Extracto
Relacionado con autofagia-gen-5 (ATG-5) es una de las claves reguladores de la muerte celular por autofagia. Se ha considerado como un mecanismo molecular de protección para las células tumorales en el curso de la quimioterapia. En el presente estudio, se investigó el patrón de expresión de asociada a la resistencia ATG-5 y múltiples fármacos proteína-1 (MRP-1) en 135 tipos de cáncer gástrico (CG) de los pacientes que fueron tratados con epirubicina, cisplatino y 5-FU quimioterapia adyuvante (ECF ) después de la resección quirúrgica y explorado su potencial importancia clínica. Se encontró que tanto ATG-5 (77.78%) y MRP-1 (79.26%) fueron altamente expresado en pacientes con cáncer gástrico. ATG-5 de expresión se asoció significativamente con la profundidad de la invasión de la pared, estadios TNM y metástasis a distancia de GC (P & lt; 0,05), mientras que MRP-1 de expresión se asoció significativamente con el tamaño del tumor, la profundidad de la invasión de la pared, la metástasis de los ganglios linfáticos, estadios TNM y estado de diferenciación (P & lt; 0,05). ATG-5 de expresión se correlacionó positivamente con MRP-1 (RP = 0,616, P & lt; 0,01). El aumento de expresión de ATG-5 y MPR-1 se correlacionó significativamente con una mala supervivencia global (SG; P & lt; 0,01) y la supervivencia libre de enfermedad (DFS; P & lt; 0,01) de nuestra cohorte GC. Por otra parte, hemos demostrado que ATG-5 estaba involucrado en las células resistentes de GC, que era principalmente a través de la regulación de la autofagia de drogas. Nuestros datos sugieren que la expresión regulada por incremento de ATG-5, una característica molecular importante de la autofagia de protección, se asocia con la quimiorresistencia en GC. La expresión de ATG-5 y MRP-1 puede ser marcadores pronósticos independientes para el tratamiento GC
Visto:. J Ge, Z Chen, Huang J, J Chen, Yuan W, Deng Z, et al. (2014) La regulación positiva de la autofagia relacionada con el gen 5-(ATG-5) se asocia con quimiorresistencia en cáncer gástrico humano. PLoS ONE 9 (10): e110293. doi: 10.1371 /journal.pone.0110293
Editor: Pankaj K. Singh, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Agosto, 2014; Aceptado: 18 Septiembre 2014; Publicado: 17 de octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Ge et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de la provincia de Hunan, China (Nº 2012FJ6088). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de una considerable disminución en su tasa de incidencia en muchos países desarrollados, el cáncer gástrico (CG) sigue siendo el cuarto cáncer más comúnmente diagnosticado y la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo [1]. Durante las últimas décadas, las estrategias de tratamiento multimodales estándar, junto con otras opciones recomendadas (por ejemplo, la disección D2 y quimioterapia adyuvante) no han logrado curar una gran proporción de pacientes afectados con GC, especialmente para aquellos con enfermedades avanzadas y metastásicos, con tasas de supervivencia peores ser visto probablemente debido a la presencia de la quimiorresistencia durante el tratamiento [2]. Por lo tanto, se requiere con urgencia identificación de los eventos moleculares novedosas que se basa el desarrollo de este tipo de cáncer y su mal pronóstico, así como la comprensión de los mecanismos de la quimio-resistencia GC para la intervención clínica más eficaz y una mejor gestión de los pacientes.
En condiciones fisiológicas, autofagia es un sistema de auto-digestión lisosoma dependiente de la principal responsable de la eliminación y el reciclado de las proteínas de larga vida y dañado /intracellularorganelles obsoletos con el fin de mantener la homeostasis celular [3]. Las proteínas y orgánulos destinados a la destrucción son secuestrados dentro de las vacuolas de "doble membrana" (autofagosomas), seguido de la fusión con los lisosomas para construir complejos conocidos como autofagosomas, donde los contenidos son degradados por hidrolasas lisosomales [4]. Se ha documentado que la autofagia puede ser inducida en respuesta a muchas condiciones desfavorables incluyendo la privación de nutrientes, el estrés oxidativo o daños de ADN y sirve como un mecanismo celular de adaptación, con el tiempo permitiendo que las células sobrevivan y proliferen, mientras que extensos o persistentes resultados autofagia en la muerte celular [ ,,,0],5]. Las alteraciones en la activación fisiológica, el montaje y la función de la vía de la autofagia se han observado cada vez más en una amplia variedad de cánceres humanos, aunque el papel exacto que desempeña la autofagia en la génesis y progresión del cáncer sigue siendo objeto de controversia. Algunos de los datos a favor de la idea de que la autofagia suprime la tumorigénesis, mientras que otras pruebas sugieren que la autofagia es capaz de desencadenar la iniciación del tumor y protege a las células tumorales de la apoptosis [6]. Curiosamente, se ha descubierto recientemente la inhibición de la autofagia para mejorar la actividad anti-tumor de varios agentes citotóxicos. Li y sus colegas informaron que la autofagia se activó como un mecanismo de protección contra los efectos celulares de 5-FU-tratamiento y la inhibición de la autofagia de 3-metiladenina aumentada la apoptosis inducida por 5-FU en las células de cáncer de colon [7], [8]. Por otro lado, se demostraron algunos medicamentos contra el cáncer (por ejemplo cetuximab y dasatinib) para inducir la muerte celular autofágica través de diferentes mecanismos en algunas células de cáncer [9] - [13]. La maquinaria molecular por el que la autofagia regula la supervivencia o la muerte de las células neoplásicas se mantiene hasta la fecha no han sido aclarados. La vía de la autofagia es un proceso altamente dinámico modulada predominantemente ejecutado por el (ATG) de la familia relacionados con la autofagia de los genes, que se rige por varias quinasas clave, como mTOR, PI3K /Akt, la AMPK y MAPK [14], [15]. ATG-5 es un regulador central necesarios para la autofagia en términos de su participación en el alargamiento autofagosoma [16]. la expresión forzada de ATG-5 células tumorales sensibles a los fármacos contra el cáncer el tratamiento tanto de
in vitro
y
in vivo
; en contraste inhibición de ATG-5 siRNA mediada condujo a la resistencia parcial a la quimioterapia [17]
quimioterapia adyuvante postoperatoria es actualmente un tratamiento importante para GC.; sin embargo, la eficacia global de la quimioterapia sigue siendo pobre, posiblemente como consecuencia de la presencia de resistencia a múltiples fármacos fenotipo (MDR). A diferencia de otras entidades tumorales, la expresión de las moléculas clásicas MDR-mediadores tales como glutatión S-transferasa y múltiples fármacos gen de resistencia a 1 no es muy frecuente en los tejidos GC, lo que indica que podría existir un mecanismo complicado para el desarrollo de la MDR en esta enfermedad maligna [ ,,,0],18]. Como uno de los mecanismos clásicos resistentes a los medicamentos, a múltiples fármacos proteína asociada a la resistencia 1 (MRP1 /ABCC1) se ha encontrado para ser fuertemente expresado en GC y por tanto, pueden ejercer un papel fundamental en la mediación de MDR en GC [19], [20]. Sin embargo, aún se desconoce si MRP-1 de expresión se asocia con ATG-5 de expresión. Y también si la autofagia está involucrado en quimiorresistencia en pacientes con cáncer gástrico no es claro.
En el presente estudio, se emplearon primera inmunohistoquímica para investigar el perfil de expresión de ATG-5 y MRP1 en una suma de 135 pacientes que recibieron ECF GC (epirubicina, cisplatino y 5-FU) la quimioterapia adyuvante después de la resección quirúrgica. También se evaluaron las correlaciones entre ATG-5 y MRP-1 de expresión, así como su expresión con varias características clinicopatológicas de los resultados de GC y clínicos.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras de tejidos
Un total de 135 pacientes con cáncer gástrico que consta de 91 varones y 44 mujeres que se sometieron a cirugía en el Departamento de cirugía gastrointestinal del hospital Xiangya, Universidad central del Sur (CSU), china, entre el 1 de enero de 2007 y 31 de diceimbre de 2008 estaban inscritos en este estudio. La edad media de la cohorte fue de 53,62 ± 9,73 años, con un rango de 26 a 72. tumoral Theprimary GC tissuesand emparejados se obtuvieron tejidos no cancerosos (NC) localizados al menos 5 cm de distancia del núcleo del tumor después de la resección quirúrgica e inmediatamente procesadas y se almacena hasta su uso posterior. Ninguno de los pacientes reclutados tenían la quimioterapia o la radioterapia antes de la operación quirúrgica. El diagnóstico histopatológico se llevó a cabo antes de la operación y se confirmó por la cirugía. Todos los participantes con el estadio IB a IV de tumores recibieron quimioterapia ECF después de la cirugía (Dosis: epirrubicina 50 mg /m
2 el día 1, cisplatino 60 mg /m
2 el día 1 y la infusión intravenosa continua de 5-FU 500 mg /m
2 /día durante 4 días, repetida cada 3 semanas hasta 24 semanas). Las características clínicas de estos pacientes se enumeran en la Tabla 1.
Se revisaron todos los casos de este estudio y todos los especímenes fueron histopatológicamente reexaminadas en octubre de 2012. La profundidad de la invasión de la pared, los ganglios linfáticos regionales metástasis, y el grado histológico fueron confirmados por el mismo grupo de dos patólogos altos experimentados. Los pacientes fueron clasificados por el estado de diferenciación de las células cancerosas en tres grados histológicos: así, moderados y pobres. Sobre la base de una combinación de afectación tumoral loco-regional y la presencia de metástasis, todos los casos se organizaron de acuerdo a la clasificación TNM de tumores malignos agrupamiento por etapas (TNM) [21]. Para el análisis de supervivencia, se utilizó la fecha de operación para representar el punto de inicio de la visita de seguimiento. Los pacientes que murieron de otras enfermedades en lugar de GC u otros eventos inesperados fueron excluidos de la colección de casos. La causa de la muerte reclutados en este estudio fue el agravamiento de GC. La supervivencia global (SG) se calculó como el período comprendido entre la fecha de la cirugía inicial a la fecha de la muerte, o la fecha de la última visita de seguimiento como el punto final. La supervivencia libre de enfermedad (DFS) se define como el intervalo de tiempo desde la cirugía hasta la fecha de recidiva local o metástasis del primer órgano distante. Consentimiento informado, se obtuvo de cada paciente antes de la cirugía y este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación de la Universidad Central del Sur, China. Todas las muestras se manipulan y hacen anónimos de acuerdo con las normas éticas y legales.
La inmunohistoquímica
Las muestras frescas fueron fijadas en 10% formalina tamponada neutra, y sucesivamente, con parafina. Los tejidos incluidos en parafina se cortaron en 4 micras y luego eliminó la parafina con xileno y se rehidrata para su posterior H & amp; E o tinción inmunohistoquímica peroxidasa utilizando el sistema EnVision DAKO. En resumen, después de la digestión proteolítica y bloqueo con la peroxidasa endógena, las diapositivas de tejido se incubaron con los anticuerpos primarios (ATG5: ab54033; MRP1: ab32574; Abcam Inc., Cambridge, Reino Unido) contra respectivas proteínas diana a una dilución de 1:500 durante la noche a 4 ° C. Después de lavar con PBS, se emplean entonces peroxidasa de polímero marcado y el sustrato-cromógeno con el fin de visualizar la tinción immnohistochemical. Por último, las secciones se counterstained con hematoxilina, encubrimiento deslizó con medio de montaje, y se examina al microscopio óptico. Todos los procedimientos se llevaron a cabo en el Departamento de Patología, Hospital Xiangya, C.S.U. Los portaobjetos se interpreta de forma independiente por dos patólogos experimentados, que eran ciegos a la información de los pacientes. Se cuantificó la intensidad de la tinción y el porcentaje de células teñidas utilizando un enfoque descrito previamente [22], [23]: el porcentaje de células teñidas positivamente (0% -100%) se multiplica por el patrón de intensidad de la tinción dominante, considerando 1 como negativo o rastrear, 2 como débil, moderado y 3 como 4 tan fuerte. Por lo tanto, la puntuación total varió de 0 a 400. Los pacientes fueron clasificados posteriormente en cuatro subgrupos diferentes: la puntuación de 0-99, la puntuación de 100-199, 200-299 puntuación y la puntuación de 300-400
Western blot
los extractos celulares se prepararon usando NaCl 0,14 M, 0,2 M de trietanolamina, 0,2% desoxicolato de sodio, 0,5% Nonidet P-40 y se completará con un inhibidor de la proteasa (todos los productos eran de Sigma, St. Louis, Missouri , ESTADOS UNIDOS). A continuación, muestra de proteína se llevó a cabo a través de un gel de dodecilsulfato de sodio 12% electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirió a una membrana. Las membranas transferidas se incubaron posteriormente durante la noche a 4 ° C con un anticuerpo primario. Después del lavado, la membrana se incubó con una peroxidasa de rábano picante (HRP) = Conectado anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios fueron anti-ATG-5 (Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti-LC3A /B (Abcam, Cambridge, Reino Unido) y anti-β-actina (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Todos informaron de resultados son las proporciones promedio de tres experimentos independientes diferentes.
proliferación de las células de ensayo
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (10.000 células /pocillo) durante 24 h antes del tratamiento. ensayos de MTT se utilizaron para evaluar la proliferación celular en diferentes puntos de tiempo después del tratamiento. El ensayo MTT se realizó como sigue: se añadió MTT a cada pocillo y las placas se incubaron a 37 ° C durante 4 h. A continuación se retiró la mezcla de medio MTT y se añadió 150 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a cada pocillo. La absorbancia se midió a 570 nm usando un espectrofotómetro de paredes múltiples
ARN de interferencia
dúplex de siRNA dirigidos ATG-5 fueron sintetizados de la siguiente manera: siRNA-ATG5-486:. GACGUUG GUAACUGACAAATT; siRNA-ATG5-695: GUCCAUCUAAGGAUGCAAUTT y siRNA-ATG5-938: GACCUUUCAUUCAGAAGCUTT. dúplex de siRNA que contienen secuencias no específicas se utilizaron como un control negativo (NC): UUCUCCGAACGUGUCACGUTT. Diferentes siRNAs fueron transfectadas por separado en las células usando el reactivo Lipofectamine 2000, y el medio se reemplazó 6 h después de la transfección.
Real-time RT-PCR
El ARN total de las líneas celulares y tejidos eran extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN se midió utilizando un espectrofotómetro. Un conjunto de ADNc se sintetizó usando 1 g de ARN total y TaqMan transcripción reversa Reactivos (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.) como se describe por el fabricante. La expresión del gen diana se evaluó utilizando un enfoque de cuantificación relativa (2
-ΔΔCt método) con β-actina como referencia interna.
inmunofluorescencia ensayo
Las células se permeabilizaron con 0,3 % de Triton X-100 durante 10 min seguido de fijación con 2-4% Metanal de 15 min, y se bloquearon con suero de oveja 3% a temperatura ambiente durante 60 min. A continuación, se sondaron con anticuerpos primarios anti-LC3B (Santa Cruz, CA, EE.UU.) durante la noche a temperatura ambiente, y las células se lavaron tres veces con PBS. Teñidas con Alexa Fluor 488 conjugado 488 IgG de conejo anti-cabra de 1 h a temperatura ambiente, y luego las células se lavaron tres veces con PBS. Los núcleos se visualizaron mediante tinción con DAPI (Sigma, EE.UU.) durante 2 min. Se observaron las células teñidas con microscopio de fluorescencia invertida.
El análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SPSS 15.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Los datos cuantitativos se presentan como media ± desviación estándar. χ de Pearson se utilizó
2 prueba para comparar la diferencia entre los datos clasificados, mientras que la prueba de un solo sentido-ANOVA se realizó para comparar la diferencia entre los datos cuantitativos. Los análisis de supervivencia se llevaron a cabo utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank. El modelo de regresión de Cox se realizó para evaluar el índice de riesgo independiente de cada variable en el análisis multivariante. La correlación entre ATG5 y MRP1 expresión se examinó mediante la prueba de correlación bivariada (Pearson). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando
Los valores P
eran menos de 0,05.
Resultados
Expresión de ATG-5 y MRP-1 en GC
el patrón de expresión y localización de ATG-5 y MRP-1 en nuestros pacientes con cáncer gástrico, que fueron tratados con epirubicina, cisplatino y la quimioterapia adyuvante con 5-FU (ECF) después de la resección quirúrgica, fueron examinadas usando el análisis inmunohistoquímico. Entre las muestras de GC 135, 105 (77.78%) fueron positivos para ATG-5 inmunoreactividad, y 107 (79,26%) eran MRP-1 positivo. Como se muestra en la Figura 1, se encontró que ATG5 se expresa predominantemente en el citoplasma. Por otra parte, la sobre expresión de ATG-5 se correlacionó positivamente con la de MRP-1 en GC. (R = 0,616,
P Hotel & lt; 0,001), según lo revelado por la prueba de correlación bivariante. La expresión positiva en los tejidos no cancerosos adyacentes fueron 113 (83,70%) para ATG-5 y 89 (65,93%) para MRP-1. Los datos mostraron que tanto ATG-5 y MRP-1 se expresaron positivamente en el cáncer y no cancerosas tejidos, lo que sugiere que ATG-5 y MRP-1 pueden ser inducidos por la quimioterapia en ambos tejidos tumorales y no tumorales. Como todas nuestras muestras de los pacientes fueron tratados con quimioterapia ECF, y hemos encontrado que tanto ATG-5 y MRP-1 se expresa altamente correlacionada positivamente y en esas muestras. Mientras tanto, el estudio anterior indica que MRP-1 tal vez asociada con resistencia a múltiples fármacos en GC. Junto con la conclusión anterior, nuestros resultados sugieren que el ATG-5 y MRP-1 pueden estar involucrados en la quimio-resistencia en pacientes con cáncer gástrico.
(A) ATG-5 manchas en los tejidos gástricos no cancerosas anotó 285 (× 200) ; (B) ATG-5 manchas en los tejidos tumorales GC anotaron 50 (× 400); (C) ATG-5 de tinción en los tejidos tumorales GC obtuvo 270 (× 400); (D) ATG-5 manchas en los tejidos tumorales GC obtuvo 400 (× 200).
Las asociaciones entre la expresión de ATG-5 o MRP-1 y las características clinicopatológicas de GC
La asociaciones de ATG-5 y MRP1 expresión con diversos parámetros clínico de GC se muestran en la Tabla 1 y la Tabla 2, respectivamente. La expresión de ATG-5 se asoció significativamente con la profundidad de la invasión de la pared, metástasis a distancia y estadios TNM de GC (
P Hotel & lt; 0,001,
P = 0,018
,
P
& lt; 0,001 respectivamente). MRP-1 de expresión se asoció significativamente con el aumento de tamaño del tumor, la profundidad de la invasión de la pared, los ganglios linfáticos regionales metástasis, estadios TNM (
P = 0,032
,
P Hotel & lt; 0,001, p = 0,016, P & lt; 0,001, respectivamente) y el estado de diferenciación (
P
= 0,005). A fin de determinar la participación o f ATG-5 y MRP-1 en el desarrollo GC, se realizó el análisis de supervivencia dentro de nuestras muestras de pacientes. Los análisis de nuestra supervivencia demostró que la tasa global de supervivencia global (OS) de nuestra cohorte GC era 43.70%, con una supervivencia media de 39.849 meses (IC del 95%, 35.636-44.061 meses); mientras que la tasa de supervivencia libre de enfermedad (DFS) fue 34.07%, con una supervivencia media de 35.802 meses (IC del 95%, 31.618-39.986 meses). A continuación se clasificaron los pacientes en cuatro subgrupos diferentes de acuerdo a las puntuaciones de tinción inmunohistoquímica. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier reveló una mayor ATG-5 de expresión se asoció significativamente con una SG más baja (
P Hotel & lt; 0,001) y DFS (
P
= 0,003). Las comparaciones por pares indicaron que los pacientes que lleva el ATG-5 expresión más alta (las puntuaciones 300-400) tenían las tasas de supervivencia más pobres en comparación con la de otros subgrupos (figura 2A y 2B). Consistentemente, se encontró que aumentó la expresión de MRP-1 que se asociaron significativamente con una mala OS (
P
= 0,001) y DFS (
P = 0,018
) de nuestros pacientes con cáncer gástrico. El subgrupo con los puntajes más altos de expresión MRP1 (0-99) parecían tener el peor pronóstico (Figura 2C y 2D) en comparación con otros subgrupos. Nuestros datos también mostraron que no había una correlación significativa entre estadios TNM y la supervivencia de los pacientes de GC. Los pacientes en estadio III y IV de tumores muestran un peor pronóstico en comparación con aquellos que albergan tumores en estadio IB y II (
P & lt; 0,01
) (Figura 2E y 2F). Más interesante aún, el modelo de regresión de riesgos multivariante de Cox demostró que el ATG-5 y MRP-1 los niveles de expresión y estadios TNM eran todos los indicadores pronósticos independientes e importantes para predecir el OS (
P = 0,037
,
P
= 0,005,
P Hotel & lt; 0,001, respectivamente) y DFS (
P = 0,004
,
P = 0,008
,
P Hotel & lt; 0,001 respectivamente) de GC (Tabla 3). Nuestros datos indican el ATG-5 y MRP-1 estaban estrechamente relacionados con el desarrollo de GC y pueden servir como marcadores de pronóstico pobre en el tratamiento de GC.
Los pacientes (A y B) se dividieron en cuatro siguientes subgrupos basado en ATG -5 inmunotinción: 0-99 anotado (curva a), anotó 100-199 (curva b), anotó 200-299 (curva c) y anotó 300-400 (curva d). La diferencia entre los diferentes subgrupos fue estadísticamente significativa según la evaluación de las comparaciones generales de log-rank (OS:
P Hotel & lt; 0,001, DFS:
P
= 0,003). Pairwise comparaciones de log-rank mostraron que el subgrupo D exhibió las tasas de supervivencia más pobres en comparación con otros subgrupos (OS:
P Hotel & lt; 0,05, DFS:
P Hotel & lt; 0,01). Los pacientes (C y D) fueron divididos en cuatro siguientes subgrupos basados en MRP-1 inmunotinción: anotó 0-99 (curva a), anotaron 100-199 (curva b), se calificó 200-299 (curva c) y anotó 300-400 (curva d). La diferencia entre los distintos subgrupos fue estadísticamente significativa por las comparaciones generales de log-rank (OS:
P = 0,001
, DFS:
P = 0,018
). Pairwise comparaciones de log-rank mostraron que el subgrupo A tenía el pronóstico más favorable entre los cuatro subgrupos (OS:
P Hotel & lt; 0,05, DFS:
P Hotel & lt; 0,001). (E y F) Los pacientes fueron divididos en cuatro subgrupos en función de los diferentes estadios TNM. La diferencia entre los diferentes subgrupos fue estadísticamente significativa por las comparaciones generales de log-rank (OS:
P Hotel & lt; 0,001, DFS:
P Hotel & lt; 0,001). Pairwise comparaciones de log-rank mostraron que los subgrupos III o IV exhiben tasas de supervivencia más pobres que el de los subgrupos IB y II (OS:
P Hotel & lt; 0,01, DFS:
P Hotel & lt; 0,001).
ATG-5 se reguló de manera significativa en las células chemoresistant
Para explorar más a fondo el papel de ATG-5 en la tumorigénesis y resistente a los medicamentos. Se detectó la expresión de proteínas en varias líneas celulares de cáncer gástrico (AGS, BGC-832, SGC7901, SGC7901 /DPP y MKN45) y en una línea inmortalizada gástrico humano de células epiteliales de la mucosa (GES). Curiosamente, se encontró que ATG-5 se sobreexpresa de manera espectacular en la línea celular resistente a la DPP, las células SGC7901 /DPP, en comparación con todas las otras líneas celulares que incluyen células SGC7901 sensible DPP (Figura 3A). Se confirmó, además, que las células SGC7901 /DPP son resistentes al tratamiento DPP. El IC 25, IC50 y IC75 fueron 15,4 M, 38,7 M y 93,53 M en SGC7901 células. En contraste, el IC 25, IC50 y IC75 fueron 120,03 mu M, 271.9 M y 423,7 micras de SGC7901 /DPP (Figura 3B). Se trata de 5 a 9 veces mayor que la de las células no resistentes a los fármacos. Nuestro hallazgo sugiere fuertemente que el ATG-5 contribuye a la resistencia de las células GC drogas.
(A) El nivel de ATG5 se detectó en las líneas celulares utilizando análisis de Western blot. β-actina se utilizó como control interno. (B) La IC25, IC50 e IC75 del SGC-7901 y SGC-7901 /DDP células se ensayaron usando los ensayos de MTT después del tratamiento de la DPP.
Inhibición de ATG-5 sensibilizado células chemoresistant a tratamiento farmacológico
a fin de probar que ATG-5 contribuye a la resistencia de las células GC fármaco, utilizamos pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) para derribar la expresión de ATG-5. Tres siRNAs fueron diseñados. Nuestra PCR en tiempo real y los resultados Western Blot mostró que los tres siRNAs inhibieron la expresión de ATG-5 tanto en ARNm y proteínas (Figura 4A y 4B). Elegimos uno, siRNA-ATG5-695, con la más alta eficiencia desmontables para llevar a cabo el siguiente experimento. Nos caída ATG-5 expresión y luego trataron las células con DPP. capacidad de proliferación celular se examinó a los 0, 48 y 72 horas después del tratamiento. Nuestro resultado mostró que knockdowning ATG-5 no afectó a la proliferación celular en células SGC7901 /DPP comparación con el control siRNA (siRNA NC). tratamiento DPP inhibida solo ligeramente la proliferación de las células. Curiosamente, cuando la expresión de caída ATG-5 y trataron las células con DPP, al mismo tiempo, la capacidad de proliferación de las células se suprimió aún más en comparación con las células tratadas con DPP solo 48 y 72 horas después del tratamiento (Figura 4 C). Nuestros datos apoyan además que ATG-5 contribuye a la resistencia de las células GC
la droga.
(A) El nivel de ARNm de ATG-5 fue detectado por PCR en tiempo real después del tratamiento con siRNAs. GAPDH se utilizó como controles internos. (B) El nivel de proteína de ATG-5 se detectó por Western blot después del tratamiento con siRNAs. β-actina se utilizó como control interno. (C) La capacidad de proliferación se ensayó usando el ensayo de MTT 48 horas o 72 horas después del tratamiento diferente.
La autofagia participó en resistentes de las células DC fármaco
Como ATG-5 es un regulador central de la autofagia, se especuló que la autofagia puede estar implicado en resistentes de células GC fármaco. Así que utilizamos 3MA, que es un inhibidor de la autofagia, para el tratamiento de las células resistentes a los fármacos. Como era de esperar, se encontró que 3MA junto con el tratamiento de la DPP tuvo un efecto similar con ATG-5 kncokdown junto con el tratamiento de la DPP (Figura 4C y 4D). Los datos demuestran que la autofagia contribuye a resistente al fármaco. A continuación, se examinó si la autofagia fue cambiado durante el tratamiento. Se utilizó el ensayo de inmunofluorescencia para detectar el nivel de expresión LC3B, que es un marcador de la autofagia en las células. Nuestros datos muestran que la autofagia fue suprimido después de silenciar ATG-5 o el tratamiento de las células con 3MA (Figura 5A). Y el resultado de transferencia Western confirmó además que la expresión de proteínas LC3A /B sólo se vio afectada en las células tratadas con siRNA-ATG5 o 3MA. En consecuencia, la proliferación celular se inhibió aún más sólo cuando la autofagia fue inhibida (Figura 4 y Figura 5). Por lo tanto, nuestros datos revelaron que ATG-5 estaba involucrado en la resistencia a fármacos de las células DC, que fue afectan principalmente a través de la autofagia de las células cancerosas.
(A) La autofagia se detectó mediante ensayo de inmunofluorescencia de LC3B en las células 48 horas después del tratamiento diferente. (B) Los niveles de proteína de LC3A y LC3B se ensayaron por transferencia de Western. β-actina se utilizó como control interno.
Discusión
GC sigue siendo uno de los tumores malignos más frecuentes en una base global a pesar de su disminución de la incidencia y el número total se prevé para subir continuamente como resultado del crecimiento demográfico. En los hombres, GC ocupa el segundo lugar en el índice de mortalidad; en las mujeres, es el cuarto de la mortalidad [24], [25]. La tasa bruta de mortalidad de GC en China fue de 25,2 por 100 000 [26]. En nuestro estudio, hemos examinado la expresión de ATG-5 y MRP-1 en una cohorte de pacientes GC después de la quimioterapia. A continuación, hemos demostrado que ATG-5 se reguló en cisplatino (DDP) línea celular resistente. Además, después de ATG-5 expresión o aotophogy se inhibió, las células cancerosas fueron sensibilizados al tratamiento DPP. Nuestros resultados proporcionan nueva información sobre el mecanismo de quimioresistente en la progresión del GC.
Se evaluó el perfil exression de ATG-5 y MRP-1 en 135 pacientes chinos GC. En un acuerdo con el informe anterior [22], nuestros resultados muestran que un alto porcentaje de los tejidos GC expresó ATG-5, y ATG-5 de expresión se asoció estadísticamente con la profundidad de la invasión de la pared, metástasis a distancia y estadios TNM de GC. Estos hallazgos apoyan la idea de que alto nivel de expresión de ATG5 puede contribuir a, en cierta medida, un fenotipo más agresivo y maligno en GC. Este punto de vista se ve apoyado por nuestro hallazgo de la asociación entre una mayor expresión ATG5 en GC y peor pronóstico de los pacientes (ver más adelante). Más importante aún, hemos identificado una correlación positiva entre el ATG-5 y MRP1 expresión en nuestra cohorte GC. Teniendo en cuenta el hecho de que la MRP1 es una proteína transmembrana de transporte ABC bien conocido por promover el fenotipo MDR en GC, es razonable proponer que ATG-5 puede estar también implicada en la quimio-resistencia que confiere GC a través de ciertos mecanismos moleculares desconocidos.
es ampliamente aceptado que la recurrencia y metástasis son dos obstáculos importantes en nuestros esfuerzos por mejorar la baja OS y DFS tasa de supervivencia de GC. Quimio-resistencia sigue siendo una de las razones más importantes que conducen a la repoblación tumoral /recurrencia después del tratamiento. opción adecuada de tratamiento individual, sin duda, será beneficioso para mejorar el resultado clínico; no obstante, la decisión actual de tratamiento depende principalmente de los estadios TNM [27], [28]. nuestros análisis de la supervivencia en los 135 pacientes con cáncer gástrico en estadio IB a IV de tumores revelaron que tanto ATG-5 y MRP-1 de expresión fueron capaces de predecir de forma independiente del sistema operativo y DFS después del tratamiento con quimioterapia adyuvante ECF, lo que sugiere que el control de sus niveles de expresión en la combinación de marcadores pronósticos convencionales nos pueden proporcionar una valiosa información adicional para una mejor evaluación del efecto de la quimioterapia en pacientes con cáncer gástrico. Curiosamente, encontramos el ATG-5 se sobreexpresa en líneas celulares resistentes a drogas GC. Y silenciar ATG-5 puede sensibilizado las células resistentes a los medicamentos de la quimioterapia de nuevo. Nuestros datos sugieren que ATG-5 puede ser un objetivo para paitents quimiorresistentes.
La acumulación de pruebas ha sugerido que la autofagia es capaz de desencadenar tanto la supervivencia celular y la muerte celular en diferentes contextos. Liu et al informaron de que a través de la inhibición de la vía PI3K //mTOR Akt, β-elemene podría inducir la autofagia protectora para ayudar a las células GC adaptarse mejor a condiciones de estrés y protegerlos de la muerte en la apoptosis [29]. Además, estudios recientes han demostrado que la PI3K /Akt /vía de señalización mTOR es frecuentemente activa en neoplasias gastrointestinales humanos [30]. La señalización PI3K /Akt también modula la MDR en células de GC a través de la regulación de la P-glicoproteína, Bcl2 y Bax [31]. Asimismo, se ha informado de algunos agentes contra el cáncer para inhibir la señalización de mTOR e inducir la autofagia en las células cancerosas mediante la degradación de muchos de los componentes principales en el eje de mTOR [14], [32]. En general, estos datos sugieren que la autofagia podría ser inducida durante la quimioterapia, y la supresión de las vías de autofágicas utilizando inhibidor de la autofagia tienen potencial para mejorar la eficacia de quimioterapia en pacientes con GC ATG-5 de alta expresión. En apoyo, se encontró que cuando se inhibió la autofagia, las células resistentes a los fármacos también se sensibilizaron al tratamiento farmacológico de nuevo como el silenciamiento ATG-5 expresión. Por lo tanto, nuestro apoyo resultado que la autofagia contribuye a quimiorresistente en paciente.
En resumen, la sobre expresión de ATG-5, un jugador molecular clave de la vía de la autofagia, se asocia con la quimiorresistencia en GC. Expresión de ATG-5 y MRP-1 podría considerarse como marcadores pronósticos independientes para la predicción de OS y DFS de los pacientes de GC basado en los datos obtenidos actualmente. Sobre la base de estadios TNM, la detección de sus niveles de expresión puede ser clínicamente significativa para una mejor predicción de los resultados del tratamiento de quimioterapia en pacientes que sufren de esta enfermedad maligna. Los estudios futuros que implican evaluación de un mayor número de casos, a ser posible a partir de un origen étnico diferente, definitivamente están garantizados para confirmar nuestros hallazgos en este estudio.