-S484P /S488P en células Raji fue ligeramente menor en comparación con BAL17 y HeLa (Fig. 2B). Curiosamente, la banda P-BRD4 en las células HeLa migra más rápido que sea el Raji o banda BAL17 P-Brd4, quizás reflejando una ligera diferencia en la extensión o en el sitio de fosforilación. Sin embargo, la diferencia en Brd4 fosforilada (la forma activa) entre diferentes células no podría explicar las diferencias en la sensibilidad JQ1.
Brd4 interactúa con factores que, o bien recluta Pol II al sitio de la transcripción o una unidad transcripcional del complejo de haciendo una pausa para el modo de alargamiento (revisado en [10]). Además, se demostró una reducción de Brd4 funcional que resulta en gran medida reducida ocupación de Pol II implicar una pérdida de P-TEFb [26]. Aunque el nivel y el patrón de ocupación P-TEFb en ambos tipos de células sensibles y resistentes JQ1 sin tratar fueron similares, el tratamiento JQ1 /inhibición Brd4 disminuyó ocupación P-TEFb sólo en las células Raji (Fig. 3). Estos resultados indicaron niveles de BRD4 dependencia del mantenimiento de ocupación P-TEFb variar en diferentes líneas de células (Fig. 3).
BAL17 y células Raji se dejaron sin tratar o se trataron con 1 M de JQ1 durante 2 horas. El reclutamiento de P-TEFb fue detectado por los ensayos de chip. Cada experimento se analizó por triplicado mediante PCR en tiempo real, lleva a cabo dos veces, y se reporta como la media y la desviación estándar de los dos experimentos.
ARN Pol II Reclutamiento
A continuación determinado si la diferencia en la selectividad JQ1 era debido a una diferencia en el reclutamiento general aparato de transcripción, representada por la ARN polimerasa II (Pol II). Mientras que el total de Pol II se redujo en gran medida a través del cuerpo de
MYC Hoteles en células Raji por tratamiento JQ1, no fue alterada en la línea BAL17 resistentes JQ1 (Fig. 4A). Ambos tipos de células mostraron ocupación Pol II en el P
0 promotor, que se ha demostrado que se correlaciona con un nivel muy alto de la transcripción [34]. Muchos genes transcritos activamente (incluyendo
MYC
) exhiben una pausa Pol II en sus proximal promotores [35]. En consonancia con esta idea, se observó un alto nivel de Pol promotor asociado II en ambos tipos de células, aunque dos veces más Pol II se observó en el promotor proximal (que corresponde aproximadamente a la P
0 promotor de la región) en BAL17 ( -354) en comparación con Raji (-279). Curiosamente, como se ha señalado con Brd4 y P-TEFb (. Figs 3 y 4), el total de Pol II se redujo en un sitio inmediatamente aguas abajo (0,6 kb) de la TSS y aumentó bruscamente después (Fig. 4A).
Las células se dejaron sin tratar o se trataron con 1 M de JQ1 durante 2 horas. (A) Pol II se detectó por el anticuerpo contra el N-terminal de la segunda (B) Pol II Serine 5-P (C) Pol II Serine 2-P Pol. Chip ensayos de la cromatina se realizaron por duplicado. Cada experimento se analizó por triplicado a través de PCR en tiempo real, realizó dos veces, y se informa como la media y la desviación estándar de los dos experimentos.
Debido a que la fosforilación del dominio carboxi-terminal (CTD) de ARN Pol II se asocia con la regulación de la transcripción de iniciación y elongación a muchos promotores [36], [37], se analizaron estos eventos en los dos tipos de células en ausencia y presencia de JQ1. Si bien los niveles de ARN Pol II fosfo-Ser5 (Pol II) en S5P BAL17 células se mantuvieron estables después del tratamiento JQ1, los niveles de Pol II S5P en células Raji fueron sensibles a JQ1 (Fig. 4B). Sin embargo, sorprendentemente, los niveles de Pol II S5P eran refractarios a P
0 y sitios de TSS (Fig. 4B, panel derecho) pero sensible en la segunda mitad del gen con un pequeño cambio a partir de aguas abajo de la
MYC
promotor P3 (2244) y cada vez más sensible más abajo en el cuerpo del gen. Si la cantidad sustancial de Pol II-Ser5P 3 'de ocupación que se muestra aquí es directamente debido a 3' Brd4 ocupación o una sobreabundancia de complejos de transcripción "copias de seguridad" resultando en la reducción de elongación y posterior haciendo una pausa en el extremo 3 'es desconocido.
Mientras que la fosforilación Ser5 se asocia con una competente pero se detuvo Pol II, fosforilación Ser2 de la Pol II CTD (Pol II S2P) representa el alargamiento de Pol II [37]. En ausencia de JQ1, Pol II S2P ocupación en ambos tipos de células se produjo a través del cuerpo del gen con picos en las regiones promotoras, y el extremo 3 '. Sorprendentemente, mientras que Pol II niveles S2P promotor-y asociados con TSS en células Raji fueron sensibles a JQ1, las regiones aguas abajo pasados P
3 no mostró sensibilidad JQ1 hasta más allá de la 3 'UTR (5472) (Fig. 4C), lo que sugiere que la mayoría de alargar completamente la ARN polimerasa II en estas células sensibles JQ1 refractaria a JQ1. También se observó un aumento dependiente de JQ1 en Pol II-Ser2P en la línea BAL17 y si bien este aumento fue leve en el SAT regiones promotora y, fue muy claro en el extremo 3 '.
Las diferencias en H3K36me3
una posible manera de delimitar entre los efectos aguas arriba y aguas abajo en ocupación Pol II-Ser2 es para determinar el patrón de tri-metilación de la lisina residuo histona 3 36, H3K36me3, lo que es indicativo de un complejo de transcripción alargamiento recientemente pasando [37]. En BAL17 células, el tratamiento JQ1 mejorado las señales H3K36me3 de todo el gen (Fig. 5). Sin embargo, en las células Raji, el tratamiento disminuyó JQ1 H3K36me3 de P
0 a TSS hasta que el P
3 región. Sin embargo, más allá de P3, la H3K36me3 convirtió refractarios a JQ1 (Fig. 5) como se observa con Pol II S2P (Fig. 4C), lo que sugiere que una vez que el ARN Pol II estaba en modo de alargamiento, que era insensible a JQ1. En conjunto, nuestros datos muestran que
MYC
complejos de transcripción con albergado variable de dependencia Brd4 en diferentes tipos de células y que la inhibición Brd4 resultó en una respuesta diferencial en el nivel de transición de la pausa para la elongación.
Células se dejaron sin tratar o se trataron con 1 M de JQ1 durante 2 horas. Chip ensayos se realizaron por duplicado. Cada experimento se analizó por triplicado mediante PCR en tiempo real, lleva a cabo dos veces, y se reporta como la media y la desviación estándar de los dos experimentos.
accesorios factores de transcripción elongación
P- TEFb frecuencia funciona como una subunidad de Súper Alargamiento Complejos (SEC), que consta de P-TEFb y una mezcla de uno de los tres miembros de la familia de ELL, uno de los dos miembros de la familia EAF, uno de los dos miembros de la familia AF4 (AFF1 y AFF4), y ya sea ENL o AF9 [29], [38]. Como se informó a la familia de la SEC de Pol II factores de elongación para contener las versiones más catalíticamente activa de P-TEFb activos en la transcripción de alto nivel y para regular una etapa puesto de control de la transcripción asociada a la elongación [29], [39], [40] , nos fijamos en el reclutamiento SEC en
MYC
en diferentes tipos de células. AFF4 se informa para servir como una plataforma de unión central para factores de elongación en muchas formaciones de la SEC y para apuntar
MYC
y regular su expresión en las células del cáncer [39]. El grado de ocupación AFF4 en BAL17 células era baja y refractarios a JQ1 (Fig. 6A, panel superior), pero aumentó en presencia de JQ1. Por el contrario, AFF4 reclutamiento en las células Raji fue mucho mayor y sensible a JQ1. Aunque la ocupación promotor AFF4 en células Raji, en particular alrededor de 2.244 sitio, fue variable en ausencia de JQ1, se redujo significativamente en presencia de JQ1. Por otra parte, en consonancia con los resultados S2P y H3K36me3 Pol II, la sensibilidad JQ1 se perdió más allá de la región P
3 promotora (2244), una vez más, lo que sugiere que el complejo de transcripción elongación refractaria a JQ1 (Fig. 6A, panel inferior) .
Las células se dejaron sin tratar o se trataron con 1 M de JQ1 durante 2 horas. (A) AFF4 fue detectado por el chip a través de la longitud de la
MYC
gen tanto en las células BAL17 y Raji. (B) Detección de AFF4, ELL2 y MED26 en las regiones promotoras de células HeLa y Raji sin tratar humanos. Chip ensayos se realizaron por duplicado. Cada experimento se analizó por triplicado mediante PCR en tiempo real, lleva a cabo dos veces, y se reporta como la media y la desviación estándar de los dos experimentos.
Nos miramos posteriormente la ocupación de otro componente de la SEC, ELL2, que ha sido informado a desempeñar un papel en la transición de la Pol II pausa a la elongación [40]. También probamos la ocupación de la componente Mediador (MED26), así como Gdown1. Aunque la primera vinculada a la iniciación, un papel de mediador en el reclutamiento de Pol II factores de elongación de la transcripción y la fosforilación de la Pol II CTD regulación de Pol II pausa y el alargamiento ha surgido [41]. El complejo mediador más fuertemente asociado con Pol II incluye MED26, que se ha demostrado que aumenta la activación de la transcripción in vitro en un grado mayor que otras formas del complejo mediador y desempeñar un papel clave en el reclutamiento de SEC y MYC transcripción [41]. Gdown1 es una proteína de unión Pol II demostrado ser necesaria para una respuesta mediador dependiente de la activación de la transcripción [42]. Más apropiado para este estudio, Gdown1 Recientemente se ha demostrado que aumenta la estabilidad de pausa Pol II y regular la actividad de P-TEFb [28].
Debido a que los anticuerpos disponibles contra ELL2, Med26 y Gdown1 eran especies (humana) específico, se emplearon células HeLa y Raji para estos experimentos. Dadas las diferencias se centraron alrededor de la región P3, nos centramos en la región general del promotor (P
0, SST, y P
3) para poner a prueba las diferencias entre estas líneas celulares. Como se observa para BAL17 células, las células HeLa mostraban reclutamiento bajo AFF4 en esta región en comparación con las células Raji (Fig. 6B). En consonancia con los resultados de reclutamiento AFF4, aumentó ELL2 ocupación cerca de P
3 se observó en células Raji comparación con las células HeLa. MED26 ocupación mostró un patrón similar a la de otros componentes de la SEC con un aumento, aunque más modesto, cerca de la P
3 promotor en células Raji (Fig. 6B). Por último, se observó que Gdown1 siguió un patrón similar al de la SEC y Mediador con un aumento en todo el P
3 promotor en células Raji (Fig. 6B).
Discusión
Debido a la importancia de
MYC
en la génesis de tumores malignos hematopoyéticos, los intensos esfuerzos se han dirigido a las dos últimas décadas hacia la comprensión de su regulación. Sin embargo, dado que
MYC
sobreexpresión es causada por una gran cantidad de lesiones genéticas, un conjunto uniforme de normas que regulan su regulación transcripcional A continuación puede encontrar. Los avances recientes en esta área incluyen el descubrimiento de un inhibidor de molécula pequeña, JQ1 que disminuye MYC
expresión
y es terapéuticamente eficaz en modelos animales preclínicos de carcinoma línea media y en células BL. Sin embargo, no inhibe JQ1
MYC
expresión en un grado similar en todas las células cancerosas, destacando además que
MYC
la transcripción es tal vez bajo diferentes controles en varios tipos de células cancerosas. En consonancia con esta idea, hemos descubierto que inhibe JQ1
MYC
expresión en todas las células derivan BL-probados, pero no inhibe
MYC
expresión en algunas otras líneas celulares de cáncer, como se ha observado anteriormente (19) . Debido a
MYC
desregulación puede ocurrir a través de diferentes modos, la hipótesis de que, en fenotipos distintos, linfoma de alto nivel de
MYC
expresión puede verse sometida a los controles de diferente transcripcional y mecanismos de regulación epigenética, que puede ser sensible o resistente a la inhibición JQ1 /Brd4. En este estudio, hemos explorado estos mecanismos para establecer
MYC
transcripcional y firmas epigenéticos asociados con tipos particulares de células con la esperanza de que estas firmas serán definir mejor los subtipos de linfoma y proporcionar nuevas vías terapéuticas para explorar para los linfomas de células B clínicamente agresiva .
Aunque las células BL son un grupo heterogéneo con diferencias en la longitud de Ig translocación /MYC, que al parecer se traducen en niveles variables de
MYC
sobreexpresión [43], las células BL en nuestras manos (Fig . 1 y Figura S1, S1 en el archivo), y otros [19], son uniformemente sensibles a la inhibición de
MYC
expresión a través de la inhibición por Brd4 JQ1. Esta inhibición parece ser, independientemente de si se trata de EBV líneas BL positivos o negativos (nuestro estudio y ref 19). Brd4 se asocia principalmente con los promotores del extremo 5 'y potenciadores [44], [45], [46], y mientras lo hacemos ver un nivel más prominente de Brd4 en el SAT en las células Raji (Fig. 2), se observa también Brd4 ocupación a través del cuerpo de la
MYC
gen en las células resistentes JQ1 (Fig. 2). Una función de Brd4 es P-TEFb reclutamiento y la ocupación P-TEFb hace paralelo Brd4-inhibidor sensible
MYC
transcripción, a pesar del hecho de que hay poca diferencia en la ocupación P-TEFb en las células no tratadas de resistente o sensible Células. Por lo tanto, parece que en las células resistentes a JQ1, un mecanismo independiente de Brd4 opera para reclutar o retener P-TEFb y producir altos niveles de
MYC
transcripción.
Debido a que los componentes de la SEC y AFF4 ELL2 jugar un papel en
regulación MYC Opiniones y elongación transcripcional, la hipótesis de que un aumento de estos cofactores podría relajar los requisitos Brd4. Sorprendentemente, el aumento de su presencia en realidad correlaciona con aumento de las necesidades para Brd4 (Fig. 6). La posición de un aumento de los componentes de la SEC junto con MED26 y Gdown1 alrededor del promotor P3 sugiere que la actividad transcripcional de alto o un puesto de control de regulación en esta región que no está presente en las células que son resistentes a JQ1 (resumido en la Figura 7). Se ha observado que en las células BL, debido a
MYC-IG
translocación, el promotor P3 otro modo menor frecuencia se activa y se correlaciona con una mayor expresión de MYC [43]. Junto con la reciente demostración de que la translocación
MYC
puertos locus súper potenciadores que son sensibles a JQ1 [45], esto plantea la posibilidad de que el mecanismo de regulación transcripcional de
MYC
que afecte a su nativa /promotor de la no-translocado es diferente (Fig. 7B, la figura S2, S1 en el archivo).
(a) Resumen de los niveles de ocupación que abarca el factor de
MYC
promotor P
0,