Extracto
Antecedentes
El cáncer colorrectal (CRC) con inestabilidad de microsatélites (MSI) están asociados con un buen pronóstico y una alta densidad de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL). Hemos llevado a cabo para determinar la relación entre las densidades de TIL y características histológicas MSI CRC.
Pacientes y métodos
El uso de microarrays de tejidos, la infiltración subpoblación de células T, incluyendo las células T (CD3), se estudiaron las células T citotóxicas (CD8) y células T reguladoras (FoxP3) en 86 MSI CRC. Se analizaron por separado los TIL del estroma y compartimentos epiteliales en el centro del tumor, el margen de la invasión tumoral y tejido normal asociado.
Resultados
Para la densidad FoxP3 + TIL en el compartimento central tumor del estroma, encontramos una fuerte correlación negativa con la etapa T4 (p = 0,01), invasión ganglionar (p & lt; 0,001). VELIPI y (embolia vascular, invasión linfática y la invasión perinervous) criterios (p = 0,002)
Conclusión
la fuerte correlación entre la densidad de células T reguladoras y la ausencia de criterios VELIPI sugiere que este subgrupo de células T se asocia preferentemente con tumores menos invasivos
Visto:. Tougeron D, P Maby, Elie N, Fauquembergue É, Le Pessot M, Cornic M, et al. (2013) Reguladora de los linfocitos T se asocian con características histológicas menos agresivo en el cáncer colorrectal microsatélites inestable. PLoS ONE 8 (4): e61001. doi: 10.1371 /journal.pone.0061001
Editor: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, República de Corea
Recibido: 19 de diciembre de 2012; Aceptado: March 5, 2013; Publicado: 15 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Tougeron et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El apoyo financiero se recibió de Inserm - Haute-Normandie (salario de P. Maby), y la Liga Contra el cáncer de Seine-Maritime (reactivos). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Recientemente, respuesta inmune del huésped se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la determinación del resultado de los pacientes con cáncer colorrectal (CRC). Páginas
et al
han demostrado que una alta densidad de la infiltración de células T de memoria dentro del tumor está asociado con la ausencia de marcadores histológicos de invasión en curso, también llamado VELIPI (embolia vascular, invasión linfática y la invasión perinervous) criterios y con una mejor supervivencia global [1], [2]. Por otra parte, los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) Densidad parece tener un mejor valor pronóstico que TNM etapa [3], y algunas subpoblaciones de células T se ha demostrado que se asocia con un mejor resultado clínico CRC, tales como las células T citotóxicas (CD8 +) , las células T auxiliares y Th17, más controvertida, las células T reguladoras (FoxP3 +) [3] - [5].
Curiosamente, los tumores que presentan una inestabilidad de microsatélites (MSI) o fenotipo error de replicación se caracterizan por una alta histopatológicamente TIL densidad [6] - [8]. Estos tumores tienen un mejor pronóstico en general con menos recurrencia de la enfermedad y una mejor tasa de supervivencia que la otra contraparte CRC, con microsatélites fenotipo estable [9], [10]. MSI fenotipo, observada en aproximadamente 12% de los cánceres colorrectales, se debe a la inactivación del sistema de reparación del mal emparejamiento del DNA (MMR)
11 que resulta ya sea de una alteración epigenética somática, o de una alteración de la línea germinal (síndrome de Lynch) [11 ]. MMR inactivación afecta a la replicación de repetición de nucleótidos y puede conducir a la generación de neo-proteínas degradadas en neo-péptidos presentados en las moléculas HLA. Por lo tanto, el mejor pronóstico para cánceres colorrectales inestables microsatélites podría explicarse al menos parcialmente por la presencia de TIL, que podría ser específica para ciertos péptidos tumorales resultantes de la inestabilidad de microsatélites [12], [13]. Los tumores MSI tienen mayores tasas de CD8 + y FoxP3 + TIL que los tumores MSS, pero los pocos estudios publicados sobre MSI CRC reportan resultados contradictorios con respecto a estos valores de pronóstico TIL [4], [8], [14] - [18]. Por otra parte, en MSI CRC, solamente CD8 + densidad de linfocitos intraepiteliales se ha estudiado completamente, con exclusión de los linfocitos del estroma y otras células T subpoblaciones [14], [19].
densidad celular inmune podría tener un valor pronóstico, y la por lo tanto, ser clínicamente relevante, especialmente para la prescripción de la quimioterapia adyuvante en MSI CRC. Sin embargo, hasta donde sabemos, hasta ahora ningún estudio ha investigado, en una gran serie de pacientes, el vínculo entre las diferentes subpoblaciones de TIL en el estroma y los compartimentos epiteliales, y las características histológicas del tumor o el pronóstico, en MSI CRC. En este estudio, se han analizado las células T totales, células T citotóxicas y la infiltración tumoral de células T reguladoras en los CRC y MSI tratado de establecer este enlace para estas poblaciones de células inmunes.
Materiales y Métodos
Selección de los pacientes y la evaluación de la inestabilidad de microsatélites
en nuestra institución, la inestabilidad de microsatélites se ha analizado en todos los CRC desde 2003. Para cada paciente, se extrajo ADN genómico a partir de tumores colorrectales emparejado y los tejidos normales. evaluación de la inestabilidad de microsatélites se realizó mediante un análisis comparativo de estas muestras de ADN utilizando las cinco repeticiones mononucleótido consenso (
BAT25
,
BAT26
,
NR21
,
NR22
y
NR24
) [20]. Inestabilidad de microsatélites (MSI) se define por la presencia de inestabilidad que afecta a al menos dos marcadores (que corresponden de hecho a las altas tumores MSI solamente). Comité de Ética de nuestra institución (Comité de Protección des personnes Nord-Ouest I) aprobó el estudio y renunció a la necesidad de consentimiento informado debido a la naturaleza retrospectiva del estudio. De acuerdo con la reglamentación francesa, el consentimiento por escrito de manera sistemática se había obtenido para la mutación germinal sistema de reparación de ADN no coinciden los análisis que fueron realizados con fines médicos.
Características paciente y del tumor, y el resultado clínico
Paciente y se recogieron las características iniciales de tumores. Por otra parte, para cada tumor, marcadores histológicos de invasión en curso corresponden a los criterios VELIPI se determinaron mediante el examen de un patólogo [1].
A todos los pacientes de menos de sesenta años de edad y /o con antecedentes familiares de síndrome de Lynch espectro de tumores estaban dirigidas a la consulta oncogénico. En estos pacientes, la presencia de una línea germinal de reparación de genes de ADN mutación del gen nocivo sistema fue buscado.
recurrencia de la enfermedad se evaluó cada 3 meses los dos primeros años y cada seis meses los próximos tres años. Los datos de seguimiento se actualizaron en diciembre de 2011.
microarrays de tejidos e inmunohistoquímica
microarrays de tejidos (TMA) consisten en bloques de parafina en el que hasta 1000 núcleos de tejido separados se ensamblan de manera matriz para permitir múltiples análisis histológicos después de la inmunotinción. Para cada tumor, se tomaron cuatro núcleos de 0,6 mm de diámetro en el centro del tumor, en el margen invasión, y cuatro núcleos adicionales se tomaron de distante histológicamente mucosa colónica normal (Tissue Arrayer, Alphelys, Francia). Todos los análisis se realizaron en surgicaly resecaron primaria CRC antes de tratamiento de quimioterapia. Área con la respuesta linfoide como de Crohn fueron excluidos de la construcción TMA y análisis. Los ocho TMA utilizados en este estudio contenían más de 1000 núcleos de CRCs inestables microsatélites. Cuatro secciones micras de espesor se cortaron de los bloques de TMA y utilizados para inmunohistoquímica basado en CD3 (células T), CD8 (células T citotóxicas) y FoxP3 (regulador de las células T) tinción. tejidos fijados con formalina se deparaffinized y recuperación de epítopo inducida por calor se ha realizado mediante un vapor. Los portaobjetos se incubaron con anticuerpos monoclonales de ratón, anti-CD3 (DAKO, Carpentria, CA) diluido 1/50 de 32 min, anti-CD8 (DAKO, Carpentria, CA) diluido 1/50 de 32 min, y anti-FoxP3 (Abcam , Cambridge, MA) diluido 1/50 de 32 min, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cada sección, un anticuerpo primario de ratón y un anticuerpo secundario anti-ratón de la revelación se utilizaron. El anticuerpo secundario se acopla directamente a la enzima HRPO (Rábano picante-peroxidasa, DAKO) y se aplicó durante 15 min. El color se reveló utilizando cromógeno DAB (Diaminobenzine) y la aplicación de H2O2 (peróxido de hidrógeno).
La cuantificación de linfocitos infiltrantes
Cada diapositiva fue escaneada con Mirax Scan ®. El programa de Análisis Chips'N barato TMA, utilizando Aphelion 3.2 (ADCIS, Hérouville St Clair, Francia), había sido optimizado para identificar cada chip en la preparación virtual TMA y que nos permita delinear las áreas acelulares, el estroma y los compartimentos epiteliales para cada núcleo. Las regiones de interés, es decir, el estroma y el epitelio, se delinearon manualmente dentro de los no malignos (4 núcleos), el centro del tumor (4 núcleos), y el margen de la invasión (4 núcleos) los lugares para cada paciente. Después de la resta de las áreas acelulares, las relaciones entre las zonas inmunoteñidas y áreas totales en la región de tejido se calculan automáticamente (Figura 1).
Ejemplos de chips de centro de tumor con CD3 (A), CD8 (B) y (C FoxP3 ) tinción. paneles de la izquierda son ejemplos de altas densidades de TIL y paneles de la derecha son ejemplos de bajas densidades TIL. El estroma está encerrado en un círculo rojo, el epitelio en azul, y se excluyen las áreas negras. Las zonas marcadas que se toman en cuenta para calcular la densidad de linfocitos infiltrado se encierran en un círculo amarillo. Todos los datos fueron adquiridos con el programa de análisis de N barato TMA de Chip.
TIL cuantificaciones fueron dadas por los porcentajes de las superficies totales marcados por los anticuerpos. El análisis visual de las muestras de 10 pacientes nos llevó a estimar que uno por ciento de tumor- tinción de linfocitos infiltrantes correspondió a alrededor de 350 TIL /
2 mm. En los tumores con diferenciación mucinosa, las densidades de TIL se calcularon fuera de las áreas mucinosos.
Análisis estadístico
T-test se utilizó para probar la asociación entre las características del tumor y la densidad de TIL. Se estimó la supervivencia libre de enfermedad (SLE) a partir de la fecha de la cirugía hasta la recurrencia documentada o la última fecha de seguimiento. Curva de supervivencia se estableció utilizando el método de Kaplan-Meier. Todos los análisis estadísticos se realizaron con un valor de significación de dos lados de 0,05, utilizando el software Statview (Statview para Windows, SAS Institut Inc., versión 5.0).
Resultados
Características paciente y del tumor
Un total de 106 CRC con inestabilidad de microsatélites (dos pacientes desarrollaron tumores sincrónicos 2), que habían sido sometidos a cirugía entre enero de 2003 y diciembre de 2009, se incluyeron inicialmente. Algunos pacientes fueron excluidos posteriormente del análisis debido a la ausencia de muestra de tumor o los datos clínicos. Ochenta y seis pacientes todavía se incluyeron en el estudio final (Tabla 1). la edad media de los pacientes fue de 68,6 ± 17,5 años. Treinta y un pacientes fueron probados para las mutaciones de la línea germinal de genes MMR. Dieciocho de los pacientes (24,4%) presentó un síndrome de Lynch, tal como se define por la presencia de una mutación germinal deletéreos MMR (16 pacientes) o una presentación de cumplimiento de criterios de Amsterdam en pacientes sin mutación germinal MMR (2 pacientes).
la mayoría de los tumores fueron TNM en estadio II o III (74,4%) y en el colon derecho (63,9%) (Tabla 1). Alrededor de la mitad de los tumores tenían criterios VELIPI (45,3%) y el 12,7% eran tumores mucinosos, definidos como los tumores con diferenciación mucinosa que representen al menos el 50% del volumen total del tumor; 25,3% de todos los tumores tenía alguna diferenciación mucinosa que representa menos del 50% del volumen total del tumor (menos de 20% para casi la mitad de estos tumores, y entre 20 y 40% para los otros). Sólo 16 (18,6%) pacientes recayeron después de una mediana de seguimiento de 25,0 ± 5,7 meses. Entonces, no se alcanzó la mediana DFS. Tres años de la SSE fue de 78,7%. La mediana de la supervivencia global (SG) fue de 72,1 ± 11,3 meses y de tres años de SG fue de 60,2%.
CD3 +, CD8 + y + T FoxP3 linfocitos infiltrantes de tumor
se localizaron principalmente en el estroma compartimento (Figura 2). Se observó una densidad de células T totales significativamente mayor en tumor en comparación con tejidos de colon normales (p & lt; 0,05, datos no mostrados)., como ya se informó
13 dentro de los tejidos tumorales y normales, CD3 +, CD8 + y FoxP3 + TIL densidades eran más alta en el estroma que en el epitelio (p & lt; 0,01 para todos los marcadores) (Figura 2). Además, hay una fuerte correlación positiva entre CD3 +, CD8 + y FoxP3 + TIL densidades observadas tanto en el centro del tumor y el frente de invasión, independientemente del compartimiento (p & lt; 0,01, datos no mostrados). Moroever, se observaron mayores densidades de células CD8 + TIL en el frente invasivo que en el centro del tumor (p & lt; 0,05), lo cual no era el caso para densidades de células CD3 + y FoxP3 + TIL. No hubo diferencia entre densidades TIL en pacientes con o sin síndrome de Lynch.
La barra de gráficos representan los porcentajes de superficies marcadas por compartimentos (ep) epiteliales CD3, CD8 y inmunotinción FoxP3 en el estroma (stro) y, en el centro del tumor (TC) y los tejidos del frente de invasión (SI). Los errores estándar están dados por las barras. densidades de células CD3 + TIL fueron, respectivamente, 2,2 ± 2,5% en el compartimiento del epitelio centro de tumores, 6,4 ± 5,1% en el compartimiento del estroma tumoral centro, 2,3 ± 2,5% en el compartimiento epitelio frente de invasión, 7.2 ± 6.1% en el compartimiento del estroma frente de invasión. densidades CD8 + TIL fueron, respectivamente, 1,52 ± 2,0% en el compartimiento del epitelio centro de tumores, 2,9 ± 2,7% en el compartimiento del estroma tumoral centro, 1,8 ± 2,4% en el compartimiento epitelio frente de invasión, 3.3 ± 3.0% en el compartimiento del estroma frente de invasión. densidades FoxP3 + TIL fueron, respectivamente, 0,13 ± 0,12% en el compartimento central epitelio tumoral, 0,59 ± 0,53% en el compartimento central del estroma tumoral, 0,14 ± 0,14% en el compartimento delantero epitelio de la invasión, 0,63 ± 0,58% en el compartimiento delantero invasión del estroma.
h3> Asociación
buscamos una correlación entre la densidad de TIL en los diferentes compartimentos y un número de diferentes variables clínico (& gt; 60 años frente a ≤ 60 años, mal frente así /tumores moderadamente diferenciados, de colon rectal /izquierda frente a la localización del tumor de colon derecho, la pared de la invasión (T4 frente T1-3), invasión ganglionar (N + frente N0), marcadores histológicos de invasión en curso (criterios VELIPI), los estadios I-II frente III- IV). densidad CD3 + TIL en el compartimiento del epitelio centro tumor se asoció con pobre diferenciación (p = 0,01, datos no mostrados). Para la densidad CD3 + TIL en los otros compartimentos y la densidad CD8 + TIL en todos los compartimientos, no había correlación con los datos clínicos. Por el contrario, la densidad de FoxP3 + TIL en el compartimiento del estroma centro tumor está fuertemente asociada negativamente con la etapa T4 (p = 0,01), la invasión nodo (p & lt; 0,001), los criterios de VELIPI (p = 0,002) y las fases III-IV (p & lt; 0,001 ) (Tabla 2). No hubo correlación entre la densidad de FoxP3 + TIL en cualquier otro compartimento y los datos clínicos.
Discusión
En este estudio se realizó inicialmente para evaluar el valor pronóstico de diferentes TIL (CD3 +, CD8 + , FoxP3 +) densidades en los cánceres colorrectales con inestabilidad de microsatélites. En el análisis univariante, la invasión nodo (p = 0,002) y los criterios VELIPI (p = 0,004) eran predictivos de la DFS, pero no CD3 +, CD8 + y FoxP3 + TIL densidades (datos no mostrados). A pesar de nuestra gran serie de pacientes (n = 106) era fiable para estudiar diferentes características histológicas de los CRC con inestabilidad de microsatélites, no fue suficiente para llevar a cabo un análisis estadístico robusto cuanto a la supervivencia. De hecho, ya que este tipo de cáncer tiene un buen pronóstico, sólo unos pocos pacientes (n = 16) habían recaído y no hay correlación entre la densidad de población de cualquier TIL y DFS se pudo observar. Sin embargo, encontramos una fuerte correlación negativa entre la densidad de FoxP3 + TIL en el compartimiento del estroma centro del tumor y las características tumorales más agresivas: invasión de la pared, los criterios de invasión nodo y VELIPI, lo que sugiere que las células T reguladoras dentro del tumor podrían estar asociados con la propagación de las células cancerosas limitada potencial
Varios estudios han demostrado que las células T CD8 +, que parecen constituir la mayoría del infiltrado intra-epitelial, se asocian con una mejor supervivencia en CRCs [21] - [24].. Por otra parte, el infiltrado general CD8 + TIL se demostró que era más denso en CRCs MSI que en MSS CRCs, probablemente debido a la expresión por las células tumorales de MSI de neoantígenos inmunogénicas de mutación del marco de lectura derivados de [13] - [17]. Estos estudios sugieren que la ventaja de supervivencia en MSI CRCs podría ser, al menos en parte, atribuido a aumento de la respuesta CD8 + células T intra-tumor, dirigidos contra estos neoantígenos. Sin embargo, nuestro estudio no demostró asociación entre CD8 + se infiltran en la densidad y el mejor pronóstico de MSI CRC. Sería interesante para evaluar la funcionalidad de la CD8 + TIL, ya que algunas observaciones clínicas sugieren un deterioro de la función de la CD8 + TIL en MSI CRCs [25], [26].
Otra subpoblación TIL importante se compone de T CD4 + Células. Por desgracia, hasta ahora, no hemos podido analizar la población de células T CD4 +, CD8 + a pesar de que las respuestas citotóxicas eficaces requieren la ayuda de células T CD4 +. De hecho, entre los diferentes anticuerpos anti-CD4 probamos, ni uno solo permitido para la tinción de buena calidad que pueda utilizarse en relación con TMA y compatible con nuestro software de análisis de imágenes. Las células T CD4 + aumentaron aparecen en los tumores en comparación con los tejidos normales [27] y la mínima CD4 + infiltrado puede estar asociado con una mejor supervivencia [28], [29], que sigue siendo controvertida [5]. Esta observación podría explicarse por el hecho de que las células T CD4 + representan una población heterogénea que contiene tanto células activadas T helper de diversas actividades, y células T reguladoras.
Gran interés Recientemente se ha demostrado en células T FoxP3 que tienen reguladora funciones de la respuesta inmune. Esta población de linfocitos se caracteriza por la secreción de citoquinas inmunosupresoras (TGF-ß y IL-10) y la expresión de moléculas tales como CTLA-4 (linfocitos T citotóxicos antígeno 4) que inhiben la activación y proliferación de las células T efectoras CD4 + y CD8 + [30 ]. Una alta densidad de las células T reguladoras se ha encontrado con frecuencia en los ganglios linfáticos y los tumores de pacientes con CRC, y también en la sangre, en comparación con los individuos sanos [31] - [33]. Inicialmente, algunos estudios han encontrado una correlación entre la alta densidad de FoxP3 + TIL y de mal pronóstico en el CCR [4], [34]. Estudios recientes, sin embargo, han encontrado sorprendentemente que este infiltrado podría estar asociado con un buen pronóstico [33], [35] - [37]. Hasta la fecha, sólo se Michel
et al
han evaluado a fondo la presencia de estas células en MSI CRC [38]. Se observó un mayor FoxP3 + se infiltran en MSI CRC CRC que en el SMS. Sin embargo, el vínculo con el pronóstico no fue estudiado. En nuestro estudio, en el CRC de MSI, la densidad de FoxP3 + TIL se asoció claramente con las características tumorales menos invasivas, en particular, con la ausencia de criterios VELIPI, y por lo tanto podría estar asociada indirectamente con un mejor pronóstico. Este resultado fue inesperado e incluso puede parecer paradójico ya que las células T reguladoras inhiben la respuesta inmune. De hecho, estas células T reguladoras podrían reflejar un mecanismo desarrollado por el propio tumor para limitar la respuesta anti-tumor, y, tal vez, la respuesta más eficiente este anti-tumor, los más numerosos estas células T reguladoras son. Esta hipótesis está apoyada fuertemente por la correlación se encontró entre CD3, CD8 y densidades FoxP3 + TIL. Otra explicación coul ser que las células T reguladoras reducir la inflamación que puede contribuir al crecimiento del tumor y su potencial metastásico, según lo informado por Mantovani
et al
[39]. La heterogeneidad en el cáncer colorrectal infiltración de células T reguladoras, como recientemente descrita por Blatner
et al
[40], también podría explicar algunos resultados clínicos inesperados en pacientes con cáncer colorrectal. Sin embargo, se pudo establecer una correlación estadísticamente significativa entre la densidad FoxP3 + TIL y DFS, tal vez de nuevo debido a la falta de potencia estadística debido al pequeño número de recidivas tumorales.
Un punto fuerte de nuestro estudio en comparación con otros estudios era que se tuvo en cuenta la precisión TIL localizaciones. Las diferentes subpoblaciones TIL parecían ser principalmente co-localizada en el estroma del tumor. Como en MSS CRCs, las células T CD8 + parecían constituir la mayoría de la T de linfocitos intra-epitelial infiltrarse en MSI CRC. FoxP3 + T densidad celular parecía ser baja en comparación con las células CD3 + y CD8 +, destacando el hecho de que otras células T CD4 + están presentes, lo que podría desempeñar un papel importante en MSI CRC.
En nuestro estudio, los factores predictivos de recurrencia fueron nodo criterios de invasión y VELIPI, como ya se ha informado en MSS CRC [41]. Asociación entre la densidad de células T reguladoras infiltrantes de tumor y la ausencia de criterios VELIPI es sin duda el hallazgo más importante en este estudio. Todos estos resultados necesitan ser confirmados y más precisamente definido, es de esperar en una cohorte multicéntrica mayor de pacientes MSI CRC, incluyendo más pacientes con recurrencia de la enfermedad.
Reconocimientos
Los autores desean agradecer a Jeffrey Arsham , un traductor estadounidense, por haber revisarán y modificarán el texto en el idioma original Inglés. Los autores desean agradecer a Julie Tinat para los datos relativos a las pruebas MMR línea germinal.