Extracto
En este estudio, se sintetizaron seis 2-phenylnaphthalenes con grupos hidroxilo con altos rendimientos por la desmetilación de los correspondientes metoxi-2-phenylnaphthalenes, y una 2-fenilnaftaleno con un grupo amino se obtuvo por hidrogenación. Todos los derivados 2-fenilnaftaleno se evaluaron para la citotoxicidad, y también se determinó la relación estructura-actividad (SAR) en contra (MCF-7) células de cáncer de mama humano. Los resultados revelaron que SAR citotoxicidad fue marcadamente promovido por el grupo hidroxilo en la posición C-7 del anillo de naftaleno. La introducción de grupos hidroxilo en la posición C-6 del anillo de naftaleno y el C-4 'del anillo de fenilo bastante aumentada su citotoxicidad, pero la introducción de un grupo hidroxilo en la posición C-3' posición del anillo de fenilo disminuyeron ligeramente citotoxicidad. En general, 6,7-dihidroxi-2- (4 'hidroxifenil) naftaleno (PNAP-6h) exhibió la mejor citotoxicidad, con una CI
50 valor de 4,8 M contra la línea celular MCF-7, y mostró una baja toxicidad hacia las células epiteliales mamarias humanas normales (MCF-10A). PNAP-6H condujo a la detención celular en la fase S, lo más probable debido al aumento de los niveles de p21 y p27 y la disminución de los niveles de ciclina D1, CDK4, ciclina E, y CDK2. Además, PNAP-6H disminuyó CDK1 y la expresión de ciclina B1, más probable es que conduce a G
arresto 2 /M, y los cambios morfológicos inducidos, tales como la contracción nuclear, la fragmentación nuclear, y hypercondensation nuclear, como se observa por Hoechst 33342 tinción. PNAP-6H apoptosis inducida, muy probablemente por la promoción de la expresión de Fas, aumento de la actividad PARP, caspasa-7, caspasa-8, y la expresión de la caspasa-9, la Bax /Bcl-2 ratio, y la fosforilación de p38, y la disminución de la la fosforilación de ERK. Este estudio proporciona la primera demostración de la citotoxicidad de PNAPs contra células MCF-7 y aclara el mecanismo que subyace a la citotoxicidad inducida por PNAP
Visto:. Chang CF, Ke CY, Wu YC, Chuang TH (2015) Estructura- Relación de la actividad sintética de 2 Phenylnaphthalenes con grupos hidroxilo que inhiben la proliferación e inducir la apoptosis de las células MCF-7 de cáncer. PLoS ONE 10 (10): e0141184. doi: 10.1371 /journal.pone.0141184
Editor: Yi-Hsien Hsieh, Instituto de Bioquímica y Biotecnología, TAIWAN
Recibido: 13 Julio, 2015; Aceptado: 6 Octubre 2015; Publicado: 22 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Chang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación: los autores desean agradecer al Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán (MOST 103-2320-B-039-027-; MÁS 103-2113-. M-039-003- 103-2738 y MOST-M-039-001-), Universidad médica china (CMU103-N-05), y, en parte, la subvención del Centro de Investigación de Medicina china, la Universidad de Medicina china (Ministerio de Educación, el objetivo para el plan Universitario superior) para el apoyo financiero. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer
mama es la causa más común de muerte por cáncer en las mujeres; Por lo tanto, la búsqueda de un nuevo y efectivo agente contra el cáncer es imprescindible. derivados de naftaleno muestran potente anti-arritmia, antitumoral y la actividad antioxidante [1]. Farmacológicamente, 2-phenylnaphthalenes (PNAPs) tienen requerimientos espaciales y conformacionales similares a la genisteína (una isoflavona) y muestran un gran número de efectos biológicos y biomédicos [2]. Químicamente, naftaleno 1-sustituido, naftaleno no 2-sustituido, se obtiene mediante la sustitución electrófila aromática de naftaleno. A lo mejor de nuestro conocimiento, los estudios sobre la relación entre la estructura y la citotoxicidad de PNAPs multi-sustituidos son raros. En este estudio, hemos sintetizado sustituido PNAP-1, siete metoxi-PNAPs (PNAP-2-PNAP-8), seis correspondientes hidroxi-PNAPs (PNAP-2h-PNAP-7c), y un amino-PNAP (PNAP-8h) e investigado sus relaciones contra el cáncer y mecanismos de acción en la línea celular MCF-7 de estructura-actividad.
Varios estudios han demostrado que la genisteína y los compuestos con la fenil-1-benzopiran-4-ona columna vertebral inhiben el crecimiento de células de cáncer a través de la detención del ciclo celular y la inducción de la apoptosis [3-5]. complejos de ciclina-quinasa dependiente de ciclina (CDK) son los principales reguladores del ciclo celular, que es un proceso muy complejo y estrechamente regulado [6,7]. El G
transición de fase 1 /S está regulada por la activación de la ciclina D1-CDK4 /6 complejo y el complejo ciclina E-CDK2 [8,9], mientras que el G
2 transición de fase /M está regulada por la activación de la ciclina B1-CDK1 complejo [10,11]. La desregulación del ciclo celular provoca una falta de diferenciación y el crecimiento aberrante.
La apoptosis es un proceso evolutivo que conduce a la muerte celular programada [12]. El proceso de la apoptosis incluye cambios morfológicos (por ejemplo, el encogimiento celular, formación de ampollas en la membrana, condensación de la cromatina, y fragmentación nuclear) y cambios bioquímicos (por ejemplo, avería de ADN, la escisión de proteínas, y la reticulación de proteínas) [13,14]. Muchos agentes contra el cáncer inducen la muerte celular por activación de caspasas, que forman parte de una vía apoptótica común [15,16]. vías intrínsecas y extrínsecas que regulan la apoptosis dependiente de caspasa se han identificado [17]. En la vía extrínseca, Fas, un receptor de muerte, conduce a la formación de un inductor de muerte FADD-caspasa-8 complejo de señalización [18]. La vía intrínseca se controla por la familia Bcl-2 de proteínas. En primer lugar, la relación de Bax /Bcl-2 aumenta y este aumento es seguido por la liberación de citocromo c, lo que lleva a la activación de la caspasa-9 y la caspasa-3 [19]. La vía MAPK es bien conocido por su regulación de la supervivencia celular y la apoptosis. La familia MAPK se compone de tres grandes quinasas ERK, p38: y JNK [20]. ERK es preferentemente activada por factores de crecimiento, que conduce al crecimiento celular y la supervivencia. p38 y JNK son preferentemente activados por la estimulación de citoquinas y el estrés oxidativo, lo que resulta en la diferenciación celular y la apoptosis [21,22]. No está claro si el /vía extrínseca o intrínseca de la vía MAPK se activa en la apoptosis mediada por PNAP. En este estudio, se evaluó la citotoxicidad de una serie de PNAPs contra células MCF-7 y se aclararán el mecanismo subyacente a la citotoxicidad inducida por PNAP.
Materiales y Métodos
Química
los métodos utilizados para sintetizar los derivados de PNAP quince se muestran en la Fig 1. 2-fenilnaftaleno (PNAP-1) y siete metoxi-PNAPs (PNAP-2-PNAP-8) se sintetizaron a partir disponible comercialmente fenilacetonitrilos y benzaldehídos de acuerdo con métodos previamente reportados [23]. Seis correspondientes-PNAPs hidroxi (PNAP-2H-PNAP-7H) se obtuvieron mediante la desmetilación de PNAP-2-PNAP-7 con excelentes rendimientos (91% a 100%). Un amino-PNAP (PNAP-8H) se obtuvo mediante la hidrogenación de PNAP-8 con un rendimiento de 86%. La
1 H y
13C NMR de PNAP-2h-PNAP-8c están disponibles en la información de apoyo (Figuras A-G en S1 Archivo). Todas las PNAPs se disolvieron en DMSO a una concentración de 50 mM para preparar soluciones madre, que se almacenaron a -20 ° C.
Los ocho 2-phenylnaphthalenes (PNAP-1-PNAP-8) eran fácilmente obtenido a partir de fenilacetonitrilos y benzaldehídos a través de seis pasos. Posteriormente, los seis hidroxi-PNAPs (PNAP-2H-PNAP-7c) se obtuvieron por desmetilación de la correspondiente metoxi-PNAPs (PNAP-2-PNAP-7). Desafortunadamente, los intentos de la desmetilación de PNAP-8 en las mismas condiciones llevado a mezclas complejas. Otra hidrófilo amino-PNAP (PNAP-8h) fue producido por la reducción de los nitro-PNAP (PNAP-8).
Procedimiento general para la preparación de hidroxi-PNAPs.
BBr
3 en CH
2Cl
2 a una concentración de 1 M (5 ml, 5 mmol) se añadió lentamente a una solución de metoxi-PNAPs (PNAP-2-PNAP-7, 0,5 mmol) en CH
2Cl
2 (20 ml) a 0 ° C. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 1 h. La solución resultante se vertió en H
2O (50 ml). El H
2O capa se extrajo con EtOAc (3 × 50 ml), y los extractos combinados se lavaron con H
2O (3 × 50 ml), se secó con MgSO anhidro
4, y se filtró. El filtrado se concentró, y el residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice y se eluyó con EtOAc para obtener hidroxi-PNAPs (PNAP-2H-PNAP-7H). Los datos espectrales completos de estos compuestos se describen como sigue
6-hidroxi-2-fenilnaftaleno (PNAP-2h)
91% de rendimiento..; sólido blanco, pf 176-177 ° C (lit. [24], pf 169-170 ° C).
1 H RMN (500 MHz, CDCl
3)
δ
5,12 (1H, s), 7,12 (1H, dd,
J
= 8,8, 2,4 Hz), 7,17 (1H, s), 7,36 (2H, t,
J
= 7,4 Hz), 7,47 (1H, t,
J
= 7,4 Hz), 7,69-7,71 (3H, m ), 7,75 (1H, d,
J
= 8,8 Hz), 7,80 (1H, d,
J
= 8,8 Hz), 7,97 (1H, s);
13C RMN (125 MHz, CDCl
3)
δ
109,3, 118,2, 125,7, 126,3, 126,9, 127,1, 127,2 (2 × C), 128,8 (2 × C), 129.2, 130,2, 133,8, 136,4, 141,2, 153,5; IR (KBr) 3339, 3046, 1618, 1495, 1292, 1194 cm
-1; ESIMS
m /z gratis (int rel) 219 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z calculado para C
16H
11O: 219.08044; encontrado:.. 219,08036 [M-H]
-
6,7-dihidroxi-2-fenilnaftaleno (PNAP-3h)
98% de rendimiento; sólido blanco, pf 205-207 ° C.
1 H RMN (500 MHz, DMSO-
d
6)
δ
7,12 (1H, s), 7,20 (1H, s), 7,32 (1H, t,
J
= 7,5 Hz), 7,45 (2H, t,
J
= 7,5 Hz), 7,50 (1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,65 ( 1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,72 (2H, d,
J
= 7,5 Hz), 7,86 (1H, s), 9,57 (2H, br s);
13C RMN (125 MHz, DMSO-
d
6)
δ
109,5, 110,2, 112,2, 123,4, 126,4, 126,8 (2 × C), 127,0, 128,3 , 129,0 (2 × C), 129,3, 134,7, 140,9, 147,3, 147,4; IR (KBr) 3495, 3395, 1628, 1528, 1119 cm
-1; ESIMS
m /z gratis (int rel) 235 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z calculado para C
16H
11O
2: 235,0754; encontrado:.. 235.0755 [M-H]
-
2- (4'-hidroxifenil) naftaleno (PNAP-4h)
100% de rendimiento; sólido blanco, pf 166-167 ° C (lit. [25], pf 167-169 ° C).
1 H RMN (500 MHz, CDCl
3)
δ
4,89 (1H, s), 6,95 (2H, d,
J
= 8,6 Hz), 7.44- 7,50 (2H, m), 7,61 (2H, d,
J
= 8,6 Hz), 7,70 (1H, dd,
J
= 8,5, 1,7 Hz), 7,84-7,90 (3H , m), 7,97 (1H, s);
13C RMN (125 MHz, CDCl
3)
δ
115,7 (2 × C), 125,0, 125,4, 125,7, 126,2, 127,6, 128,0, 128,3, 128,7 (2 × C), 132,3, 133,7, 133,9, 138,1, 155,1; IR (KBr) 3564, 3055, 1603, 1512, 1180 cm
-1; ESIMS
m /z gratis (int rel) 219 (41, [M-H]
-); HRESIMS
m /z calculado para C
16H
11O: 219.08044; encontrado:.. 219,08043 [M-H]
-
6-hidroxi-2- (4'-hidroxifenil) naftaleno (PNAP-5h)
93% de rendimiento; sólido blanco, pf 127-128 ° C (lit. [26], pf 258-262 ° C).
1 H RMN (500 MHz, DMSO-
d
6)
δ
6,86 (2H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,01 ( 1H, dd,
J
= 8,8, 2,0 Hz), 7,10 (1H, s), 7,56 (2H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,63 (1H, dd,
J
= 8,6, 1,6 Hz), 7,70 (1H, d,
J
= 8,6 Hz), 7,78 (1H, d,
J
= 8,8 Hz), 7,94 (1H, s), 9,51 (1H, br s), 9,70 (1H, br s);
13C RMN (125 MHz, DMSO-
d
6)
δ
108,6, 115,9 (2 × C), 119,1, 124,1, 125,2, 126,7, 127,8 (2 × C), 128,3, 129,7, 131,2, 133,5, 134,6, 155,3, 157,0; IR (KBr) 3183, 3030, 1603, 1512, 1265, 1204 cm
-1; ESIMS
m /z gratis (int rel) 235 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z calculado para C
16H
11O
2: 235,0754; encontrado:.. 235.0751 [M-H]
-
6,7-dihidroxi-2- (4'-hidroxifenil) naftaleno (PNAP-6h)
98% de rendimiento; sólido blanco, pf 280-282 ° C.
1 H RMN (500 MHz, DMSO-
d
6)
δ
6,84 (2H, d,
J
= 8,1 Hz), 7,08 ( 1H, s), 7,13 (1H, s), 7,42 (1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,53 (2H, d,
J = 8,1 Hz
), 7,58 ( 1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,73 (1H, s), 9,46 (3H, br s);
13C RMN (125 MHz, DMSO-
d
6)
δ
109,5, 109,9, 115,8 (2 × C), 122,0, 122,2, 126,2, 127,7, 127,8 (2 × C), 129,3, 131,6, 134,8, 146,8, 147,3, 156,8; IR (KBr) 3495, 3341, 1597, 1520, 1119 cm
-1; ESIMS
m /z gratis (int rel) 251 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z calculado para C
16H
11O
3: 251.07027; encontrado:. 251,07032 [MH]
-
6,7-dihidroxi-2- (3 ', 4'-dihidroxifenil) naftaleno (PNAP-7h)
rendimiento del 100%. ; sólido blanco, pf 230 ° C (descomp.).
1 H RMN (500 MHz, DMSO-
d
6)
δ
6,80 (1H, d,
J
= 8,2 Hz), 6,98 ( 1H, dd,
J
= 8,2, 2,0 Hz), 7,08 (1H, s), 7,09 (1H, d,
J
= 2,0 Hz), 7,13 (1H, s), 7,37 (1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,57 (1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,68 (1H, s), 8,94 (2H, br s) , 9,46 (2H, br s);
13C RMN (125 MHz, DMSO-
d
6)
δ
109,5, 110,0, 114,1, 116,2, 117,7, 122,0, 122,2, 126,2, 127,7, 129,3, 132,3, 135,1, 144,9, 145,7, 146,8, 147,3; IR (KBr) 3372, 3329, 1602, 1234, 1111 cm
-1; ESIMS
m /z gratis (int rel) 267 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z calculado para C
16H
11O
4: 267,0652; encontrado:.. 267.0647 [MH]
-
2- (4'-aminofenil) -6,7-dimetoxi-naftaleno (PNAP-8h)
PNAP-8 (77 mg, 0,25 mmol) se sometió a hidrogenación (50 psi) usando 10% de Pd /C como catalizador en tetrahidrofurano (THF, 10 ml) y EtOH (1 ml) a temperatura ambiente durante 12 h. La mezcla de reacción se filtró, y el filtrado se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice y se eluyó con EtOAc para dar PNAP-8h. Rendimiento 86%; sólido amarillo pálido, pf 190-191 ° C.
1 H RMN (500 MHz, CDCl
3)
δ
3,74 (2H, s), 4,01 (6H, s), 6,79 (2H, d,
J
= 8,1 Hz), 7,12 (1H, s), 7,15 (1H, s), 7,52 (2H, d,
J = 8,1 Hz
), 7,56 (1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,71 (1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,82 (1H, s);
13C RMN (125 MHz, CDCl
3)
δ
55,9 (2 × C), 106,1, 106,5, 115,5 (2 × C), 123,2, 123,6, 126,7, 127,8, 128,1 ( 2 × C), 129,6, 131,8, 137,0, 145,6, 149,2, 149,7; IR (KBr) 3460, 3439, 3018, 2995, 1624, 1504, 1244, 1130 cm
-1; ESIMS
m /z gratis (int rel) 280 (100, [M + H]
+); HRESIMS
m /z calculado para C
18H
17NO
2: 251.07027; encontrado: 251.07032 [M + H]
+
Cultivo de células
MCF-7 células se obtuvieron del laboratorio del Dr. Yang-Chang Wu (Facultad de Farmacia, Medicina China. células universitarios, Taiwán), y MCF-10A se obtuvieron del laboratorio del Dr. Wei-Chien Huang (Instituto Universitario de Biología del cáncer, Universidad médica de china, Taiwán). Células MCF-7 se mantuvieron en medio DMEM /F12 que contiene 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina. células MCF-10A se mantuvieron en medio DMEM /F12 que contiene CaCl 1,05 mM
2, 100 mg /ml de toxina del cólera, 5% de suero de caballo, 10 mg /ml de insulina, /ml de hidrocortisona 500 ng y 1% de penicilina-estreptomicina. Estas células fueron cultivadas en viveros de cultivo celular, los cuales quedaron a temperaturas de 37 ° C y complementado con un 5% de CO
2.
viabilidad de las células de ensayo
Se sembraron células MCF-7 a una densidad de 5 × 10
3 células por pocillo en placas de 96 pocillos, se incubaron durante la noche y luego tratados con diferentes concentraciones (0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25 y 50 mM) de quince PNAPs (PNAP-1-PNAP-8 y PNAP-2h-PNAP-8h). Además, se sembraron las células MCF-10A a una densidad de 5 × 10
3 células por pocillo en placas de 96 pocillos, se incubaron durante la noche y luego tratados con diferentes concentraciones (0, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, y 100 mM) de tres PNAPs (PNAP-3H, -6h, y 7H). Después de 48 h de tratamiento, se añadieron 10 l de solución de MTT (5 mg /ml en PBS) a cada pocillo, y se incubaron las células durante 4 h adicionales a 37 ° C. El medio fue entonces eliminado por completo, y se añadieron 50 l de DMSO para solubilizar los cristales de formazán de MTT. La absorbancia a una longitud de onda de 550 nm se midió entonces usando un lector de microplacas MQX200R (BioTek, VT, EE.UU.).
ciclo celular análisis
MCF-7 células se sembraron a una densidad de 3 × 10
5 células por pocillo en placas de seis pocillos, se incubaron durante la noche y después se trató con PNAP-1, -3h y -6h a tres concentraciones diferentes (5, 10, y 25 mM). Después de 48 h de tratamiento, las células se tripsinizaron, se lavaron una vez con PBS, y se fijaron en 70% de etanol durante 1 h a -20 ° C. Las células fijadas se lavaron con PBS enfriado en hielo, se suspendieron en 0,5 ml de PBS que contenía 0,2 mg /ml de ARNasa y 0,1% de Triton X-100 durante 30 minutos a temperatura ambiente, y se tiñeron con 20 mg /ml de yoduro de propidio. Se analizaron las células teñidas utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, CA, EE.UU.). La fluorescencia emitida desde el complejo de yoduro de propidio-DNA se estimó a partir de un mínimo de 10.000 células por muestra y se analizó usando el Cell Quest software Alias (BD Biosciences, EE.UU.).
análisis de transferencia de Western
MCF-7 células se sembraron a una densidad de 3 x 10
5 células por pocillo en placas de seis pocillos, se incubaron durante la noche y después se trató con PNAP-1, -3h y -6h a tres concentraciones diferentes (5, 10 , y 25 mM) durante 48 h. Las células se lavaron con PBS y se lisaron en tampón RIPA enfriado en hielo durante 30 min. Se recogió el sobrenadante y se centrifugó a 15.000 rpm y 4 ° C durante 30 min. La concentración de proteína se midió a través de un ensayo de Bio-Rad utilizando un lector de microplacas MQX200R (BioTek, VT, EE.UU.). Los lisados celulares se separaron por 10% SDS-PAGE y se transfirieron electroforéticamente sobre difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Después de varios lavados, las membranas se bloquearon con 5% de leche desnatada en (solución salina tamponada con Tris que contenía 0,1% de Tween-20) TBST durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 ° C con diferentes anticuerpos primarios contra la ciclina D1, CDK4, ciclina E, CDK2, p21, p27, ciclina B1, CDK1, escinde la caspasa-7, -8, -9, PARP, Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bid, Fas, p-p38, p38, p-JNK , JNK, p-ERK, o ERK (dilución 1: 1000). A continuación, las membranas se lavaron tres veces con TBST y se sondaron con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpo secundario (1: 2000) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados en TBST, el anticuerpo unido se visualizó utilizando el Western Blotting reactivo ECL (PerkinElmer, Boston, MA, EE.UU.), y se detectó la quimioluminiscencia usando película de rayos X Fuji médico (Tokio, Japón).
estudios de la morfología celular
Las células se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 1 × 10
5 células /pocillo, se incubó durante la noche y luego se trató con PNAP-1, -3h, y -6h a tres concentraciones diferentes (5, 10, y 25 mM) durante 48 h. Las células se lavaron una vez con PBS, y un subconjunto de las células se tiñeron con Hoechst 33342 (10 mg /ml durante 15 min). Los cambios morfológicos fueron entonces observadas por microscopía de luz a 100 × magnificación y la microscopía de fluorescencia a 200 × magnificación.
El análisis estadístico
Todos los datos se expresan como la media ± SEM de tres experimentos replicados . Las diferencias entre los grupos se compararon mediante análisis de varianza (ANOVA) y la prueba post-hoc de Tukey la diferencia honestamente significativa (HSD) usando el software SPSS 12.0 para Windows (EE.UU.). Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados y Discusión
Efecto de PNAPs en las células MCF-7 viabilidad línea celular y estudio de su relación estructura-actividad
Para investigar los efectos de los 2-phenylnaphthalenes PNAP-1-PNAP-8, sus derivados desmetilación PNAP-2h-PNAP-7c, y amino-PNAP (PNAP-8h) sobre la supervivencia celular, MCF-7 células fueron tratadas con diferentes dosis de cada compuesto (0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, y 50 mM) durante 48 h. Las tasas de viabilidad se determinaron mediante el ensayo de MTT, y los resultados se muestran en la Tabla 1. En primer lugar, PNAP-1 no mostró actividad significativa en las células MCF-7, y PNAP-2-PNAP-8, que contienen grupos metoxi, causados precipitación en el medio celular a concentraciones mayores de 5 micras (Tabla 1). Por lo tanto, los más derivados PNAP hidrófila PNAP-2h-PNAP-8c se han diseñado y sintetizado. De hecho, no se observó precipitación de PNAP-2H-PNAP-8H, muy probablemente debido a la formación de enlaces de hidrógeno intermoleculares entre el agua y el hidroxilo (o amino) grupos en los 2-phenylnaphthalenes. Tres de los derivados (PNAP-3H, -6h, y 7H) mostraron una toxicidad significativa dependiente de la dosis contra las células MCF-7, con IC
50 valores de 17,9, 4,8 y 31,8 mM, respectivamente (Tabla 1), mientras que los IC
50 valores obtenidos frente a las células MCF-10A fueron 71,0, 50,9 y 55,1 mM, respectivamente. Los resultados indican que PNAP-3h y -6h y poseen una mayor citotoxicidad selectiva contra las células MCF-7 y muestran baja toxicidad para las células MCF-10A.
Los resultados descritos anteriormente revelaron que PNAP-5h, que tiene grupos hidroxilo en la posición C-6 del anillo de naftaleno y en la posición del anillo de fenilo el C-4 ', mostraron una mejor citotoxicidad de PNAP-1, 2H, 4H y en nuestras pruebas. Este fenómeno muestra que la introducción de grupos hidroxilo en la posición C-6 del anillo de naftaleno y la posición del anillo de fenilo el C-4 'potencia la citotoxicidad. Curiosamente, los dos 2-phenylnaphthalenes PNAP-3h y 6H, que contienen un grupo hidroxilo en la posición C-7 del anillo de naftaleno, exhiben mejores actividades citotóxicas contra la línea celular MCF-7 (compárese PNAP-3h a 2H y comparar PNAP-6h a 5H). Estos resultados sugieren que la citotoxicidad es notablemente promovida por la presencia de un grupo hidroxilo en la posición C-7 del anillo de naftaleno. Por otra parte, hay que señalar que PNAP-6h mostró la mejor actividad contra la línea celular MCF-7 (IC
50 = 4,8 M). Este resultado también indica que la introducción de un grupo hidroxilo en la posición del anillo de fenilo el C-4 'mejoraría las actividades contra la línea celular MCF-7. En contraste, la presencia de un grupo hidroxilo en la posición C-3 'del anillo de fenilo en PNAP-7H puede disminuir notablemente la citotoxicidad (comparar PNAP-6H y 7H). Además, la comparación de las actividades citotóxicas de PNAP-6h y PNAP-8H sugiere que la presencia de un grupo hidroxilo, que sirve como un donador de enlace de H, en el anillo de naftaleno da mejores actividades que la presencia de un grupo metoxi, que sirve como un aceptor de enlace de H. Sobre la base de la viabilidad celular y los resultados de búsqueda y salvamento, se investigó aún más las posibles razones para la disminución de la viabilidad celular inducida por PNAP-3h y -6h y se aclararán el mecanismo subyacente.
Efecto de PNAPs sobre las características morfológicas de las células MCF -7 células
en primer lugar, el efecto de PNAP-1, -3h y -6h en la morfología celular se observó por microscopía de contraste de fase. Células MCF-7 tratadas con un control de vehículo (0,05% DMSO) o de 5 a 25 mM PNAP-1 mostró poblaciones de células denso bajo un microscopio de contraste de fase (figura 2A-2D). Las células MCF-7 fueron regulares en forma y tamaño, con núcleos excéntricos y una relativamente pequeña cantidad de citoplasma. La densidad celular y la estructura de las células tratadas durante 48 h con 5 a 25 mM PNAP-3h y -6h mostraron cambios evidentes (Fig 2E-2J). Las células se redondearon y encogido y perdieron el contacto con las células adyacentes. Además, las células apoptóticas ya no se adhirieron al substrato, haciendo que se desprenda de las placas de cultivo y flotar en el medio de cultivo. Por lo tanto, PNAP-3h y -6h condujo a una disminución en el número de células MCF-7 viables de una manera dependiente de la concentración, como se muestra en la Tabla 1.
MCF-7 células fueron tratadas con PNAP-1, -3h, y -6h a tres concentraciones (5, 10, y 25 mM) durante 48 h y, a continuación, (a-J) la morfología se observó por microscopía de luz (100 ×). Las células se tiñeron con Hoechst 33342 y, a continuación, (K-T) la morfología se observó por microscopía de fluorescencia (200 ×). (/K A) de control; (B /L) 5 M PNAP-1; (C /M) 10 M PNAP-1; (D /N) 25 M PNAP-1; (E /S) 5 M PNAP-3h; (F /P) 10 M PNAP-3h; (G /Q) 25 M PNAP-3h; (H /R) 5 M PNAP-6H; (E /S) 10 M PNAP-6h; y (J /T) 25 M PNAP-6h.
También se observó la morfología nuclear de las células MCF-7 sometidas a Hoechst 33342 tinción fluorescente después del tratamiento durante 48 h con tres concentraciones (5, 10 , y 25 mM) de PNAP-1, -3h, y -6h (Fig 2L-2T). Los núcleos de las células de control del vehículo muestran una forma oval intacto y se exhibieron una débil fluorescencia azul (Fig 2C). Sin embargo, las células tratadas con PNAP-3h (25 M) y PNAP-6h (5, 10, y 25 mM) mostraron características apoptóticas típicos, tales como la contracción nuclear, la fragmentación nuclear, y hypercondensation nuclear (Fig 2T-2T). Sobre la base de estas observaciones microscópicas, proponemos que la citotoxicidad observada puede ser parcialmente mediada por apoptosis PNAP-3H-e inducidos por -6h.
Efecto de PNAPs en las células MCF-7 del ciclo celular distribución de fase
Debido a que la proliferación celular es regulada por el ciclo celular, el efecto de PNAP-1, -3h y -6h sobre la progresión del ciclo celular en la línea celular MCF-7 fue examinado por citometría de flujo y análisis de Western blot. Los resultados del análisis de citometría de flujo indicó que el tratamiento con PNAP-6H durante 48 h aumentó el sub-G
1 población (Fig 3A). El sub-G
1 pico, que consistió en células con contenido de ADN reducida, representaba la presencia de células apoptóticas [27,28]. Además, la detención celular inducida por PNAP-6 h a la G
2 /M fase obtiene a concentraciones más bajas (5 y 10 mM) fue acompañado por una disminución en el porcentaje de células que se encuentran en la fase Go /G1. PNAP-5h y -6h causados detención en la fase S en una concentración más alta (25 mM), dieron lugar a un menor número de células que se replican y suprimieron la proliferación celular. Sin embargo, las células tratadas con PNAP-1 no mostraron ningún cambio significativo en la distribución del ciclo celular en comparación con las células de control del vehículo.
MCF-7 células fueron tratadas con PNAP-1, -3h, y -6h a las tres concentraciones (5, 10, y 25 mM) durante 48 h y, a continuación, (a) las células se fijaron y se tiñeron con yoduro de propidio para analizar el contenido de ADN por citometría de flujo. (B, C) las proteínas asociadas-ciclo celular (ciclina D1, CDK4, ciclina E, CDK2, p21, p27, ciclina B1, y CDK1) se detectó y se analizó por transferencia de western. La expresión se cuantificó con el sistema de análisis de imagen Analizador de Gel-Pro computarizado. Los datos se expresan como la media ± SEM de tres ensayos independientes. * P & lt; 0,05 y ** P & lt; 0,01 son significativamente diferentes del control
Sobre la base de estas observaciones de la distribución del ciclo celular de las células MCF-7, se analizaron los cambios en la abundancia de células. proteínas reguladoras del ciclo. complejos de ciclina-CDK son los principales reguladores de la progresión del ciclo celular [7], y la actividad de los complejos ciclina /CDK son regulados negativamente por los inhibidores de CDK, tales como p21 y p27 [29]. PNAP-3h (a 25 m) y PNAP-6H condujeron a la detención celular en la fase S, lo más probable debido al aumento de los niveles de p21 y p27 y niveles reducidos de ciclina D1, CDK4, ciclina E, y CDK2, como se determina a través de la El análisis de transferencia Western (Fig 3B y 3C). Además, PNAP-6H indujo una inhibición de la actividad de la quinasa CDK1 y una disminución en la expresión de ciclina B1, más probable es que conduce a G
2 /M detención. Por lo tanto, proponemos que la inhibición de la viabilidad celular en PNAP-3h y -6h puede ser mediada parcialmente a través de la detención del ciclo celular y la apoptosis.
PNAPs activan la vía caspasa y aumentan la expresión de las proteínas apoptóticas relativos
sobre la base de los resultados anteriores, se encontró que PNAPs pueden prevenir la proliferación, inducir la apoptosis y disminuir la viabilidad celular en la línea celular MCF-7. Es bien sabido que numerosos medicamentos contra el cáncer median la apoptosis por activación de caspasas [16]. Para demostrar que la apoptosis inducida por PNAP en células MCF-7 se produce a través de la activación de caspasas, se determinó la expresión de proteínas reguladoras clave asociados con las vías de caspasas en células MCF-7 tras la exposición a 5 a 25 mM PNAP-1, -3h, y 6H. A pesar de la falta de caspasa-3 en células MCF-7, caspasa-7, un ejecutor de la apoptosis, puede funcionar como un sustituto [30]. La caspasa-7 es capaz de escindir sustratos de tetrapéptidos específicos (por ejemplo, PARP), y la escisión de PARP es un sello distintivo importante de la apoptosis [31]. La exposición de células MCF-7 a tres concentraciones (5, 10, y 25 mM) de PNAP-3h y -6h durante 48 h aumentó significativamente los niveles de caspasa-7 escindido y PARP y aumentó la actividad de la caspasa-7 escindido y PARP de una manera dependiente de la dosis (Fig 4A). Además, la apoptosis puede ser estimulado a través de la vías extrínseca e intrínseca. Caspasa-8 se considera generalmente un activador de la apoptosis en la vía extrínseca, y la caspasa-9 desempeña un papel importante en la vía intrínseca [32]. Estos datos muestran que la expresión de la caspasa-8 y la caspasa-escindido 9 en células MCF-7 aumentó después del tratamiento con PNAP-3h y -6h de una manera dependiente de la dosis. Además, se escindió la caspasa-8 y la caspasa-9 se inhibieron parcialmente por la caspasa-8-inhibidor específico de Z-IETD-FMK y la caspasa-9-inhibidor específico de Z-LEHD-FMK. Además, los dos inhibidores también inhibe parcialmente la caspasa-7 escisión en PNAP apoptosis derivado inducida (Figura 5A y 5B) y parcialmente revirtieron la disminución inducida por PNAP-6 de la viabilidad celular, como se observa por microscopía y el ensayo MTT (Fig 5C) . Estos resultados sugieren que las vías de la caspasa-7-, mediada por la caspasa-9 caspasa-8, y pueden estar parcialmente implicado en la regulación de la apoptosis inducida por PNAP.
Se trataron células MCF-7 (A) con PNAP-1, -3h, y -6h a tres concentraciones (5, 10, y 25 mM) durante 48 h, y la expresión de la caspasa-7 troceados, -8, -9 y PARP se determinó por Western Blot. (C) MCF-7 células fueron tratadas con 25 mM PNAP-1, -3h, y -6h a tres concentraciones (5, 10, y 25 mM) durante 48 h, y la Bcl-2, Bcl-XL, Bax, los niveles de Bax /Bcl-2, BID, y Fas fueron detectados por Western blot. (B, D) La expresión se cuantificó usando un sistema de análisis de imagen Analizador de Gel-Pro computarizado. Los datos se expresan como la media ± SEM de tres ensayos independientes. * P & lt; 0,05 y ** P & lt; 0,01 son significativamente diferentes del control
MCF-7 células se incubaron en presencia o ausencia de (A) la caspasa-8-inhibidor z IETD-. FMK o (B) la caspasa-9 inhibidor Z-LEHD-FMK durante 1,5 h antes de la adición de PNAP-6h. Western blot análisis se realizaron con anticuerpos frente a caspasa-7, -8, -9 y, y la actina. (C) células MCF-7 fueron tratados con PNAP-6h en presencia o ausencia de caspasa-8 inhibidor, o caspasa-9 inhibidor, y luego la morfología se observó por microscopía de luz.
The la activación de la caspasa-8 es la primera etapa en la cascada de eventos apoptóticos inducidos por Fas estimulación [33], y la activación de la caspasa-9 está regulado por Bcl-2 miembros de la familia [34-36]. Sin embargo, el tratamiento de las células MCF-7 con 25 mM derivados PNAP ejerce un efecto modesto sobre la expresión de Bcl-XL, proteínas Bax, y hacer ofertas en tres puntos de tiempo (12, 24, y 48 h) (Figura 4C y 4D) .