Extracto
Antecedentes
biomarcadores urinarios tienen el potencial de mejorar la detección precoz del cáncer de vejiga. La mayor parte de los distintos marcadores conocidos, sin embargo, sólo se han evaluado en estudios con diseño transversal. Para una correcta validación de un diseño longitudinal sería preferible. Se utilizó el UroScreen estudio prospectivo para evaluar la survivina, un biomarcador potencial que tiene múltiples funciones en la carcinogénesis.
Métodos /Resultados
survivina se analizó en 5.716 muestras de orina de 1.540 trabajadores de la química previamente expuestos a aromático aminas. Los trabajadores participaron en un programa de vigilancia con exámenes anuales entre 2003 y 2010. Se extrajo ARN de las células urinarias y survivina se determinó mediante PCR en tiempo real. Durante el estudio, se detectaron 19 tumores de vejiga. Multivariante ecuaciones de estimación generalizadas (GEE) modelos mostró que β-actina, lo que representa el rendimiento y la calidad del ARN, tuvo la mayor influencia en la positividad survivina. La inflamación, la hematuria y el tabaquismo no confundir los resultados. Survivina tuvo una sensibilidad del 21,1% para todos y 36,4% para los tumores de alto grado. La especificidad fue del 97,5%, el valor predictivo positivo (VPP) del 9,5%, y el valor predictivo negativo (VPN) del 99,0%.
Conclusiones
En este estudio prospectivo y hasta ahora el mayor estudio sobre la survivina, el marcador mostraba un buen VAN y especificidad pero una baja PPV y sensibilidad. Esto fue en parte debido al bajo número de casos, lo que limita la validez de los resultados. Cumplimiento, la calidad de orina, problemas con el ensayo, y la estabilidad del mRNA influyeron en el rendimiento de la survivina. Sin embargo, la mayoría de los problemas podrían resolverse con un ensayo más fiable en el futuro. Un hallazgo importante es que la survivina no fue influenciado por factores de confusión como la inflamación y exhibió un número relativamente bajo de falsos positivos. Por lo tanto, a pesar de la baja sensibilidad, la survivina puede seguir siendo considerada como un componente de un panel de marcadores múltiples
Visto:. Johnen G, K Gawrych, Bontrup H, Pesch B, D Taeger, Banek S, et al. (2012) Rendimiento de survivina mARN como un biomarcador para el cáncer de vejiga en el Estudio Prospectivo UroScreen. PLoS ONE 7 (4): e35363. doi: 10.1371 /journal.pone.0035363
Editor: Olga Y. Gorlova, la Universidad de Texas Centro de Cáncer MD Anderson, Estados Unidos de América
Recibido: 4 Enero, 2012; Aceptado: 14 de marzo de 2012; Publicado: 16 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Johnen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Fujirebio Diagnostics , Inc. (IED; Malvern, PA; http://www.fdi.com) ha proporcionado reactivos survivina sin ningún coste. Parte del estudio fue apoyado por una beca (FB093 a AS) del Seguro Social Alemán de Accidentes (DGUV; Sankt Augustin, Alemania; http://www.dguv.de), por Abbott Laboratories (Abbott Park, IL; http: //www.abbottmolecular.com) que suministra kits UroVysion, y Matritech /Alere GmbH (Colonia, Alemania; http://www.alere.com) que suministra kits ELISA NMP22. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: El autor es GL un empleado de Currenta GmbH & amp; Co. OHG. Fe y Mn son empleados de BASF SE. Como kits de ensayo libre recibidas de Abbott Laboratories y Matritech /Alere GmbH. AS también recibieron becas de viaje de Matritech /Alere. GJ recibió reactivos de ensayo libres de Fujirebio Diagnostics, Inc. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales. Los autores declaran no tener otros intereses en competencia.
Introducción
El cáncer de vejiga es uno de los principales tipos de cáncer en los EE.UU. y en Europa. En Alemania, la incidencia es de alrededor de 29.000 casos por año [1]. Debido a la alta tasa de recurrencia del tumor, son necesarias una estrecha vigilancia y el uso repetido de las terapias. Como consecuencia, el cáncer de vejiga es la enfermedad de cáncer más costoso [2]. Los tumores de la vejiga urinaria puede ser causada por la exposición ocupacional a aminas aromáticas, pero el consumo de tabaco se considera que es el contribuyente más fuerte para el desarrollo de estos tumores malignos [3].
La disponibilidad de tratamientos eficaces, el acceso a la órgano diana a través de la orina, y la relativamente buena supervivencia global hace que el cáncer de vejiga candidato para los programas de cribado en poblaciones de alto riesgo [4]. Desafortunadamente, la cistoscopia, que es el estándar de oro actual para la detección de cáncer de vejiga, es un método invasivo y bastante dolorosa. En algunos países los altos costos también pueden desempeñar un papel importante [4]. Estos hechos se oponen a la cistoscopia de ser utilizados en el cribado de cohortes. En contraste, los marcadores tumorales en orina son herramientas no invasivos para detectar el cáncer de vejiga. marcadores típicos son proteínas, ARN, ADN, metabolitos, o características celulares, que tienen la ventaja de que pueden ser determinados en muestras de orina [5], [6]. De los numerosos marcadores conocidos, sin embargo, sólo unos pocos han sido probados en estudios prospectivos o ensayos tuvieron éxito y debe ser aprobado por la FDA. En consecuencia, son necesarios para demostrar el valor de estos marcadores para la detección del cáncer y los estudios longitudinales más toma de decisiones clínicas [7].
La survivina es una proteína relativamente pequeña de 16,4 kDa codificada por el gen
BIRC5
[8], [9]. Su estructura tridimensional se resolvió y sugirió un adaptador o soporte para la función [10], [11]. La unión a un número de otras macromoléculas de hecho, ha sido demostrada y survivin surgido como un nodo central en múltiples redes celulares [9], [12] - [14]. Mientras survivin pertenece al inhibidor de la familia de genes apoptosis (IAP) sus funciones no se limitan a un papel regulador en la apoptosis. Otras funciones son el control de la división celular y la segregación de cromosomas, la promoción de la proliferación, la respuesta al estrés y la angiogénesis, y desempeña un papel en la metástasis [9], [15] - [19]. La desregulación de la survivina sería, por tanto, afectar a cuatro de los seis llamados «características del cáncer 'en el modelo de la tumorigénesis descrito por Hanahan y Weinberg, lo que sugiere una función central de survivina en la carcinogénesis y la progresión tumoral [20].
los múltiples roles mecanicistas de survivina se reflejan también en su presencia generalizada en todas las etapas del desarrollo del tumor, aunque con preferencia a las etapas posteriores en varios tipos de cáncer [21] - [25]. La survivina se sobreexpresa en la mayoría de los cánceres humanos, pero rara vez detectable en los tejidos adultos sanos [8], [26]. Tiene, por tanto, ha propuesto como un marcador potencial del tumor y objetivo para la terapia [8], [27]. Debido al hecho de que la detección no invasiva en muestras de orina es posible, survivina podría ser utilizado específicamente para la detección de tumores malignos urogenitales. Varios estudios, sobre todo de diseño transversal y con un número relativamente limitado de casos, han demostrado que la survivina es un candidato prometedor para una validación adicional en estudios longitudinales [28] - [34]. Shariat
et al.
Realizó un estudio prospectivo más amplio sobre el cáncer de vejiga recurrente que se basa en la tinción inmunohistoquímica de muestras tumorales. En esto, la survivina mejoró la predicción de la recurrencia y la supervivencia en un subgrupo de pacientes [21]
En el presente estudio, se determinó la survivina en la cohorte prospectivo de cribado UroScreen [35] -. [37] utilizando un mRNA- ensayo basado en el fin de validar su función como marcador tumoral para la detección precoz del cáncer de vejiga.
resultados
los participantes de la cohorte UroScreen eran trabajadores químicos activos o retirados con el ex exposición a aminas aromáticas como se describe anteriormente [35] - [37]. Fueron examinados entre septiembre de 2003 y junio de 2010. Se recogieron muestras de orina para el estado de la orina, citología, la determinación de NMP22®, aberraciones cromosómicas (UroVysion ™), y - si el material se disponía de suficiente - para survivin [36], [37] . Para las mediciones de survivina 5.716 muestras de orina se pueden obtener a partir de 1.540 participantes (Tablas 1 y 2). La mediana de edad de la cohorte fue de 62 años (rango 27-90 años). De las 1.540 personas, 18 desarrollaron tumores, incluyendo una persona que desarrolló dos tumores durante el estudio que resulta en 19 tumores en total para la investigación de survivina. Por otros dos casos no se muestra de orina adecuada estaba disponible para la determinación de survivina. De los 19 tumores, tres fueron papilomas, de alto grado once y cinco tumores de bajo grado (Tabla 3). La citología detecta ocho tumores. El ensayo de survivina detectado cuatro tumores, todos los cuales eran de alto grado. Tres de ellos también fueron detectados por citología y otros marcadores; uno fue detectado por la survivina y NMP22 solamente (Figura 1)
.
Se detectaron un total de 19 tumores en 18 casos. Survivina, citología, NMP22, y UroVysion detectó 13 de los tumores. * Para dos tumores adicionales (número 1 y 12) ninguna de las muestras estaba disponible para la determinación de survivina.
La survivina marcador tumoral se determinó mediante un ensayo basado en ARNm que no estaba disponible comercialmente. Durante los siete años de este estudio longitudinal, acontecimientos imprevistos con respecto a la fiabilidad y la disponibilidad de los componentes del ensayo (kits de aislamiento de ARN de Qiagen y Invitek, reactivos survivina de la IED y el IPA) nos llevó a modificar el diseño de ensayo dos veces, dando lugar a tres variantes de ensayo diferentes (Qiagen /IED, Invitek /IED, Invitek /IPA). Se estandarizó el número de copias y survivina podría demostrar mediante el uso de un modelo multivariado generalizada de ecuaciones de estimación generalizadas (GEE) que las variantes de ensayo no confundir los resultados de la prueba en la aplicación de los números de copias survivina estandarizados (Tabla 4). Todos los demás resultados fueron, por lo tanto, derivan de los valores estandarizados.
Los posibles predictores de un resultado positivo survivina fueron exploradas como se muestra en la Tabla 4. Los indicadores de infección e inflamación (leucocitos), hematuria o factores como la edad, el tabaquismo, el cáncer de vejiga o anterior no mostró un efecto significativo sobre los niveles de survivina. La "concentración" (densidad específica) de la muestra de orina, que se refleja en la concentración de creatinina en orina, tendía hacia una correlación inversa con la survivina, pero esta influencia no fue significativa. Como era de esperar, el cáncer de vejiga observada durante UroScreen fue un predictor de pruebas positivas survivina (OR 2,54; IC del 95%: 1,02 a 6,33). β-actina (OR 3,11, CI 2,51 a 3,85 95%) era un modificador del efecto, lo que indica una fuerte influencia de la cantidad y la calidad del ARNm recuperado en el rendimiento de la PCR. Un aumento de diez veces en los números de copias de β-actina se asoció con una tres veces mayor probabilidad de una prueba positiva survivin. Hemos probado si β-actina se correlaciona con la densidad de la orina mediante el cálculo de coeficiente de correlación de Spearman. Se observó una asociación significativa pero sólo débil del número de copias de beta-actina con creatinina urinaria como una aproximación de la densidad de la orina (r
s CI 0,17, 95% 0,12 a 0,23).
Los valores cáncer predictivo de survivina se enumeran en la Tabla 5. los cálculos se basan en los resultados de las pruebas obtenidos en muestras de orina de la última ronda de cribado antes del diagnóstico. Survivina alcanzó una sensibilidad del 21,1% para todas las entidades tumorales, 25,0% de todos los tumores, pero sin papilomas, y 36,4% para los tumores de alto grado solamente. No detectó ninguno de los cinco tumores de bajo grado. La especificidad fue del 97,5% en todos los grupos (sub) (todos los tumores, los tumores sin papilomas, de alto grado, y los tumores de bajo grado). El valor predictivo positivo (VPP) alcanzó el 9,5% en todos los grupos, mientras que el valor predictivo negativo (VPN) osciló entre el 99,0 y el 99,7%.
características operativas del receptor (ROC) se realizaron análisis con survivina estandarizada los niveles de la última ronda de cribado antes del diagnóstico y ajustado para acceder
10 (β-actina) y la edad en las clases de 10 años. Ellos resultaron en área bajo la curva (AUC) valores de 0,74 (95% CI 0,61-0,86) para todas las entidades tumorales (Figura 2), 0,75 (IC del 95% 0,60-0,89) para todos los tumores sin papilomas, CI 0,80 (95% 0,66 -0.94) para los tumores de alto grado, y 0,66 (IC del 95%: 0,36 a 0,96) para los tumores de bajo grado solamente. Para juzgar el desempeño de las variantes de ensayo, se calcularon las curvas ROC ajustados para cada variante. Las AUC resultantes fueron 0,70 (IC del 95%: 0,34 a 1,00) para Qiagen /IED, 0,80 (IC del 95%: 0,54 a 1,00) para Invitek /IED, y 0,79 (IC del 95%: 0,67 hasta 0,91) para la variante de ensayo Invitek /IPA.
El análisis se realizó para todas las entidades tumores. Un área bajo la curva (AUC) fue de 0,74 con un IC del 95% (intervalo de confianza) de 0,61-0,86.
Las posibles razones de los resultados negativos de la prueba en los casos se compilan en la Tabla 6. Las últimas muestras de los casos 5 y 10 se obtuvieron 26 y 18 meses antes del diagnóstico del tumor, respectivamente. Caso 8 mostró un resultado positivo de la prueba de 14 meses antes del diagnóstico, pero la muestra justo antes del diagnóstico fue negativo. El resto de resultados falsos negativos fueron en los casos de papilomas y tumores de bajo grado; 31% se asociaron con una baja densidad de la orina recogida indicada por una baja de creatinina (& lt; 0,50 g /l), y otro 20% era asimismo asocia con una baja integridad del ARN según lo indicado por los niveles & lt beta-actina; 2.500 ejemplares. En comparación, el 15% y el 11% de todas las muestras verdaderas negativas en la última ronda de cribado se asociaron con una baja de creatinina y baja β-actina, respectivamente.
Discusión
Mientras que numerosas posibles marcadores se han descrito para la detección precoz del cáncer de vejiga, ninguno hasta el momento se han aplicado en las guías clínicas para la detección o seguimiento clínico en la recurrencia. Idealmente, los ensayos de marcadores adecuados para la práctica clínica deben ser robustos y baratos, así como rápido y en un formato fácil de usar, por ejemplo, una prueba de punto de atención [38]. Sin embargo, antes de que el formato de ensayo puede ser optimizado, el rendimiento del propio marcador tiene que ser evaluado. Para los marcadores moleculares como survivin el desarrollo de ensayos estables y simple puede ser prometedor si su rendimiento con los ensayos disponibles en la actualidad en el cribado del cáncer de vejiga se ha demostrado que es comparable con o mejor que las pruebas aprobados. En UroScreen, se determinó la survivina con un ensayo relativamente complejo, en el que los resultados positivos no fueron seguidos con la cistoscopia. En general, se detectó survivin, en particular en el cáncer de vejiga de alto grado y su rendimiento era comparable a los otros marcadores de la prueba. Sin embargo, la integridad del ARNm fue un importante modificador de los resultados positivos de la prueba, y por lo tanto una prueba más sólida debe ser desarrollado.
Para probar el valor de nuevos marcadores para la toma de decisiones clínicas, su rendimiento debe evaluarse en longitudinal estudios y ensayos clínicos [7]. UroScreen fue un estudio prospectivo de cohortes con más de 1.500 trabajadores químicos destinados a evaluar NMP22, UroVysion, y survivina como marcadores tumorales [36], [37]. Fue el primer estudio prospectivo que investigó el rendimiento de survivina en la detección precoz del cáncer de vejiga. Para 19 de los tumores de vejiga que fueron detectados durante la realización del material de muestra suficiente estudio fue dejado para la determinación de survivina. La baja incidencia de cáncer de vejiga en UroScreen, así como en la población general es un tema crítico para la detección del cáncer de vejiga [4]. UroScreen se estableció como una extensión de un programa de vigilancia ya establecidos en los trabajadores químicos [35]. Los cálculos de potencia iniciales se basaron en los datos anteriores que muestran en ese momento una incidencia de tumores más alta en la población de estudio [39]. Actualmente, la incidencia en esta cohorte de alto riesgo original ha llegado a un nivel más cercano al de la población general, debido a la prohibición de aminas aromáticas cancerígenas de uso en hace décadas de la industria química. Es más probable que los avances tecnológicos y las medidas para mejorar la seguridad en el trabajo han contribuido a la reducción de la incidencia de cáncer de vejiga en esta cohorte de trabajadores a partir de dos grandes empresas químicas. Además, la edad media de la cohorte UroScreen en 2010 fue de 62 años, mientras que la edad media para el cáncer de vejiga para los hombres en Alemania fue de 72 años [1].
Se ha demostrado que antes de la expresión de survivina es mayor y más frecuente en los tumores de alto grado o etapas posteriores del desarrollo del cáncer [21], [23] - [25]. De acuerdo con esta observación, la survivina no detectó casos de papiloma o cáncer de vejiga de bajo grado en UroScreen, mientras que la sensibilidad era mejor para los tumores de alto grado. Si esto se pudo confirmar, survivina podría ser un complemento útil para el seguimiento de los pacientes con tumores de crecimiento más rápidas que la detección debe ser tan pronto como sea posible. Aquí, un panel marcador no invasivo podría ser un enfoque prometedor para detectar la recurrencia antes y reducir el número de cistoscopias [40]. Sin embargo, los marcadores moleculares individuales se carece actualmente sensibilidad suficiente para sustituir a la cistoscopia [38].
El bajo número de casos incidentes limitó el poder del estudio para evaluar el desempeño de los marcadores tumorales y contribuyó a sus bajos VPP. estudios publicados anteriormente mostraron especificidades entre 88% y 100% y sensibilidades entre 53% y 100% [28] - [30], [32] - [34]. Aunque nuestros resultados mostraron una especificidad similar (98%) la sensibilidad (21%) fue notablemente más baja en este estudio de cohorte. En parte, esto puede ser debido a los diferentes ensayos aplicados. La principal razón de las diferencias más probable es, sin embargo, el diseño del estudio de la sección transversal de los otros estudios [41]. Las principales deficiencias son la falta de consideración de la dimensión de tiempo a fin de calcular los valores predictivos y un potencial sesgo de selección debido a los casos y controles han sido reclutados de diferentes poblaciones. El diseño longitudinal y por lo tanto el estudio prospectivo de UroScreen evita este sesgo. También representa una configuración que se acerca más a la práctica clínica.
Hemos observado varias razones que podrían ser responsables por el hecho de que los casos no se detectaron en nuestro estudio de cohortes. La falta de cumplimiento en un estudio de detección voluntaria es un problema típico que influye en la detección precoz de los casos. Para la mayoría de los participantes del estudio, las muestras no estaban disponibles para cada año consecutivo. En varios casos, la diferencia entre la adquisición de muestras y el diagnóstico del tumor fue de más de doce meses, en un caso incluso 26 meses. Se puede esperar que un aumento de los niveles de marcadores es menos probable con un intervalo de tiempo cada vez mayor entre la recolección y el diagnóstico de la muestra. Otro problema fue que los participantes con frecuencia anulados orina poco antes de llegar a una cita, por lo que la orina recogida en el lugar fue insuficiente en calidad y /o cantidad de algunas de las pruebas de marcadores. Este tipo de orina se asocia típicamente con una baja de creatinina, un bajo número de células sedimentadas, y baja β-actina.
En cuanto a los factores de confusión, survivina fue menos influenciado de NMP22 y UroVysion por el estado de la orina [36], [37]. De acuerdo con el modelo de GEE, creatinina y leucocitos no influyó en los resultados de las pruebas de survivina. Como infecciones de la vejiga se observan con frecuencia en los ancianos, es importante que los procesos inflamatorios no influyen en una prueba de tumor. Esto es una ventaja el ensayo survivin tiene, en particular, sobre NMP22, que se sabe que es con frecuencia falso positivo cuando los participantes sufren de infecciones. Se refleja en el menor número de resultados falsos positivos del ensayo de survivina en comparación con el ensayo NMP22 [37]. A pesar de la limitada sensibilidad relativamente alta especificidad podría permitir survivina que se añade a un panel de marcadores. Es importante tener en cuenta que las pruebas de survivina positivo no dieron como resultado una recomendación para cistoscopia. Como resultado, hay una posibilidad de que algunos tumores pueden no haber sido detectados y que subestimado el rendimiento de survivina. Esto dificulta la comparación con la realización de las pruebas aprobadas por la FDA, es decir, NMP22 y UroVysion. El ensayo de survivina fue positivo para un caso (4b) que no fue detectada por citología o UroVysion. Survivina también fue positiva para el caso del número 8, que no fue detectada por los ensayos basados en células 14 meses antes del diagnóstico. Ambos casos se someten además positivamente por NMP22. Sin embargo, serían necesarios más casos para probar el punto de que los marcadores basados en la expresión de survivina como podrían complementar la base de células ensayos UroVysion y citología.
Un problema específico con la cuantificación de survivina fue la dificultad de mantener la calidad de un ensayo experimental todavía durante un período de varios años. Esto puede ser un problema específico de diseño de estudios prospectivos de cohorte en comparación con los estudios transversales. Los problemas debidos a cambios en el kit de aislamiento de ARN original, y la interrupción de la producción de reactivos de ensayo por el proveedor original resultaron en tres variantes de ensayo que dieron lugar a diferentes valores de corte para positividad survivina. Las discontinuidades impidieron la determinación de un límite global optimizado para el conjunto completo de datos. Hemos normalizado el número de copias e implementado el ensayo en el modelo GEE como factor de confusión potencial con el fin de probar si la confusión residual se podría encontrar con los datos estandarizados de survivina. El ensayo no influyó en los resultados de la prueba, pero β-actina resultó ser un modificador significativa de los resultados de la prueba. Parece posible que la especificidad de la survivina se redujo si más de las muestras de orina había sido más alto concentrado. Sin embargo, la concentración de β-actina no era simplemente una función de la densidad de la orina debido a que la correlación con la creatinina era débil, lo que indica que otros factores como la integridad del ARNm pueden haber contribuido a la realización de β-actina en las reacciones de PCR.
además de estos factores metodológicos imprevistos que influyeron en el ensayo, el formato de ARNm ampliamente utilizado para detectar la survivina también contribuyó al rendimiento general del ensayo. La integridad del ARN evaluado por copias de β-actina se evaluó como la mayor influencia en los resultados de las pruebas. La razón de ser de la utilización de un ensayo basado en ARNm de survivina iba a ser capaz de detectar señales débiles incluso de survivina que están presentes en el pequeño número de células uroteliales exfoliadas. PCR y RT-PCR son métodos elegantes y bien establecidos para amplificar y cuantificar cantidades muy pequeñas de ácidos nucleicos. No obstante, la baja estabilidad de mRNA en general, incluso con la adición de inhibidores de RNasa, limita la aplicabilidad de tales ensayos para las muestras obtenidas fuera de las condiciones controladas de un entorno de laboratorio. Hay mejores inhibidores de RNasa disponibles hoy en día, que incluso puede prescindir de la necesidad de la muestra de congelación [42]. Pero la adición de estos conservantes a la muestra tiene que ser inmediata. Una posible manera de evitar retrasos sería un tubo de recogida especial, similar a los utilizados para la recogida de sangre, que ya contiene el conservante. Otro problema inherente al ensayo de survivina que utilizamos fue la no linealidad causada por las dos etapas de amplificación basados en la PCR que limitaban la precisión de cuantificación y las estrategias para la normalización. Incluso la aplicación de β-actina, que sirvió como un control interno, para la corrección no siempre fue suficiente para compensar las grandes variaciones en el contenido de ARNm en las muestras, probablemente debido a la etapa de preamplificación adicional del ensayo survivin. Por esa razón, para la práctica clínica en condiciones de la vida real, las moléculas más estables, como las proteínas podrían ser mejores objetivos. Mientras que una amplificación por PCR-como de las proteínas no es posible, ensayos basados en ELISA pueden lograr muy buenos sensibilidades y ahora están disponibles para la survivina en mejor calidad que en el inicio del estudio UroScreen.
Hasta la fecha, es UroScreen el mayor estudio prospectivo para evaluar survivin para la detección precoz de cáncer de vejiga en una cohorte de participantes asintomáticos. A pesar del bajo número de casos incidentes, información valiosa se ha ganado en el rendimiento del ensayo basado en el ARNm de survivina, desafíos técnicos, la influencia de los factores de confusión, y los valores predictivos del cáncer. Un ensayo más robusto sería de gran beneficio el marcador y su uso en la práctica clínica. Survivina puede tener el potencial de mejorar la detección, en especial de los tumores de alto grado; su sensibilidad, sin embargo, se basa en solamente cuatro tumores (de 19) que se detectaron con tres variantes de ensayo diferentes. La alta especificidad implica que la survivina podría ser considerado para servir como parte de un panel de marcadores múltiples para complementar otros marcadores, pero una mayor validación en un estudio prospectivo con más casos se justifica. Prueba de survivina en una cohorte de pacientes con un alto riesgo de tumores recurrentes sería un enfoque prometedor.
Materiales y Métodos
Población de estudio y diagnóstico de tumores
Los participantes fueron reclutados del (für nachgehende Untersuchungen Organisationsdienst) cohorte de ODIN en el marco de un programa de vigilancia del seguro obligatorio de accidentes de la industria química que ofrece exámenes anuales de los trabajadores activos y jubilados que han estado expuestos a aminas aromáticas. Desde septiembre 2003-junio 2010 1.609 trabajadores varones en dos sitios grandes químicos en Alemania (subcohort A: BASF, Ludwigshafen; subcohort B: Bayer, Leverkusen) participaron en el estudio UroScreen. 1.540 de los previstos suficiente material de muestra para mediciones de survivina. Se aplicó un cuestionario para documentar el hábito de fumar y las enfermedades pertinentes. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Tubinga (Nº 1 /2003V).
Como las otras pruebas tumorales (citología, NMP22®, UroVysion ™) aplicado en UroScreen fueron aprobados en contraste con la survivina , tenía menor prioridad cuando el material de la muestra fue limitada. Por tanto, sólo 5,716 de las muestras de orina 7091 estaban disponibles para las mediciones de survivina. Características de la cohorte se resumen en las Tablas 1-2 y se describen en más detalle en otra parte (Pesch et al., Presentado y [37]). Los resultados positivos de la prueba de citología, NMP22®, o UroVysion ™ dieron como resultado una recomendación para una cistoscopia, mientras que los resultados positivos para el ensayo no aprobado survivina no lo hicieron.
A partir de noviembre de 2011, 21 tumores en 20 personas fueron detectados por cistoscopia y confirmado por la patología de referencia. Para 18 de los casos (19 tumores) muestras de orina estaban disponibles para la determinación de survivina. Uno de los casos tuvo dos tumores (4a y 4b en la Tabla 3). Los hallazgos histopatológicos de los 21 tumores y los parámetros de las muestras de orina correspondientes (última ronda de cribado antes del diagnóstico de un tumor) se representan en la Tabla 3 y en [37].
Recolección de orina
Las muestras de orina se recogieron en el sitio en las plantas químicas en Ludwigshafen y Leverkusen. Para la determinación de la survivina, muestras de 40-50 ml de orina anulados de forma espontánea se centrifugaron en un rotor de cubo oscilante a 500 × g durante 10 minutos a 10 ° C. El sobrenadante se retiró cuidadosamente y sedimentos de células se mezclaron con 500 l Solución de Lisis R (Invitek, Berlín, Alemania), que contiene inhibidores de RNasa. Finalmente, la muestra de células se congeló a -20 ° C y se envía al laboratorio en Bochum donde se almacenaron hasta el aislamiento de ARN. Manipulación de muestras para la determinación de la condición de la orina y otros marcadores se describe a continuación.
Estado de la orina y la evaluación de la hematuria
En todas las muestras se determinó el estado de la orina en la orina fresca (antes de la centrifugación) como se describe anteriormente [36]. creatinina en orina se determinó con el CREA plus® prueba (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Los eritrocitos, hemoglobina (Hb), los leucocitos, la albúmina y otros parámetros se determinaron con Combur 10 tiras Test ® (Roche). Además, los eritrocitos y los leucocitos se determinó también semi-cuantitativamente en el sedimento de orina. Los valores de creatinina estaban disponibles para subcohort Un solo (4806 muestras). Para 4546 muestras de éstos, información completa sobre todos los parámetros (eritrocitos, leucocitos, etc.) estaba disponible.
NMP22®, UroVysion ™, y la citología
proteína de la matriz nuclear 22 (NMP22) se determinó cuantitativamente con el kit de ELISA NMP22® (Matritech /Alere GmbH, Köln, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El punto de corte para los resultados positivos se fijó a 10 unidades /ml. la inestabilidad cromosómica en células uroteliales sedimentadas se evaluó utilizando el Kit ™ cáncer de vejiga UroVysion (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). La prueba se considera positiva si al menos cuatro núcleos tenían tres señales de dos o tres cromosomas (3, 7 y 17) o al menos 12 núcleos mostraron una señal para el locus 9p21. La citología urinaria se realizó tal como se describe anteriormente [36], [43].
ensayos
aislamiento de ARN y survivina
La cuantificación de survivina se basa en PCR en tiempo real con el ARNm aislado de células uroteliales exfoliadas en orina. Para la determinación de la survivina se emplearon tres variantes del ensayo basado en mRNA. Las variaciones fueron una consecuencia de los cambios por parte de los fabricantes del kit de aislamiento de ARN y los reactivos de RT-PCR, respectivamente. Inicialmente, el protocolo y reactivos para el ensayo de survivina fueron proporcionados por Fujirebio Diagnostics, Inc. (IED, Malvern, PA). El protocolo de IED recomienda el Mini Kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) para el aislamiento de ARN. Este kit, sin embargo, no está optimizado para la muy pequeña cantidad de ARN que por lo general se recuperan del bajo número de células obtenidas de 40-50 ml de orina, lo que lleva a la mayoría de los bajos rendimientos. Un ligero cambio en uno de los componentes del kit en 2005 condujo a una caída adicional en el rendimiento de ARN. Por esa razón, se ha sustituido por un kit de aislamiento alternativo (InviTrap® la vuelta de la célula RNA Mini Kit) que produjo rendimientos mejores y más consistentes.
En 2007, la IED suspendió la producción de reactivos para la PCR en tiempo real ensayo. Esto le solicite otro cambio en el procedimiento de ensayo en el año 2008. Debido a que no hay otra fuente estaba disponible, tuvimos que diseñar y producir algunos de los componentes del ensayo a nosotros mismos (en lo sucesivo denominado "ensayo de IPA"). Pequeñas diferencias en los cebadores y sondas del ensayo de PCR en tiempo real llevado constantemente a mayor número de copias de survivina en comparación con el ensayo original de IED. Las tres variantes de ensayo son los siguientes:
Variante 1 (Qiagen kit de ensayo /IED)
Esta variante se utiliza desde septiembre de 2003 hasta octubre de 2005. El aislamiento de ARN se realizó con RNeasy Mini Kits (Qiagen ) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La transcripción inversa de ARNm, preamplificación, y cuantitativa en tiempo real de PCR se realizaron como se describe por Kenney et al., excepto que los volúmenes de reacción de cada paso se cortaron por la mitad para 25 l [33]. Cebadores, reactivos y controles positivos fueron proporcionados por la IED en ninguna carga. En contraste con el ensayo publicado, en lugar de un sistema de detección de secuencia ABI PRISM se utilizó un sistema LightCycler II (Roche). Para ser capaz de utilizar los capilares del sistema LightCycler era necesario añadir albúmina de suero bovino (BSA, AppliChem, Darmstadt, Alemania) a la reacción TaqMan, con una concentración final de 0,16 mg /l.