Extracto
Antecedentes
Los microARN (miRNA) son pequeños RNAs reguladores que están implicados en la patogénesis del cáncer y que han mostrado recientemente prometedores como marcadores biológicos basados en la sangre para la detección del cáncer. cáncer epitelial de ovario es una enfermedad mortal para los que mejoraron los resultados podrían lograrse mediante la detección temprana exitosa y una mayor comprensión de la patogénesis molecular que conduce a la mejora de las terapias. Un paso crítico hacia estos objetivos es establecer una visión global de miRNAs expresados en tejidos de cáncer de ovario epitelial, así como en las células epiteliales de la superficie del ovario normales.
Metodología
Se utilizó pirosecuenciación masiva en paralelo (es decir, "454 secuenciación") para descubrir y caracterizar nuevos y miRNAs conocidos expresa en cultivos primarios de epitelio normal humano de ovario superficie (manguera) y en el tejido de tres de los histotypes más comunes de cáncer de ovario. secuenciación profunda de pequeñas bibliotecas de ADNc ARN derivados de la manguera normal y muestras de cáncer de ovario se obtuvo un total de 738.710 de alta calidad secuencia lee, la generación de perfiles digitales completas de los genes miARN expresión. los perfiles de expresión de miRNAs anteriormente anotado 498 se delinearon y descubrieron seis nuevos miRNAs y 39 miRNAs candidatos. Un conjunto de 124 miRNAs se expresó diferencialmente en normales frente a muestras de cáncer y 38 miRNAs fueron expresados diferencialmente a través de los subtipos histológicos de cáncer de ovario. TaqMan QRT-PCR realizada en un subconjunto de miRNAs confirmada resultados del estudio basado en la secuenciación.
Conclusiones
Este informe se amplía el cuerpo de miRNAs sabe que se expresa en el cáncer de ovario epitelial y proporciona una recurso útil para futuros estudios de la función de los miRNAs en la patogénesis y la detección precoz del cáncer de ovario
Visto:. Wyman SK, Parkin RK, Mitchell PS, Fritz BR, O'Briant K, Godwin AK, et al . (2009) Repertorio de microRNAs en cáncer ovárico epitelial según lo determinado por Next Generation Sequencing de los pequeños ARN de cDNA bibliotecas. PLoS ONE 4 (4): e5311. doi: 10.1371 /journal.pone.0005311
Editor: Sudhansu Kumar Dey, Fundación para la Investigación de Niños de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Noviembre 2008; Aceptó 7 de febrero de 2009; Publicado: 23 Abril 2009
Derechos de Autor © 2009 Wyman et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El costo de secuenciación fue sufragado en parte por Roche. El estudio fue apoyado en parte por el cáncer de ovario SPORE en el Fox Chase, Centro de Cáncer (P50 CA083638), el Pacífico ovárico Consorcio de Investigación del Cáncer de Ovario de esporas (P50 CA83636 a NU y MT), Cromosoma Metabolismo Formación de subvención 5 T32 CA09657-16 (a SKW ), una beca de los Laboratorios de Investigación Merck (SKW) y por Fred Hutchinson Cancer Research Center y la Fundación Canaria de financiación (Nuevos fondos para el desarrollo de MT). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. M. Tewari es un miembro pagado del Consejo Asesor Científico de Combimatrix, Inc.
Introducción
cáncer de ovario
epitelial es la principal causa de muerte por cáncer ginecológico en los Estados Unidos [1], con diagnósticos de la fase tardía de tener una etiqueta & lt; 30% de tasa de supervivencia a cinco años [2]. Las tasas de supervivencia podría mejorarse por un mejor entendimiento de la patogénesis molecular, lo que puede conducir al desarrollo de terapias dirigidas superiores, así como por la detección temprana de la enfermedad en una etapa quirúrgicamente curable. Cuando se detecta en una etapa en la que la enfermedad se limita al ovario, por ejemplo, aumenta la tasa de supervivencia de cinco años a & gt; 80%. Clínicamente eficaces biomarcadores para la detección precoz del cáncer de ovario podría mejorar sustancialmente las tasas de supervivencia y el descubrimiento de biomarcadores de cáncer de ovario es un área importante de la investigación en curso [3].
Los microARN (miRNA) son una clase de pequeños ($ ~ $ 22 nt) no codificantes moléculas de ARN que actúan post-transcriptionally para regular la expresión de genes [4]. Los microARNs se originan a partir de precursores de ARN de horquilla que se procesan para generar tanto el funcional miARN maduro y una miRNA "forma de estrella" de longitud similar derivado de la cadena opuesta de la horquilla. modulación MicroARN mediada de los sistemas biológicos se ha encontrado para ser perturbado en múltiples enfermedades [5], incluyendo el cáncer [6] - [8]. Los patrones de expresión de miRNAs se correlacionan con el tejido de origen [8], [9], el pronóstico [10], [11] y con comportamientos clínicos del cáncer [12], lo que hace valiosos biomarcadores basado en los tejidos miRNAs. Por otra parte, nosotros y otros han demostrado recientemente que los miRNAs derivados del tumor entran en el torrente sanguíneo a niveles medibles, lo que indica que los miRNAs liberados por el tejido tumoral representan una poderosa nueva clase de biomarcadores basados en sangre, mínimamente invasivos para la detección del cáncer [13] - [16] . Como tal, hay un fuerte impulso para un análisis exhaustivo del repertorio miARN expresado en el cáncer de ovario epitelial.
Varios informes recientes han empezado a caracterizar la expresión de los genes miARN en el cáncer de ovario mediante microarrays manchada con sondas para un número variable de miRNAs conocidos [17] - [20]. Aunque estos son estudios pioneros, también tienen limitaciones. El más importante de ellos es que todas las matrices reportados hasta la fecha tienen una cobertura incompleta de miRNAs conocidos. De los 959 miRNAs y formas de estrellas presentes en miRBase (versión 12.0) [21], [22], la mayoría de las plataformas de microarrays de ensayo aplicado a la fecha sólo unos pocos cientos de miRNAs, con la más completa de las matrices ensayando 470 miRNAs y se forman las estrellas. Además, los microarrays se acerca única medida miRNAs previamente identificado y que no están equipados para descubrir y perfilar nuevos miRNAs. Esta es una distinción importante que hacer dado que varios informes sugieren que un número significativo de miRNAs, particularmente aquellos que puedan ser de tipo celular específico en la expresión, aún no se han descubierto [23], [24]. Por último, debido al pequeño tamaño de miRNAs y los desafíos de lograr condiciones de hibridación uniformes en toda una microarrays miARN, existe la posibilidad de hibridación cruzada de miRNAs que están muy relacionadas en secuencia, por lo que es a veces imposible distinguir definitivamente entre miRNAs difieren en uno o dos nucleótidos.
para superar las limitaciones asociadas con los estudios de microarrays, hemos utilizado la "próxima generación" la tecnología de secuenciación (pirosecuenciación específicamente masivamente paralelo utilizando la plataforma 454 Life Sciences) de pequeñas bibliotecas de ADNc de ARN para caracterizar más ampliamente miARN expresión en el cáncer epitelial de ovario, así como en cultivos primarios de células epiteliales de la superficie del ovario normales. Este enfoque, que se basa en 5 'y 3' enlazador universal de ligadura /RT-PCR y recuento de secuencia de lecturas obtenidas para miRNAs distintas, puede en la captura de la teoría de todos los miRNAs presentes en las muestras de ARN (incluyendo las de nueva secuencia) y permite precisa identificación de miRNAs, incluso cuando difieren en un solo nucleótido. Hemos generado un total de 738.710 secuencia lee de cuatro pequeñas bibliotecas de ADNc de ARN que representan el epitelio normal primario de ovario humano superficie (manguera) culturas y tres subtipos de cáncer de ovario epiteliales comunes (seroso, endometrioide y de células claras). A continuación se describen los resultados de este esfuerzo, incluyendo la identificación y elaboración de perfiles de ambos anotados anteriormente y novedosas miRNAs expresados en el cáncer de ovario.
Métodos
detalles adicionales sobre el cultivo celular, el aislamiento de ARN, ARN pequeños ADNc construcción de la biblioteca, masivamente paralelo secuenciación, descripción cálculo de tuberías y reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa con transcripción inversa miARN TaqMan (QRT-PCR) se proporcionan en detalle en Métodos S1 y en [23].
cultivo de células y clínica materiales
las células normales humanas primarias epiteliales de ovario superficie (manguera) se obtuvieron de los ovarios normales de mujeres posmenopáusicas usando una modificación de la técnica descrita previamente en [25]. En todos los casos, las muestras fueron tomadas del epitelio superficial del ovario de aspecto normal, lo cual fue confirmado siguiente revisión histopatológico. especímenes MANGUERA se obtuvieron bajo un protocolo que fue aprobado por el Consejo Comité de Revisión de Investigación y Revisión interna en el Centro de Cáncer Fox Chase de pacientes sometidos a cirugía clínicamente indicado (ya sea profiláctica reducción del riesgo salpingo-ooforectomía o histerectomía abdominal total con salpingo-ooforectomía bilateral) y que dieron su consentimiento informado por escrito para el tejido no es necesario para el diagnóstico que se utilizarán para la investigación. MANGUERA células primarias fueron cultivadas utilizando medios que se describen en [26] a 37 ° C en 5% de CO
2.
El cáncer de ovario muestras se congelaron correspondientes a la fase III /IV de cáncer de ovario epitelial (19 serosa, cuatro células claras y endometrioide 10) contenían & gt; 70% celularidad epitelial maligno a valoración patólogo de una sección de tejido teñida adyacente. especímenes de cáncer de ovario se obtuvieron del Pacífico de Investigación del Cáncer de Ovario Consorcio Repositorio. Las muestras se recogieron bajo un protocolo aprobado por la Junta de Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson de Revisión Institucional y se obtuvieron de pacientes que habían escrito el consentimiento informado para el tejido innecesario a efectos de gestión clínica para ser utilizados para la investigación.
La extracción de RNA y la preparación de la biblioteca de genes miARN
normal culturas MANGUERA primario (paso 4-7) se lisaron en 600 l mirVana lisis /tampón de unión (Ambion, Inc., Austin, TX). las muestras de tumor (~ 100 mg cada una) se homogeneizaron en un Qiagen TissueLyser con 600 l de tampón de lisis mirVana /encuadernación. ARN total fue extraído de ambos tipos de muestras utilizando el kit de aislamiento de mirVana ™ miARN (Ambion) según el protocolo del fabricante. ARN de tumores se congelaron (19 de cuatro células claras y el 10 endometrioid tumores serosos, respectivamente) se agruparon según el subtipo histológico. MicroARN clonación se llevó a cabo como se describe anteriormente [27], (http://web.wi.mit.edu/bartel/pub/protocols/miRNACloningUpdate0705.pdf) con modificaciones en las etapas de amplificación para preparar las muestras para la secuenciación masiva en paralelo por 454 Ciencias de la vida.
Custom bioinformático de datos de análisis tuberías
Tratamiento y anotación de secuencias basadas en la identidad de los ARN transcritos conocidos o nuevos miRNAs se realizó a través de un gasoducto bioinformática personalizados se describe en detalle en Métodos S1 .
Medición de los niveles de miRNA en el ARN a partir de muestras clínicas usando ensayos TaqMan QRT-PCR
el ARN total se sometió a transcripción inversa y se preparó para QRT-PCR usando el kit TaqMan transcripción reversa miARN y miARN cebadores específicos de tallo-bucle (Applied Biosystems, Inc.) como se ha descrito anteriormente [23]. Los datos se analizaron con la versión del software SDS cuantificación relativa 2.2.2 (Applied Biosystems, Inc.), con el ajuste automático de Ct para la asignación de la línea de base y el umbral para la determinación Ct.
Resultados
Descripción general de los pequeños RNA cDNA bibliotecas y la secuencia 454
bibliotecas de ADNc de ARN pequeño se construyeron a partir pools de muestras de ARN aisladas de cultivos primarios de histológicamente MANGUERA primaria normal (
n
= 4) y especímenes de cáncer epitelial de ovario seroso de ( OSC,
n
= 19), de células claras (OCC,
n
= 4) y endometrioide (OEC,
n = 10)
histologías. Se seleccionaron muestras de tumor para contener al menos 70% de células epiteliales malignas. El ARN total se fraccionó tamaño a través de electroforesis en gel de poliacrilamida y pequeños RNAs correspondientes en peso molecular a la población miARN maduro (18-24 fracción nt) fueron gel extraído y procesado para la transcripción inversa y la amplificación por PCR para crear bibliotecas de ADNc (Figura 1A). Pirosecuenciación masivamente paralelo utilizando la plataforma de los 454 Life Sciences 'genera 80.501 MANGUERA normal, lee, lee OSC 273.739, 292.942 OCC lee y lee 91.528 OEC (Figura 1B). Estos correspondieron a 10.544 MANGUERA, 26849 OSC, 37,792 y 13,134 OCC OEC secuencias no redundantes. El mayor número de lecturas que corresponden a muestras de células serosas y claras se debió a una mayor profundidad de secuenciación (es decir, una porción más grande de la placa de secuenciación utilizado) en lugar de a las variaciones particulares durante la preparación de la biblioteca.
Un
. ARNs pequeños se aislaron a partir de cultivos normales MANGUERA primaria y desde serosa (OSC), de células claras (OCC) y endometrioide (OEC) tejidos de cáncer de ovario. Después de 5 'y 3' de ligación enlazador, RT-PCR se realizó para generar cuatro genotecas de ADNc independientes de los pequeños RNAs que se utilizaron entonces como plantillas para la pirosecuenciación masiva en paralelo (454 secuenciación).
B Opiniones. Descripción de los pasos en la tubería de análisis de datos. El paso inicial del análisis de los datos fue la eliminación de las secuencias correspondientes a 18 marcadores nt y ARN 24 nt que habían sido enriquecidas en el ARN total antes de la electroforesis en gel. Porcentaje del total de la manguera lee, OSC, OCC y OEC conjuntos de datos clasificado en las categorías designadas y filtradas a cabo en cada paso se enumeran en la tabla de la derecha. En la parte inferior de la tabla, el número de "secuencias únicas" representa las secuencias no redundantes derivados después de colapsar varias lecturas de secuencia idéntica. Algunas secuencias canónicas se asignan a más de un locus en el genoma. Al finalizar el análisis, por un total de 199 secuencias de 215 lee y mapeo de loci 568 cumplieron con los criterios para la horquilla secuencias derivadas canónicas de los conjuntos de datos combinados.
Los datos de la secuencia se procesa utilizando nuestro cálculo de tuberías de encargo (Figuras 1B, S1 y el cuadro S1). Los pasos iniciales de la secuencia identificada tubería ajusta a las bases de datos de los ARN anotado anteriormente (por ejemplo, los miRNAs conocidos, otros ARN no codificantes, ARN mensajero) y a elementos de secuencia altamente repetitivas. secuencias restantes fueron procesadas para identificar nuevos miRNAs (Figura S1; detalles del cálculo de tuberías se proporcionan en Métodos S1). En las siguientes secciones, se discuten en detalle las secuencias de juego de miRNAs conocidos y la identificación de nuevos miRNAs
perfiles de microARN:. MiRNAs anteriormente anotado
Partidos de miRNAs conocidos en miRBase (versión 12.0. ) [21], [22] representa el 68-73% de la lee, en función del conjunto de datos (Figura 1B y Tabla S1) y corresponden a un total de 498 miRNAs conocidas (incluidas las formas de estrellas). La frecuencia de la clonación de miRNAs individuales, expresado como una fracción del total lee obtiene a partir de una muestra dada, se puede utilizar para comparar la expresión relativa de miRNAs entre las muestras [28] - [30]. El resumen global de nuestros 454 conjuntos de datos de secuenciación se presenta en la Figura 2, que representa la expresión relativa de miRNAs entre la manguera primaria normal y conjuntos de datos de tejido de cáncer (
A
), así como entre los tres subtipos de ovario epiteliales (
B Opiniones). El miRNAs expresados diferencialmente más (es decir, ≥4 veces de cambio) se muestran como puntos rojos. Es notable, aunque no inesperada, que los perfiles de miARN subtipo histológico del cáncer de ovario eran más diferente de la manguera normal (
A
) de lo que eran entre sí (
B
). Tabulados 454 datos de secuenciación de los genes miARN abundancia en todos los conjuntos de datos, así como los nombres de los genes miARN y proporciones de abundancia para todas las comparaciones por pares entre los tipos de muestras, se proporcionan en su totalidad en la Tabla S2.
Los conjuntos de datos se comparan dos a dos, trazando el logaritmo de la fracción del total de lecturas para un determinado miARN en un determinado conjunto de datos en contra de su valor correspondiente en el segundo conjunto de datos. Para cada trama, sólo miRNAs que se secuenciaron en ambos conjuntos de datos se trazan; miRNAs que se secuenciaron sólo en uno de los dos conjuntos de datos no se muestran. La fila superior (
Un
), se compara con cáncer de ovario conjuntos de datos (OSC, OCC y OEC) a los cultivos normales MANGUERA primaria; la fila inferior (
B Opiniones), compara los subtipos histológicos de tumores de ovario entre sí. Los puntos rojos significan miRNAs que tenían un factor de cambio ≥4.
La superposición de miRNAs expresados diferencialmente entre los subtipos se visualiza en los diagramas de Venn de la figura 3, que también incorporan miRNAs excluidos de la figura 2 debido a cero lee en cualquiera MANGUERA normal o muestras de cáncer de ovario. A partir de la intersección de los tres grupos en los diagramas de Venn, es evidente que en muchos casos miRNAs expresados diferencialmente en el cáncer de ovario en relación a la manguera normales muestran el mismo patrón de expresión diferencial independientemente del subtipo histológico. Tabla S3 proporciona una lista completa de los nombres de los miRNAs individuales y ratio de expresión y
P
-valores para las comparaciones que se resumen en la Figura 3.
Venn figuras se representa el número de miRNAs expresados diferencialmente en histológico de cáncer de ovario subtipos relativos a las culturas normales primaria humana epitelio superficial del ovario (manguera). Criterios para un miARN como expresados diferencialmente fue definida por un factor de cambio ≥4 con la prueba exacta de Fisher
P-valor
& lt; 5,0 x 10
-6 de miRNAs que tenían una expresión detectable tanto en la manguera y de ovario muestras de cáncer, o por la prueba exacta de Fisher
P-valor
& lt; 5,0 x 10
-6 solo en los casos en que un valor de factor de cambio era indefinible debido a cero lee para un determinado miARN, ya sea en la manguera o de ovario muestra de comparación cáncer. Se identificaron un total de 74 miRNAs sobre-expresada (
Panel A) y 49
miRNAs insuficientemente expresadas (
Panel B
) en el cáncer de ovario con respecto a la manguera normal. Los microARN que se encontró que eran constantemente sobreexpresado o consistentemente bajo-expresados en los tres subtipos histológicos de cáncer de ovario se enumeran por su nombre.
miARN expresión en comparación directa entre los subtipos histológicos de cáncer de ovario mediante la derivación de los coeficientes de expresión para cada miARN basado en los valores de abundancia fraccionarios. La significación se evaluó mediante la prueba exacta de Fisher. Los diez mejores miRNAs expresados diferencialmente en cada una de las comparaciones por pares de los subtipos histológicos de cáncer de ovario se enumeran en la Tabla S4 (resultados de todos los miRNAs se proporcionan en su totalidad en la Tabla S2). Entre los miRNAs específicos de subtipo histológico más son miR-449a (serosa-específico), el miR-499-5p /miR-375 /miR196a /miR-196b /miR-182 (endometrioide-específico) y miR-486-5p /MIR -144 /miR-30a /miR-199a-5p (claro-celda específica).
Validación de 454 secuenciación de genes miARN resultados de la expresión de QRT-PCR.
Hemos utilizado comercialmente disponible miARN TaqMan QRT Los ensayos -PCR como una confirmación independiente de la expresión diferencial de los genes miARN identificado por la secuencia 454. Los ensayos TaqMan MicroARN QRT-PCR se realizaron para una muestra de 38 miRNAs conocidos que fueron seleccionados en base a exceso o defecto de expresión con respecto a la manguera de lo normal primaria, o en base a la expresión diferencial entre los diferentes subtipos de cáncer de ovario (estimado a partir de la secuencia 454 datos). ensayos TaqMan se realizaron en alícuotas de las mismas piscinas de ARN utilizados para la secuenciación. Treinta y seis de los 38 miRNAs expresados diferencialmente examinados por TaqMan QRT-PCR demostraron resultados consistentes con los obtenidos por secuenciación 454 (figuras 4 y 5, A, B, C). De los ocho miRNAs identificados por la secuencia 454 para ser sobreexpresado en el cáncer de ovario en relación con el grupo de la manguera normal (Figura 4A), los ocho demostraron un exceso de expresión en los subtipos de cáncer de células serosas y claras cuando se mide utilizando TaqMan QRT-PCR, mientras que seis de los ocho mostraron resultados consistentes en el subtipo de cáncer endometrioide (MIR-126 *, - 142-3p, 195, 200a, 200b, 200c, 338-3p, 378 *). Nueve miRNAs están insuficientemente expresado en el cáncer de ovario en relación a la manguera normal (Figura 4B), con todos los subtipos que muestran resultados consistentes cuando se mide por TaqMan QRT-PCR. Había seis miRNAs que eran indetectables (cero lecturas) en cultivos MANGUERA normales (Figura 4C), pero tenía una expresión detectable en la OEC, OSC y /o OCC en los datos de secuenciación 454, pero también ellos mostraron una mayor expresión en las muestras de subtipos histológicos de ovario en comparación con MANGUERA primaria normal cuando examinado por TaqMan QRT-PCR (Figura 4C).
Los gráficos muestran los resultados miARN Taqman QRT-PCR para una muestra de miRNAs identificados por la secuencia 454 que se sobre-expresado (
Panel a
) o bajo-expresada (
Panel B Opiniones) en el cáncer de ovario en relación a la manguera normal. Los valores relativos de expresión derivados de la secuencia 454 se muestran en el segmento izquierdo de cada gráfico para la comparación. Los valores relativos de expresión de miRNAs en endometrioide (OEC, barras negras), serosa (OSC, barras blancas) y de células claras (OCC, barras grises) se representan los cánceres. Los microARNs que no fueron detectados en la manguera normal mediante la secuencia 454, pero fueron detectados en el cáncer de ovario se presentan en
Panel C
, donde miRNAs están clasificadas por la expresión descendente (que corresponde al ciclo umbral ascendente, Ct) en la manguera normal. 454 datos de secuenciación se da en términos de porcentaje del total lee dentro de cada muestra. UD, imperceptible por miARN TaqMan QRT-PCR.
Los gráficos muestran los resultados Taqman QRT-PCR para miRNAs expresados diferencialmente entre los subtipos de cáncer de ovario, con 454 datos de secuenciación derivados presentan para la comparación en el segmento de la izquierda cada gráfica. Los valores relativos de expresión de miRNAs específicamente sobre-expresan en endometrioide (
Panel A
, OEC, barras negras), serosa (
Panel B Opiniones, OSC, barras blancas) y de células claras (
El panel C
, OCC, barras grises) se representan los cánceres. UD, imperceptible por miARN TaqMan QRT-PCR.
Quince miRNAs identificado por la secuencia 454 que se expresó diferencialmente en todos los subtipos de cáncer de ovario (Figura 5A, B, C) mostraron patrones de expresión similares cuando se cuantificó mediante QRT PCR. Ocho miRNAs se sobre-expresa específicamente en el cáncer de ovario endometrioide (Figura 5A), cuatro en el cáncer seroso (Figura 5B), y tres en el cáncer de células claras (Figura 5C) en relación con los otros subtipos.
Análisis de secuenciación los datos para identificar horquilla derivados novedosos pequeños RNAs.
Después de haber validado 454 resultados de la secuenciación correspondientes a la expresión diferencial de miRNAs anteriormente anotado, que después dio vuelta a la identificación de nuevas secuencias de genes miARN. Después de filtrar coincide con las características anteriormente anotado, incluyendo los ARN mensajeros, ARNt y otros ARN no codificantes conocidos, el resto de secuencias fueron alineadas con la secuencia de referencia del genoma humano (NCBI Build 36.1) [31]. Se requieren secuencias para que coincida con la secuencia del genoma humano perfectamente para ser llevado más lejos para análisis computacional adicional, con la única excepción a este ser secuencias que demostraron adición de 1-3 nucleótidos no moldeados en el extremo 3 '. En estos casos, recortamos bases no moldeados a partir de la secuencia original y allí fue levantado aún más para el análisis [32], [33].
Las etapas de procesamiento de los datos descritos hasta el momento produjo 841 MANGUERA normales, 2,840 OSC , 11.224 OCC, y 1.764 secuencias únicas OEC correspondientes a nuevos pequeños ARN. Estas secuencias únicas correspondían a 1766 MANGUERA normales, 5795 OSC, 19464 OCC y 3301 OEC loci genómico que potencialmente podrían generar estos pequeños RNAs (Figura 1B, Tabla S1). La tubería de análisis de datos siguiente proyectará estos loci genómico (además de 100 nucleótidos de arriba y corriente abajo flanqueando la secuencia) para la presencia de una estructura secundaria de horquilla predicho mediante el cálculo de la energía libre, la probabilidad de forma (tal como se determina por el programa RNAshapes [34 ]) y el Randfold-calcula [35]
P-valor
de estructuras secundarias predichas. Una descripción detallada de los criterios de plegado de horquilla se proporciona en métodos complementarios S1 y en [23]. Esto dio lugar a 224 MANGUERA normales, 511 OSC, 500 OCC, y 247 nuevos OEC ARNs pequeños que se encuentran para ser derivado posiblemente de una estructura de horquilla precursores.
Las secuencias que pasan los criterios de filtrado por encima de los cuatro conjuntos de datos se combinan y ordenados con respecto a las coordenadas cromosómicas en grupos que comparten extremos 5 '. De cada uno de estos grupos se optó por una secuencia de "canónica" que representa ese locus genómico. Las secuencias canónicas fueron elegidos en base a un terminal 5 ', la abundancia y la longitud de la secuencia común como se describe anteriormente [23] (Mayores detalles se proporcionan en Métodos S1). Este proceso de refinado aún más los datos en una lista combinada de 199 secuencias únicas (potencialmente derivado de 568 loci del genoma) que hemos designado como "horquilla derivados novedosos ARN pequeños" de la que hemos identificado nuevas y candidatos miRNAs.
Identificar novedosas y candidatos miRNAs.
con el fin de determinar qué secuencias de designar como nuevos miRNAs, hemos examinado el conjunto de horquilla nuevos derivados de ARN pequeños con criterios similares a los utilizados en otros estudios recientes de descubrimiento de genes miARN [23], [33], [36]:
i
. características de emparejamiento de la horquilla,
ii
. la presencia de varias lecturas que comparten el mismo extremo 5 ',
iii
. ausencia de anotación que indica no miARN la biogénesis,
iv
. compartida región de la semilla con un animal conocido miARN y
v
. presencia de forma de estrella miARN correspondiente registrado (s). Se consideró que incluye la secuencia de conservación filogenética como criterio; Sin embargo, esto no incrementa significativamente nuestro análisis, ya que ninguno de los nuevos miRNAs horquilla derivados fueron conservados más allá de los primates. Esto no es inesperado, dado que la mayor parte evolutivamente conservados microARN es probable que ya han sido descubiertos usando métodos computacionales seguidas de validación de los experimentos dirigidos.
Uso de los criterios anteriores, se identificaron seis nuevos miRNAs. Todos los seis cumplieron con los criterios
i Network -
iii Opiniones y tres de los seis criterio cumplido
iv
y tres criterio cumplido
v gratis (Figura 6; se proporcionan más detalles en el cuadro S5). Además, la cartografía de las nuevas secuencias de los genes miARN a la secuencia del genoma humano de referencia reveló que tres de los seis nuevos miRNAs están presentes en intrones de otros genes (y codificados en la misma cadena como los respectivos genes del huésped) (Figura 6), al igual que muchos miRNAs anotado anteriormente [37], [38]. Dos de nuestros nuevos miRNAs se encuentra en repeticiones anotados, pero tienen una fuerte evidencia suficiente de apoyo que fueron designados como novela. El contexto de la estructura precursora pronosticada y la secuencia de la estrella se forma miARN correspondientes a nuevos miRNAs se da en la Figura 6.
se muestran estructuras secundarias putativo de los seis nuevos miRNAs descubierto en este estudio. nuevas secuencias de genes miARN se muestran en las formas de color rojo y la estrella de nuevos miRNAs aparecen en azul (si se ha identificado en nuestro datos de secuenciación). Las secuencias son nuevos con respecto a la versión 12.0 miRBase [21], [22]. Identificadores entre paréntesis se refieren a las formas de estrellas miARN y los mismos se establecen en los datos de secuenciación 454. Correspondientes detalles de los nuevos miRNAs se dan en la siguiente tabla las estructuras de horquilla.
Las secuencias restantes comprendían 181 pequeños ARN de horquilla derivados (correspondientes a 550 loci del genoma). Hemos tratado de seleccionar de esta lista las secuencias más prometedores para designar como "candidato miRNAs" que podrían ser confirmados en el futuro como
de buena fe
miRNAs como prueba adicional se acumula. Se requiere candidato miRNAs para satisfacer los criterios
i-iii
y tienen algún tipo adicional de elementos de prueba (es decir, semillas región compartida con un miARN conocido). Esto nos ha permitido perfeccionar una lista final de 39 miRNAs potencialmente candidatos (procedentes de 50 loci del genoma) (cuadro S5).
Discusión
El trabajo que aquí fue motivado por la hipótesis de que la totalidad repertorio de miRNAs expresó en el cáncer de ovario, incluyendo miRNAs potencialmente en tejidos y específicos de cáncer, aún no había sido dilucidado. El enfoque de secuenciación masiva en paralelo nos permitió ser integral (es decir, la identificación no sólo conocido sino también novela miRNAs), y la naturaleza "digital" de los datos permitió una estimación semi-cuantitativa del nivel relativo de expresión para muchos miRNAs. Con este enfoque, hemos descubierto seis nuevos candidatos miRNAs y 39, y delineamos el patrón de expresión de 498 miRNAs anteriormente anotado en cultivos normales MANGUERA primaria y cáncer de ovario tejidos epiteliales. Es de destacar que de los cuatro estudios de microarrays miARN publicados de cáncer de ovario [17] - [20], incluso la más completa de las plataformas de gama se limitó a 470 miRNAs humanos y formas de estrellas [17], mientras que la versión actual de miRBase ( La versión 12.0) [21], [22] contiene 969 miRNAs humanos y formas de estrellas. Por otra parte, 223 de los miRNAs conocidos hemos identificado y caracterizado en nuestras bases de datos de secuenciación no estaban representados en el microarray aún más completa. Por lo tanto, los resultados presentados aquí se extienden sustancialmente la amplitud de conocimientos de miRNAs expresados en el cáncer de ovario.
La identificación de nuevos miRNAs en nuestros datos es particularmente notable. Dado que estos nuevos miRNAs no se han detectado en varios estudios de secuenciación de los genes miARN a gran escala de otros tejidos, se especula que se expresan de una manera específica del cáncer de ovario y pueden ser de especial interés como biomarcadores de cáncer. Se necesitan más estudios para probar esta hipótesis, así como para investigar las funciones biológicas de estos nuevos miRNAs en la patogénesis del cáncer de ovario.
En su conjunto, los miRNAs conocidos y novedosos identificados en este estudio proporcionan un conjunto de candidatos marcadores miARN para el análisis futuro como marcadores basados en sangre para la detección de cáncer de ovario. La expresión diferencial entre los estados normales y malignas puede proporcionar un método para la priorización de candidatos se mueve hacia adelante. También prevemos que los miRNAs que hemos encontrado para ser expresadas diferencialmente entre los subtipos histológicos de cáncer podrían servir a un doble propósito como marcadores basados en sangre, tanto para la detección del cáncer y la clasificación histológica.
Una de las características únicas de nuestro estudio es el uso de cultivos primarios de epitelio superficial del ovario humano normal como grupo de comparación normal. Aunque la superficie del epitelio ovárico (junto con epitelio trompa de Falopio distal cerca) se considera el origen del cáncer epitelial de ovario [39] mayoría de los otros estudios de perfiles de miARN han utilizado típicamente ovario conjunto como la comparación normal. Esto es problemático para la identificación de miRNAs que son expresados diferencialmente en el cáncer de ovario en relación a la normalidad debido a que la capa epitelial de la superficie celular de espesor único comprende mucho menos de 1% del contenido celular de todo el ovario. Realización de comparaciones de tejido de cáncer de ovario a un control normal apropiado es un problema difícil en la investigación del cáncer de ovario. Nuestro enfoque, aunque evita los problemas asociados con el uso de ovario entero como una muestra normal, tiene la limitación de que no sabemos si, y que los cambios en la expresión de microARN puede atribuirse a las condiciones de cultivo utilizadas para el cultivo celular MANGUERA primaria. Los estudios futuros que incorporan análisis paralelos de cultivos celulares primarios derivados de tejidos de cáncer de ovario puede abordar esta cuestión.
A pesar de que el uso de diferentes tipos de especímenes de ovario "normales" hace que la comparación de nuestros datos con otros estudios difíciles en la mayoría de los casos,