Extracto
proangiogénico enzima timidina fosforilasa (TP) es un objetivo prometedor para la terapia contra el cáncer, sin embargo, su acción en el carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) no se entiende completamente. Para dilucidar su papel en el crecimiento del tumor NSCLC, se manipularon genéticamente las células de carcinoma mucoepidermoide NCI-H292 y células endoteliales pulmonares sobreexpresan TP mediante transducción vector viral. Se utilizaron células de NSCLC con expresión alterada del factor de transcripción Nrf2 o su gen diana hemoxigenasa-1 (HO-1) para estudiar la regulación de los TP y los resultados de los modelos preclínicos se relacionaron con los datos de expresión génica de muestras de NSCLC clínicas. La sobreexpresión de Nrf2 o HO-1 resultó en la regulación positiva de TP en células NCI-H292, un efecto imitado por tratamiento con un antioxidante N-acetilcisteína y parcialmente revertida por HO-1 desmontables. La sobreexpresión de TP atenúa la proliferación celular y la migración
in vitro
, pero a la vez mejorado el potencial angiogénico de las células cancerosas complementado con timidina. Este último también se observó para SK-MES-1 carcinoma de células escamosas y células de carcinoma de células grandes NCI-H460. tumores NCI-H292 TP sobreexpresan
in vivo
exhibieron una mejor oxigenación y una mayor expresión de IL-8, IL-1β e IL-6. TP sobreexpresión en células endoteliales aumenta sus propiedades angiogénicas que se asoció con una mayor generación de HO-1 y VEGF. Correlación de TP con la expresión de HO-1 y citoquinas inflamatorias se confirmó en muestras clínicas de NSCLC. . En total, el aumento de expresión de IL-1β y IL-6 junto con los efectos proangiogénicos de TP-expresión de NSCLC en el endotelio puede contribuir al crecimiento del tumor, lo que implica TP como un objetivo para antiangiogénesis en NSCLC
Visto: tercil M , Skrzypek K, Florczyk U, Węglarczyk K, fue H, Collet G, et al. (2014) La regulación y Novela de timidina fosforilasa en células no pequeñas de cáncer de pulmón: Cruce de señal con Nrf2 y HO-1. PLoS ONE 9 (5): e97070. doi: 10.1371 /journal.pone.0097070
Editor: Soumitro Pal, el Hospital de Niños de Boston & amp; Escuela de Medicina de Harvard, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Octubre, 2013; Aceptado: 14 de abril de 2014; Publicado: 12 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 tercil et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Con el apoyo de las subvenciones no 311 /N-COST /2008/0, 347 /N-INCA /2008/0 y N N301 314837 del Centro Nacional para la Ciencia (NCN). Alicja Jozkowicz fue un Investigador Senior Internacional del Wellcome Trust. M. tercil y K. Skrzypek fueron apoyados por Conseil Régional du Centre, estipendio para la co-tutorial tesis doctoral. La Facultad de Bioquímica, Biofísica y Biotecnología de la Universidad Jagellónica es un beneficiario de los fondos estructurales de la Unión Europea y el Ministerio de Educación polaco Ciencia y Superior (otorga No: POIG.02.01.00-12-064 /08, 02.02. 00-00-014 /08, 01.01.02-00-109 /09 y 01.01.02-00-069 /09). Las investigaciones realizadas en el ámbito del Laboratorio Asociado Internacional miR-Tango (LIA). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción tumores
pulmonares clasifican como la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, con el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) es el más prevalente. pacientes con CPNM a menudo son diagnosticados con la enfermedad avanzada, cuando la quimioterapia sistémica es la opción terapéutica importante. Dado que el crecimiento tumoral y la metástasis dependen de la angiogénesis, los mecanismos que regulan la formación de nuevos vasos sanguíneos han sido objeto de intervención en el cáncer de pulmón [1]. Sin embargo, la adición de agentes anti-VEGF a la quimioterapia convencional resultó sólo en una ligera mejora de la mediana de supervivencia [1], [2] con los pacientes que experimentan recidiva tumoral debido a la aparición de resistencia a los medicamentos a los agentes antiangiogénicos, lo que subraya la necesidad urgente de nuevos objetivos para combinatoria tratamientos.
la timidina fosforilasa (TP, EC2.4.2.4) es una enzima de la ruta de síntesis de pirimidina de salvamento, que también es conocido por sus propiedades proangiogénicos. TP cataliza fosforolisis reversible de timidina en timina y 2-desoxi-D-ribosa-1-fosfato (DRP), que se desfosforiló además a 2-desoxi-D-ribosa (dR). La enzima y sus productos de azúcar estimulan la migración de células endoteliales y la formación de tubos
in vitro
y mejoran la angiogénesis en diversos modelos
in vivo
[3]. TP es frecuentemente sobreexpresado en los tumores humanos, incluyendo NSCLC [3], [4] y se ha demostrado que se correlaciona con una mayor densidad de los microvasos, el estadio del tumor más avanzado, metástasis y mal pronóstico [3]. acción proangiogénicos de TP en los tumores, además de la acción directa de sus productos en las células endoteliales, también puede implicar la estimulación de la expresión de otros factores angiogénicos como el VEGF, la interleucina-8 (IL-8) o hemo oxigenasa-1 (HO- 1) [5], [6]. En consecuencia, la orientación TP con inhibidores de molécula pequeña se investiga actualmente como una estrategia antiangiogénica novela [7]. Sin embargo, para el desarrollo de agentes quimioterapéuticos eficaces combinatorias, reteniendo la actividad enzimática de TP puede ser necesario, ya que cataliza un paso importante en la activación de agentes basada en fluoropirimidinas tales como la capecitabina, que se ha propuesto como tratamiento alternativo para NSCLC avanzado [8]. Esta doble función de TP en el crecimiento del tumor y la terapia implica que la inhibición de los efectos protumoral de la enzima puede requerir la orientación de sus mediadores aguas abajo. Elucidar los mecanismos de regulación y las acciones de promoción de tumores de TP, por tanto, es de crucial importancia.
Nrf2 (factor nuclear (derivado de eritroide 2) -como 2) es un factor de transcripción que regula las respuestas antioxidantes de las células [9]. Con frecuencia es constitutivamente activa en los tumores, incluyendo cáncer de pulmón, y se puede inducir aún más por los tratamientos contra el cáncer. Se conduce la expresión de genes citoprotectores que conducen al desarrollo de resistencia a los agentes citotóxicos [10]. Uno de los objetivos de Nrf2 es HO-1, que convierte heme en CO, hierro ferroso y biliverdina, y que se ha demostrado para mediar resistencia impulsado por Nrf2 de células de NSCLC a la quimioterapia [11], [12]. Curiosamente, ambas proteínas juegan un papel en la promoción de la angiogénesis: la acción de HO-1 aguas arriba y aguas abajo angiogénico VEGF y SDF1α está bien establecida [13], y la participación de Nrf2 en la regulación de angiogénico IL-8 se ha demostrado [14] - [16].
a continuación se investiga el papel biológico de TP se centra en la angiogénesis y la interacción con Nrf2 y HO-1 en el cáncer de pulmón de células no pequeñas y células endoteliales. Nuestros resultados muestran los efectos de la sobreexpresión de TP en células de NSCLC
in vitro
y
in vivo
y poner de relieve la importancia de la acción de la enzima proangiogénico.
Materiales y Métodos
Los plásmidos y vectores virales
El plásmido pBK-RSV-TP TP albergar cDNA humano fue proporcionado amablemente por el Dr. S. Liekens (Instituto Rega para Investigación médica, Universidad Católica de Lovaina, Bélgica). Plásmido pEF (azul) que contiene -Nrf2 Nrf2 cDNA humano fue amablemente por el Dr. J. A. dotado Johnson (División de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Wisconsin-Madison, EE.UU.) [17]. La construcción de vectores retrovirales (RVs) RV-TP y RV-Nrf2 se llevó a cabo como se describe en Métodos Complementarios (Archivo S1). Retroviral plásmido pMSCV-Luc contiene casete de expresión de luciferasa para la producción de RV-Luc se obtuvo de Addgene. Todos los vehículos recreativos que incluyen un RV-vacía vector de control (LNCX2) se produjeron como se describe en [18].
Los vectores adenovirales (ADV) que alberga TP ADNc (ADTP) se desarrollaron como se describe en Métodos Complementarios (Archivo S1) y vectores de control con GFP (AdGFP) como se informó anteriormente [16]
líneas celulares y condiciones de cultivo
NSCLC humano líneas celulares:. NCI-H292 (carcinoma mucoepidermoide, adquirido de ATCC), A549 ( adenocarcinoma, obtenido de Prof. Jakub Golab, Universidad de Medicina de Varsovia, Varsovia, Polonia) y NCI-H460 (carcinoma de células grandes, adquirido de ATCC) se cultivaron en RPMI 1640 (PAA) y SK-MES-1 (carcinoma de células escamosas, comprado de la ATCC) se cultivó en MEM (Gibco), cada uno suplementado con 10% de suero bovino fetal (PAA) y penicilina (100 U /ml) /estreptomicina (10 mg /ml) (Sigma) (penicilina /estreptomicina). Las células endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1, obtenido del Dr. Francisco Candal, Centro para el Control y Prevención de Enfermedades, Atlanta, EE.UU.) se cultivaron en MCDB 131 suplementado con FBS al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina /estreptomicina, EGF 10 ng /ml e hidrocortisona 1 mg /mL. Se aislaron células endoteliales de la vena umbilical humanas primarias (HUVEC) como se describe anteriormente [19] y se cultivaron en M199 (PAA) suplementado con 20% FBS, penicilina /estreptomicina y el crecimiento de células endoteliales suplemento ECGS, 30 mg /L (Millipore).
Todas las células se mantuvieron en condiciones estándar de cultivo: 37 ° C, 5% de CO
2, 95% de humedad. Para la investigación de los efectos de las células de hipoxia se colocaron durante 24 o 48 horas en una cámara (Biospherix EE.UU.) bajo atmósfera controlada de gas 1% de O
2, 5% de CO
2 y el 94% de N
2 dejó a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular
.
Para el establecimiento de líneas de células NCI-H292-Luc-TP (NCI-TP) y NCI-H292-Luc-Nrf2 (NCI-Nrf2) que sobreexpresan de forma estable la luciferasa y los transgenes y control de NCI-H292-Luc-EV (NCI-EV) modificado con el vector vacío respectivos, las células fueron transducidas con vectores retrovirales. En primer lugar, una infección con RV-transgén o RV-vacía vector (RV-EV) se llevó a cabo y las células transformadas de manera estable se seleccionaron por geneticina (1 mg /ml), que fue seguido de la transducción con RV-Luc y selección por higromicina (0,3 mg /ml). NCI-H292-Luc-HO-1 (NCI-HO1) línea celular fue desarrollado y validado anteriormente en nuestro laboratorio [20]. Para el mantenimiento de las células de expresión de los transgenes se mantuvieron rutinariamente en medio estándar adicionalmente suplementado con geneticina (0,5 mg /ml) e higromicina (0,1 mg /ml). Para experimentos con células se sembraron en un medio sin antibióticos.
sobreexpresión transitoria TP y la estimulación de células con sustrato de NAC o TP
timidina (Thd) y N-acetilcisteína (NAC) se adquirieron de Sigma Aldrich . Para la sobreexpresión transitoria TP en ECs, HMEC-1 y las células HUVEC fueron transducidas con vectores adenovirales ADTP o AdGFP control en MOI = 10 para 24 h y luego se estimularon con Thd durante 24 h adicionales en medio completo. Para la sobreexpresión TP transitoria en células de NSCLC, SK-MES-1 y NCI-H460 se transdujeron a MOI = 20 y MOI = 40, respectivamente, y se estimularon con Thd 1 mM en el medio suplementado con 2% de FBS 48h después de la transducción.
niveles en tiempo real RT-PCR
mRNA de los genes se determinaron mediante PCR cuantitativa RT. Se aisló el ARN ya sea con Qiazol (Qiagen) o usando el kit RNeasy Micro Plus (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. 1 g de ARN fue transcrito de forma inversa en ADNc usando cebadores oligo-dT con RevertAid superior de la primera cadena de cDNA Kit de síntesis (Fermentas). PCR en tiempo real se realizó con 30 ng de muestra con QuantiTect SYBR Green (Qiagen, análisis de
in vitro
experimentos) o SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara, el análisis de
in vivo
experimentos ) según las instrucciones del fabricante en LightCycler sistema 480 II (Roche). La expresión génica se calculó de acuerdo con métodos de Ct o ΔΔCt con EF2 como un gen de referencia, con barras de error calculadas como desviaciones estándar de las medias, divididos por √ (N-1), donde N es el número de experimentos independientes. la propagación de errores no se tuvo en cuenta, lo que es una cierta limitación de nuestro estudio.
Western blot y ELISA
Western blot para HO-1 se realizó como en [19]. Para la detección de TP ratón humano mAb P-GF.44C (Calbiochem) se utilizó. La producción de VEGF humano y la IL-8 en medios de cultivo y la IL-8, IL-1β y IL-6 en lisados tumorales se cuantificó mediante ELISA DuoSet Kits (R & amp; D) de acuerdo con los protocolos del fabricante. La concentración total de proteína en las muestras se midió por el método BCA. Los datos se normalizaron por diluciones pre-ensayo de lisados tumorales a una concentración igual de 1 mg /mL.
ensayo de gen indicador para la medición de la actividad transcripcional Nrf2
ensayo se realizó como ya se ha descrito en [ ,,,0],15].
silenciamiento génico experimento
Las células fueron transfectadas con 50 nM siRNA (RNAi sigilo HO-1 siRNA y Stealth control negativo ARNi de ARNsi de control, Invitrogen) usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
la proliferación celular y la proliferación celular migración
se midió mediante el ensayo colorimétrico de la incorporación de BrdU (proliferación celular ELISA, Roche) según las instrucciones del proveedor. Con el fin de investigar la migración de células, las células se hicieron crecer hasta confluencia completa y suero de hambre durante 24 h para bloquear la proliferación. Rayado se hace sobre la monocapa con una punta de pipeta. La migración fue seguido por microscopía lapso de tiempo (Zeiss Axiovert 200 M) por 6-8 campos diferentes para cada condición. La media de superficie cubierta se fija en diferentes puntos de tiempo y se expresa como el porcentaje de área de borrador en el tiempo cero utilizando el software ImageJ.
ensayos de angiogénesis
in vitro
ensayo
formación de tubos en el Matrigel se realizó como ya se ha descrito [21]. células de NSCLC se incubaron en medio que contenía 2% de FBS en normoxia e hipoxia durante 48 h, se recogió el medio acondicionado y se mezcló a 01:01 vol /vol con MCDB 131 suplementado con 2% de FBS y antibióticos sin otros aditivos para la estimulación de HMEC-1 o HUVEC. ensayo de esferoide de células HUVEC se realizó como anteriormente [19].
Los experimentos con animales
Declaración de Ética.
Todos los animales fueron manejados en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales y todos los animales el trabajo fue aprobado por el (nacional réflexion éthique sur l'animale expérimentation Comité de) Campus Comité de Ética CNREEA 03 CNRS de Orleans en Francia.
6 semanas de edad ratones desnudos atímicos hembra suizos fueron adquiridos de Charles River ( Francia). Para el establecimiento del NCI-TP y control xenoinjertos de tumores NCI-EV, se recogieron las células en crecimiento exponencial usando Solución de Disociación Celular (Sigma) y se resuspendieron en PBS. 5 × 10
se inyectaron 6 células en 100 l por vía subcutánea en la pata derecha de cada ratón (línea 10 animales /célula). El crecimiento tumoral se controló durante 5 semanas por mediciones de la pinza, el volumen del tumor se calculó según la fórmula
V
=
D
×
d
2 × 0,5 (
V
es el volumen del tumor,
D
es la dimensión más grande;.
d
es la dimensión más pequeña)
la medición de la oxigenación del tumor
La oxigenación del tejido tumoral se midió por el sistema de sensor basado en OxyLite extinción de fluorescencia de rutenio por O
2 (Oxford Optronix).
Análisis de material clínico
declaración de Ética.
los estudios en humanos fueron aprobados por el Comité ético local del Colegio Medicum de la Universidad Jagellónica de Cracovia, Polonia. Los pacientes han expresado su consentimiento por escrito para participar en el estudio.
Las biopsias de tumores primarios y metástasis tumorales a los ganglios linfáticos (si está presente) se recogieron durante la cirugía de 24 pacientes que sufren de NSCLC adenocarcinoma. Los pacientes fueron tratados en la Clínica de Cirugía Torácica, Medicina de la Universidad Jagellónica, 31-202 Cracovia, Polonia.
El análisis estadístico
A menos que se indique lo contrario, los resultados muestran la media ± SEM de al menos 3 independientes experimentos realizados por duplicado. pruebas t de Student no pareada se utilizaron para evaluar si las medias de dos grupos diferían significativamente. Para la comparación de múltiples grupos se empleó el análisis unidireccional ANOVA con post-test de Tukey. Las diferencias con un valor de p & lt; 0,05. Se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
TP se expresan diferencialmente en células de NSCLC con diferentes niveles de Nrf2 y hemo oxigenasa-1