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PLOS ONE: Represión transcripcional, la metilación del ADN, y la desacetilación de histonas del regulador del G-proteína de señalización 10 Gen (RGS10) en cáncer de ovario Cells


Extracto

RGS10 regula el crecimiento celular de ovario cáncer y la supervivencia, y RGS10 expresión se suprime en modelos celulares de quimiorresistencia cáncer de ovario. Sin embargo, los mecanismos que regulan la expresión RGS10 en cáncer de ovario son poco conocidos. Aquí mostramos supresión RGS10 en el cáncer de ovario primario y Caov-3 células de cáncer de ovario en comparación con células inmortalizadas de ovario epitelial de superficie (IOSE), y en A2780-AD células quimiorresistentes comparación con las células A2780 parentales. RGS10-1 y RGS10-2 transcripciones se expresan en células de cáncer de ovario, pero sólo RGS10-1 se suprime en A2780-AD y células Caov-3, y el promotor RGS10-1 se enriquece única en dinucleótidos CpG. La inhibición farmacológica de la ADN metil-transferasas (DNMTs) aumentó la expresión RGS10, que sugiere la regulación potencial por la metilación del ADN. análisis de secuenciación de bisulfito identificado una región del promotor RGS10-1 con la metilación del ADN mejorado significativamente en las células A2780-AD quimiorresistentes relación con las células A2780 parentales. la metilación del ADN en las células Caov-3 y IOSE fue similar a las células A2780. No se observaron diferencias más marcadas en la acetilación de histonas del promotor RGS10-1. Acetilado H3 histona asociada con el promotor RGS10-1 fue significativamente menor en las células A2780-AD en comparación con las células parentales, con un aumento correspondiente de la histona deacetilasa (HDAC) asociación de la enzima. Del mismo modo, los niveles de histona acetilada en el promotor RGS10-1 fueron marcadamente inferiores en Caov-3 células en comparación con las células IOSE, y HDAC1 La unión se duplicaron en Caov-3 células. Finalmente, se muestra que la inhibición farmacológica de las enzimas HDAC Dnmt o en las células A2780-AD chemoresistant aumenta la expresión RGS10 y aumenta la toxicidad del cisplatino. Estos datos sugieren que la desacetilación de histonas y la metilación del ADN se correlacionan con la supresión RGS10 y quimiorresistencia en cáncer de ovario. Marcadores para la pérdida de la expresión RGS10 pueden identificar células cancerosas con una respuesta única a la terapéutica

Visto:. Ali MW, Cacan E, Liu Y, Pierce JY, Creasman WT, Murph MM, et al. (2013) La supresión de la transcripción, la metilación del ADN, y la desacetilación de histonas del regulador del G-proteína de señalización 10 Gen (RGS10) en células de cáncer de ovario. PLoS ONE 8 (3): e60185. doi: 10.1371 /journal.pone.0060185

Editor Académico: James Porter, de la Universidad de Dakota del Norte, Estados Unidos de América

Recibido: noviembre 20, 2012; Aceptado 22 de febrero de 2013; Publicado: 22 Marzo 2013

Derechos de Autor © 2013 Ali et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Los fondos para este trabajo fue proporcionada por subvenciones de los Institutos nacionales de Salud (NIH) (CA151006 a SBH y MM, CA131200 a la ECT), la Sociedad Americana del cáncer (a SFG), y el Centro Rivkin Marsha para la Investigación del cáncer de Ovario (a SBH). (Www.nih.gov/, www.cancer.org/, www.marsharivkin.org/) Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Las células cancerosas se explotan múltiples crecimiento mediada por el receptor y la supervivencia de señalización de vías para evadir la quiescencia y la muerte celular respuestas normales. La amplificación de estas vías es un mecanismo común en la progresión del cáncer. La activación de receptores acoplados a proteína G por los ligandos de ácido lisofosfatídico (LPA), la endotelina, de crecimiento derivado del estroma factor 1 (SDF1), prostaglandinas, y la trombina contribuye a la progresión de varios tipos de cáncer, y los fármacos que bloquean estos receptores se encuentran actualmente en varios etapas de ensayos clínicos como la terapéutica del cáncer [1]. Estos GPCRs inician el crecimiento y la supervivencia de señalización mediante la activación de cascadas celulares proteínas G. la actividad de la proteína G se termina por el regulador de la señalización de proteína G (RGS) proteínas que desactivan rápidamente las proteínas G y controlar la fuerza y ​​la duración de las vías iniciadas-GPCR [2]. RGS proteínas que suprimen las señales oncogénicas mediados por ligandos de GPCR están preparados para inhibir el crecimiento del cáncer. De hecho, las proteínas RGS específicos han demostrado suprimir el crecimiento de receptor estimulada y la supervivencia de señalización en mama, próstata, y cáncer de ovario [3] - [5]

El cáncer de ovario es la causa principal de muerte por cáncer ginecológico. y la quinta causa más común de muerte por cáncer en las mujeres. Menos del 50% de los pacientes con cáncer de ovario sobrevive cinco años después del diagnóstico [6]. Aunque el cáncer de ovario se caracteriza por una alta tasa de respuesta a la quimioterapia, su alta tasa de mortalidad se debe en gran parte al desarrollo de resistencia a los agentes quimioterapéuticos de primera línea [7]. La mayoría de los pacientes que inicialmente responden a la quimioterapia recaída con la enfermedad quimiorresistente plazo de dos años [8]. La comprensión de los cambios moleculares y genéticos que conducen a la progresión del cáncer de ovario y el desarrollo de la quimio-resistencia adquirida puede dar lugar a estrategias para predecir y prevenir la aparición de la enfermedad refractaria.

Hemos demostrado que las proteínas endógenas RGS suprimen el crecimiento de células de cáncer de ovario, la migración y la activación de la quinasa MAP en respuesta a LPA, un importante factor de crecimiento autocrino en el cáncer de ovario [3], [9]. Más recientemente, se han identificado RGS10 como un importante regulador de la supervivencia celular y la quimiorresistencia. la expresión del transcrito RGS10 es downregulated en múltiples modelos de quimiorresistencia adquirido en el cáncer de ovario, y los niveles de expresión RGS10 altera sensibilidad de las células de cáncer de ovario a cisplatino y taxano citotoxicidad [10]. Estas observaciones sugieren que la supresión de la expresión de RGS10 puede contribuir a la progresión del cáncer de ovario y el desarrollo de quimiorresistencia mediante la amplificación de crecimiento mediada por GPCR y rutas de señalización de supervivencia. Sin embargo, no se ha establecido el mecanismo de la supresión de la expresión RGS10 en el cáncer de ovario.

expresión de la proteína RGS se regula dinámicamente en neural y los sistemas cardiovasculares [11] y en la progresión del cáncer [12], lo que permite el control sobre complejo GPCR vías de señalización. Transcripcional y mecanismos postraduccionales para el control de la expresión de RGS están bien definidos [13] - [16], mientras que el control epigenético de la expresión RGS por modificaciones covalentes con el ADN o las histonas ha sido en gran parte sin explorar. El silenciamiento génico por metilación del ADN y la desacetilación de histonas es un mecanismo establecido en la progresión de muchos tipos de cáncer [17], incluyendo el cáncer de ovario [18] - [20]. La adición de grupos metilo a dinucleótidos CpG por las enzimas de metilo de ADN transferasa (DNMT) y la eliminación de grupos acetilo en los residuos de lisina en las proteínas de histona por la histona deacetilasa (HDAC) Las enzimas coordinadamente suprimen la actividad transcripcional [21]. metilación del ADN y la expresión aumento DNMT en la progresión del cáncer de ovario [22], y las histona desacetilasas (HDACs) también se sobreexpresa en tejidos de cáncer de ovario [23]. Esto sugiere que la regulación epigenética de los genes RGS también puede contribuir a su expresión dinámica en la progresión del cáncer.

En el presente estudio, se investigó la regulación epigenética de la expresión RGS10 en las células de cáncer de ovario. Nos centramos en dos modelos de supresión de RGS10 - 3 Caov-células de cáncer de ovario en comparación con las células epiteliales benignos de ovario y células A2780-AD chemoresistant y sus padres células sensibles a la quimioterapia. Identificamos un aumento significativo en la metilación del ADN en las células chemoresistant, y una marcada disminución en la acetilación de histonas y los aumentos en asociación HDAC1 en el promotor RGS10 tanto en las células Caov-3 y A2780-AD. Nuestros resultados sugieren que las modificaciones de las histonas epigenéticos pueden contribuir a la pérdida de la expresión RGS10 en las células de cáncer de ovario, y que la metilación del ADN pueden contribuir a una mayor pérdida de expresión durante la quimio-resistencia adquirida.

Procedimientos Experimentales

Las células y reactivos

células Caov-3 y Skov-3 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvieron en la Dulbecco Modificado medio Eagle (ATCC) y medio 5A de McCoy (Mediatech, Inc.), respectivamente, complementados con 10% de SFB (PAA Laboratories, Inc.). La línea celular sensible a la quimioterapia A2780 padres y sus células A2780-AD hija de contrapartida resistentes a múltiples fármacos (derivados como se describe [24]) fueron generosamente proporcionadas por el Dr. Bob Brown, el Imperial College de Londres. Estas células se mantuvieron en medio RPMI 1640 (ATCC) suplementado con 10% de FBS y 5 mM de L-glutamina. células quimiorresistente se mantuvieron adicionalmente en 1,5 M de cisplatino. las células epiteliales superficiales de ovario inmortalizadas (IOSE-80, [25]) fueron generosamente proporcionado por el Dr. Nelly Auersperg (Universidad de Columbia Británica) y se mantuvieron en Media 199: MCDB 105 (01:01) suplementado con 15% de SFB. Todas las células fueron cultivadas en 5 mM de penicilina-estreptomicina a 37 ° C con dióxido de carbono al 5%.

5-Aza-2 'desoxicitidina y cisplatino se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Anticuerpos que reconocen la histona H3 y la histona H3 acetilada eran de Millipore (Lake Placid, NY). Anticuerpo que reconoce la histona H3 (acetil K18) fue de Abcam (Cambridge, MA). Anticuerpos que reconocen RGS10 y HDAC1 se obtuvieron de Santa Cruz (Santa Cruz, CA).

celulares de viabilidad Ensayos

1 × 10
4 células A2780 o A2780-AD se sembraron por triplicado en placas de 96 pocillos y se dejaron unir durante 24 horas antes del tratamiento con las concentraciones indicadas de cisplatino durante 48 horas. ensayo de viabilidad celular se llevó a cabo en medio libre de suero que contiene el reactivo CellTiter-Blue® (Promega Corporation) como se describe anteriormente [10].

Cuantitativo PCR en tiempo real

ARNm fue aislado utilizando el reactivo Trizol ( Invitrogen) y se sintetizó ADNc a partir de 2 g de ARN total usando el kit de transcriptasa Inversa cDNA (Applied Biosystems /Life Technologies) de alta capacidad. reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real se realizó utilizando Superíndice III kit de RT-PCR (Invitrogen) y el reactivo de alimentación SYBR Green (Applied Biosystems). Las reacciones se normalizaron mediante la limpieza gen GAPDH y se realizaron cálculos de acuerdo con la 2
-ddCT método. Se determinó el cambio veces en la expresión por triplicado en tres experimentos independientes, y réplicas experimentales se ensayaron para determinar diferencias significativas entre los grupos usando pruebas t pareadas. Los cebadores utilizados se basaron en secuencias generadas algoritmo de PRIMER-Bank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). RGS10 Adelante: GCA CCA GAA GGC GTG AAA AGA, RGS10 inversa: GCT GGA CAG AAA GGT CAT GTA GA, RGS10 variante-1 Adelante: CCC GCG GCG ATG TTC AAC C, RGS10-variante-1 Reverse: CTC CAG GGA TGC CGC CCA TT, RGS10-variante-2 Adelante: TGC GTG GAA CTT CTC AGG TGG ACA, RGS10 variante-2 inversa: CCG CCC ATT TGG CTG TGC TCT, RGS2 Adelante: AAG ATT GGA AGA CCC GTT TGA G, RGS2 inversa: GCA AGA CCA TAT TTG CTG GCT, RGS5 Adelante: CCC ACT CAT GCC TGG AAA GG, RGS5 inversa: CTT GGC TGG TTT CTC TGG CT, GAPDH Forward: GCC AAG GTC ATC CAT GAC AAC T, GAPDH inversa: GAG GGG CCA TCC ACA GTC TT.

para determinar el efecto de la exposición a 5-aza-2'- desoxicitidina en la expresión del transcrito RGS, 7 × 10
5 Skov-3 células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 100 mm y dejó que se unieran durante la noche. El siguiente día, se aspiró el medio y se reemplaza con 20 mM 5-Aza-2 'desoxicitidina en el control de vehículo DMSO o DMSO. Después de 3, 5, 7 y 9 días de incubación de drogas, se aspiró el medio y se añadió 7 ml de reactivo Trizol (Invitrogen). El aislamiento de ARN, la síntesis de ADN, y QRT-PCR se realizaron como anteriormente.

El aislamiento de células de cáncer de ovario A partir de ascitis peritoneal

ascitis peritoneal de pacientes con cáncer de ovario en la Universidad Médica de Carolina del Sur (MUSC ) se obtuvieron en MUSC Junta de revisión Institucional (IRB) de protocolo#18983, que incluía una revisión de la ética del estudio y aprobado específicamente el estudio. Este protocolo implica el uso de muestras humanas de-identificado para el estudio de la expresión y la modificación de las proteínas implicadas en la señalización celular y la resistencia a fármacos en células de cáncer de ovario primario. La eliminación de ascitis peritoneal es un estándar de cuidado para los pacientes con cáncer de ovario y la ascitis se desecha normalmente. Todas las muestras recibidas se des-identificarse antes de la entrega al personal de laboratorio. Los pacientes fueron informados de la opción de participar en el estudio y el consentimiento verbal se obtuvo por el médico. consentimiento por escrito se consideró un riesgo para la confidencialidad del paciente por el IRB ya firmar un formulario de consentimiento para el permiso de usar una muestra de-identificado sería el único registro de la identidad y la participación del paciente, y por lo tanto el único riesgo de una brecha en la confidencialidad del paciente. Un registro de las muestras recibidas en el laboratorio se registra sólo por la fecha de recogida. La eliminación de ascitis peritoneal es un estándar de cuidado para los pacientes con cáncer de ovario. No hay información de identificación del paciente se obtuvo por los investigadores en el laboratorio. ascitis peritoneal se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente y los sedimentos celulares se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los glóbulos rojos se lisaron en tampón de lisis RBC (eBioscience, San Diego, CA) durante 5 min a temperatura ambiente. El tampón de lisis se diluyó con PBS, las células se centrifugaron como anteriormente y se resuspendieron en medio RPMI con 10% de FBS. Las células se incubaron durante 1 hora a 37 ° C con 5% de CO2 para permitir la unión de los fibroblastos y macrófagos. células epiteliales no unidas se eliminaron y se incubaron por separado en medio completo RPMI que contenía suero bovino fetal al 10%.

Rgs10 inmunotransferencias

Para evaluar la expresión RGS10 en ascitis primarios y células IOSE, lisados ​​celulares se generaron en RIPA tampón (pH 7,4, 10% de glicerol, NaCl 150 mM, 1% de Triton X100, 0,5% de SDS, EDTA 0,5 mM, EGTA 0,5 mM, mM Na4P2O7 5, 40 mM β-glicerofosfato, mM NaF 50, de fenilmetilsulfonilo Tris 50 mM 2 mM fluoruro y aprotinina). Después de tratamiento con ultrasonidos y centrifugación, cantidades iguales de proteína soluble se corrieron en un gel SDS PAGE 10-12%, se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpo RGS10. Para evaluar la expresión RGS10 en líneas celulares, 10
5 células se lisaron en tampón de muestra de SDS-PAGE. Los lisados ​​se hirvieron durante cinco minutos y se analizaron mediante SDS-PAGE. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios RGS10 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) y anticuerpos secundarios de conejo conjugados con HRP (Pierce) y se visualizaron usando reactivos ECL (Pierce). Las membranas se transfirieron posteriormente con anticuerpos GAPDH (Life Technologies) como control de carga.

bisulfito de Secuenciación

La página web Methprimer [26] (http://www.urogene.org/methprimer/index1 .html) se utilizó para analizar el contenido de CpG de promotores RGS y el diseño de cebadores dirigidos a diferentes regiones en el promotor RGS10-1. Cuatro pares de cebadores diferentes fueron diseñadas, RGS10-BS1, RGS10-BS2, RGS10-BS3 y RGS10-BS4: RGS10-BS1forward: AAG AAA ATG GGG GTT AAT GAT ATT T, RGS10-BS1reverse: TAC CTC TAA AAC AAC CTT CAA ACT C , RGS10-BS1 región de amplificación: -121.303.236--121303086. RGS10-BS2forward: TGT TTT TAA TAG AGA AGT AGT GTT T, RGS10-BS2reverse: CAC AAA AAA CTA CTA AAC AAC CTC, RGS10-BS2 región de amplificación: -121.303.076 a -121302726. RGS10-BS3forward: GAG GAG GTA AAG GGT GTT ATA TGG, RGS10-BS3reverse: AAA TAC ACT CAA CCA AAA AAA ACC CC, RGS10-BS3 región de amplificación: -121.302.800--121302514. RGS10-BS4forward: GTT TGG TTA GGA GGA GG, RGS10-BS4reverse: CTC CAA TCT AAA AAA TAC CAC, RGS10-BS4 región de amplificación:. -121302327--121.301.988

El ADN genómico se extrae de las células y bisulfite- convertido usando el kit EZ-metilación del ADN directa (Zymo Research Corp). ADN ZymoTaq ™ polimerasa (Zymo Research Corp) se utilizó para amplificar diferentes regiones en RGS10 promotor de ADN genómico tratado con bisulfito y los productos de PCR fueron analizados con 2,5% de geles de ADN-agarosa y se purificó utilizando PureLink rápida de extracción de gel y Kit de purificación de PCR Combo (Invitrogen ). Los productos purificados se ligaron en plásmidos usando StrataClone PCR Cloning Kit (Agilent Technologies) que después se transforma en bacterias competentes. 20 colonias individuales fueron aisladas de las placas de LB-agar de carbenicilina y se expandieron. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Sample & amp; ensayo Technologies) se utilizó para purificar los plásmidos de cada colonia, que se envía a continuación para la secuenciación usando T7 y /o T3 cebadores promotor de secuenciación en Facility UGA Genómica. secuencias de clon se sometieron a las pantallas de la calidad y la conversión completa, y alineados con el promotor de ADN genómico utilizando el software RGS10 Biq Analizador [27].

Inmunoprecipitación de cromatina (chips) Ensayo

Las células se sembraron a una densidad de 2,5 x 10
6 en placas de cultivo de 15 cm de tejido y reticulado con 1% de formaldehído durante 8 minutos a temperatura ambiente. La reacción de reticulación se interrumpió mediante la adición de 0,125 M de glicina durante cinco minutos a temperatura ambiente. Los núcleos celulares se aislaron y se concentraron por lisis en tampón de lisis SDS fresca (1% de SDS, EDTA 10 mM, 50 mM Tris pH 8.0, dH
2O) más inhibidores de la proteasa durante 25 minutos sobre hielo seguido de congelación de flash en nitrógeno líquido. Los núcleos se sometió a ultrasonidos utilizando un baño de ultrasonido agua Bioruptor durante 30 segundos en "On", 30 seg "Off" 3X para generar un promedio de 500 pares de bases del ADN cortado. esquila de ADN fue confirmada por someter lisados ​​a electroforesis en gel de agarosa al 1% y la visualización por tinción SYBR seguro. lisados ​​sonicados fueron entonces preclarificaron con cuentas de esperma de salmón /agarosa (Upstate) y 5% de la total de lisado se almacenó como entrada para la normalización. La mitad de la lisado restante se inmunoprecipitó con 5 g de anticuerpo indicado durante la noche a 4 ° C y la otra mitad se inmunoprecipitó con anticuerpo de control. Tras una inmunoprecipitación adicional de dos horas con 60 l de perlas de agarosa recubierta de esperma de salmón, todas las muestras se lavaron con cada uno de los siguientes tampones: tampón de baja sal (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, dH2O), tampón de alto contenido de sal (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, 20 mM Tris pH 8,0, NaCl 500 mM, dH2O), LiCl (0,25 M LiCl, 1% NP40, 1% DOC, EDTA 1 mM, 10 mM Tris pH 8,0, dH2O), y 1xTE. DNA se eluyó con tampón de elución de SDS (1% SDS, 0,1 M NaHCO3, dH2O). Después de la elución, los enlaces cruzados se invirtieron durante la noche con 5 M de NaCl a 65 ° C y se aisló el ADN inmunoprecipitado usando fenol: cloroformo: mezcla isopropanol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. ADN aislado se cuantificó por PCR en tiempo real en un ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando los siguientes cebadores y la sonda para RGS10: adelante, 5'-GGA ACC GCG AGT CCT CAC-3 ', reverse, 5' -CIC GGA GCT GGT CTA CCC-3 'y la sonda, 5'-TGG CTA GGA GGA GGG CGG CG-3'; y para GAPDH: adelante, 5'-AAT GAA TGG GCA GCC GTT A-3 ', inversa, 5'-TAG CCT CGC TCC ACC TGA TC-3' y la sonda, 5'-CCT CCG GGT GAC TAA CCC TGC GCT CCT -3 '. Los valores generados a partir de las reacciones de PCR en tiempo real se calculan en función de las curvas de calibración generadas, se corrieron en las reacciones por triplicado, y se analizaron mediante el programa SDS 2.0.

Resultados

Supresión Del Rgs10 expresión en cáncer de ovario Las células

Nuestros datos anteriores demostraron regulación a la baja de las transcripciones RGS10 en líneas celulares de cáncer de ovario con la quimio-resistencia adquirida [10]. Para determinar si RGS10 también es downregulated en células de cáncer de ovario primarios, immunoblotted lisados ​​de la célula benigna, inmortalizado IOSE y de seis muestras de células de cáncer de ovario epiteliales primarias aisladas a partir de ascitis de pacientes (Figura 1A). expresión de la proteína RGS10 era notablemente inferior en las células de cada paciente, lo que sugiere que la expresión RGS10 se suprime en el cáncer de ovario clínica. Dado que las muestras de pacientes son heterogéneos y no renovable, su uso en la definición de mecanismos de supresión es limitado. Para establecer un modelo de células renovable, homogénea de la pérdida de expresión RGS10 en cáncer de ovario, se comparó la expresión en células de RGS10 IOSE y la línea celular de cáncer epitelial de ovario seroso Caov-3 (Figura 1B, C). RGS10 transcripción y proteínas fue significativamente menor en Caov 3-células en comparación con las células control IOSE.

A. células de cáncer de ovario se aislaron de la ascitis maligna del paciente y los niveles de expresión RGS10 se compararon con células IOSE a través de Western Blot. ANTES DE CRISTO. RGS10 transcripción (B) y los niveles de expresión de proteínas (C) se compararon en Caov-3 líneas celulares de cáncer de ovario y células epiteliales de ovario benignos IOSE utilizando QRT-PCR y Western Blot. D. cisplatino curvas de dosis-respuesta se determinaron mediante ensayos de viabilidad CellTiter-azul en las células A2780 y A2780-AD. E.-F. RGS10 transcripción (E) y los niveles de proteína (F) se compararon en las células A2780-AD quimiorresistentes en relación con su parental A2780 línea celular sensible a la quimioterapia. **: P & lt; 0,01, ***:. P & lt; 0,0001

Nuestra observación anterior de que RGS10 es suprimida en las células chemoresistant se hizo en las publicaciones de transcripción expresión de datos de pares de células de cáncer de ovario sensibles a la quimioterapia y chemoresistant [ ,,,0],10]. Para el presente estudio, se obtuvieron células de cáncer de ovario A2780 y A2780 derivado de su resistencia-AD a múltiples fármacos. Las células A2780-AD se derivaron de las células A2780 de los padres a través de la exposición crónica a bajas dosis de fármaco citotóxico, y por lo tanto representan un modelo para la quimio-resistencia adquirida [28], [29]. Se confirmó la pérdida de sensibilidad a la citotoxicidad inducida por cisplatino en células A2780-AD, y demostramos que la transcripción y expresión de la proteína RGS10 se reduce en las células A2780-AD en comparación con células A2780 parental (Figura 1 D-F). En su conjunto, la transcripción y la expresión de la proteína RGS10 se reduce en las células de cáncer de ovario primarios y la Caov-3 línea celular de cáncer en relación con las células epiteliales de ovario inmortalizadas, y en las células A2780 relación con las células parentales. Nos centramos los siguientes estudios sobre estas dos comparaciones.

Rgs10 Promotores

El gen RGS10 humana reside en la cadena negativa del cromosoma 10 y contiene dos sitios de inicio de la transcripción, dando lugar a dos transcritos distintos y productos de genes (Figura 2A, B). Las variantes tienen primeros exones únicas, y comparten cuatro exones comunes. La transcripción ya RGS10-1 da lugar a un 21 RGS10a kDa de proteínas que contienen 181 aminoácidos. La variante de transcripción RGS10-2 más corto da lugar a una RGS10b 19,5 kDa proteína compuesta de 167 aminoácidos. Sólo una única banda inmunorreactiva RGS10 es detectable en las células de ovario, y es consistente con el peso molecular predicho de RGS10a (Figura 1). Para determinar si ambos transcritos son detectables y suprimió de manera similar en el cáncer de ovario, se realizó qRT-PCR utilizando cebadores variante específica. Ambos se detectaron las transcripciones largas y cortas en todas las líneas celulares mediante qRT-PCR, pero RGS10-2 se expresó en niveles mucho más bajos que RGS10-1. la expresión del transcrito RGS10-1 en Caov-3 células de cáncer de ovario es aproximadamente el 20% del nivel de expresión observada en las células IOSE, comparable a la reducción observada veces para ver la transcripción total de RGS10. Sin embargo, la transcripción más corto, RGS10-2, no es significativamente diferente entre las dos líneas celulares (Figura 2C). Además, la expresión del transcrito RGS10-1 se downregulated en la línea celular derivada A2780-AD quimioresistente, mientras que los niveles se incrementaron RGS10-2 (Figura 2D). Estos resultados sugieren que la supresión de la transcripción en RGS10 Caov-3 y las células de cáncer de ovario A2780-AD es única para RGS10-1, y sugiere que el mecanismo puede estar dirigida a la región del promotor único.

A. El gen RGS10 (Geneid: 6001) se encuentra en la cadena negativa del cromosoma 10 (NCBI adhesión: NC_000010.10) en la posición -121302222 hasta -121.259.339. Dos variantes de la transcripción RGS10-1 (adhesión: NM_001005339) y RGS10-2 (adhesión: NM_002925) se han reportado para RGS10 basado en los sitios de inicio alternativos que dan lugar a primeros exones distintos. B. El isoformas de la proteína resultante RGS10a (adhesión: NP_001005339) y RGS10b (adhesión: NP_002916) varían solo por los primeros 18 o tres aminoácidos. El dominio RGS conservada está subrayado. DISCOS COMPACTOS. La expresión de la transcripción total de RGS10 (RGStot), RGS10-1, y RGS10-2 se determinaron en IOSE y Caov-3 células (C) y en las células parentales y células A2780 A2780-AD chemoresistant (D). **: P & lt; 0,01, ***:. P & lt; 0,0001

La metilación del ADN de Rgs10 promotores en células de cáncer ovárico

Los promotores que contienen G-C rica "islas CpG" típicamente tener bajos niveles de metilación en los tejidos normales, pero se vuelven hypermethylated durante la progresión del cáncer [30], [31], lo que sugiere que los genes con las islas CpG en sus promotores son objetivos potenciales para el silenciamiento transcripcional por la metilación del promotor de ADN en células de cáncer. El análisis de una kilobase región 1 aguas arriba de los sitios de inicio de la transcripción y de 0,5 kilobase aguas abajo de los sitios de inicio de la transcripción y RGS10-1 RGS10-2 revela una notable diferencia en el contenido de CG y el número de dinucleótidos CpG entre las dos regiones promotoras RGS10 ( Figura 3A). La región promotora de RGS10-1 contiene 60 a 80% de contenido de CG e incluye aproximadamente 120 dinucleótidos CpG, mientras que el promotor RGS10-2 contiene menos de 30. En comparación, el análisis del promotor RGS2 tiene contenido CpG similar a RGS10-1, mientras el promotor de RGS5 contiene unos dinucleótidos CpG.

A. Las regiones promotoras de RGS10-1, RGS10-2, RGS2, y RGS5 Se analizó el contenido de CpG utilizar el sitio Methprimer. Para cada promotor, una región de ADN genómico de 1000 pares de bases 5 'del sitio de inicio de la transcripción y 500 pares de bases 3' del sitio de inicio se evaluaron para el contenido de GC por ciento y dinucleótidos CpG individuales. la posición de nucleótido se indica a lo largo del eje x contenido y GC se representa gráficamente en el eje y; islas CpG se indican con sombreado. Cada dinucleótido CpG está indicada por una marca de almohadilla debajo de la numeración de nucleótidos, y el sitio de inicio de la transcripción se indica con una flecha. regiones de amplificación para cuatro pares de cebadores de secuenciación de bisulfito se indican mediante barras horizontales (BS10-1, BS10-2, BS10-3, BS10-4). B. células Skov-3 fueron tratados con vehículo o el inhibidor de DNMT 5-Aza durante nueve días, y los niveles de transcripción de los RGS indicadas y controles GAPDH se midieron a los 3, 5, 7 y 9 días de tratamiento. La transcripción RGS se normalizó a GAPDH, y se representa gráficamente en relación con la expresión en los controles tratados con vehículo en cada momento.

La alta concentración de dinucleótidos CpG en el promotor RGS10-1 sugiere que el gen RGS10 es un objetivo potencial para la regulación de enzimas DNMT y puede ser suprimido en la progresión del cáncer de ovario por la metilación del ADN mejorada. Para probar esta predicción, se determinó el efecto de la inhibición de la metilación del ADN en la expresión RGS10. El DNMT inhibidor de 5-Aza 2'deoxycytidine (5-Aza) bloquea la adición de grupos metilo a dinucleótidos CpG en el ADN recién sintetizado de células en proliferación [32]. Por lo tanto, los efectos de la 5-Aza en la metilación del ADN y la expresión génica se manifiestan después de múltiples rondas de división celular. Las células se trataron con vehículo o con 5-Aza para un total de nueve días, y el efecto sobre los niveles de transcripción de RGS10-1, RGS2 y RGS5 se determinó cada dos días. De acuerdo con las predicciones de la isla CpG, la expresión RGS5 no cambia con 5-Aza tratamiento, mientras que los niveles de transcripción RGS10-1 y RGS2 son aproximadamente 8 veces mayor en 5-Aza células tratadas en comparación con células tratadas con vehículo (Figura 3B). Este resultado sugiere que las enzimas DNMT probablemente contribuyen a la supresión de los niveles de transcripción RGS10-1.

bisulfito de secuenciación de Rgs10-1 Promotores

Predijimos además que la frecuencia de metilación en promotores RGS10-1 haría ser mayor en las células de cáncer de ovario con los niveles de expresión RGS10-1 inferiores. residuos de citosina metilado y un-metilado son distinguibles por el tratamiento con bisulfito, que convierte no metilada, pero no metilado, bases de citosina en uracilo. En primer lugar, realizó la secuenciación de bisulfito para comparar la frecuencia de metilación del ADN en promotores RGS10-1 entre los padres y las células A2780 A2780 chemoresistant-AD. ADN genómico tratado con bisulfito se amplificó usando cuatro pares de cebadores superpuestos diseñados para cubrir la totalidad de una región de 1000 pares de bases aguas arriba de 200 pares de bases aguas abajo de la RGS10-1 inicio transcripcional sitio. clones aislados de ADN genómico tratado con bisulfito se secuenciaron y se alinean con el ADN genómico utilizando software BIQ analizador para determinar el estado de metilación de cada sitio CpG en el promotor RGS10-1 en al menos 10 clones. Los resultados obtenidos con BS10-2 par de cebadores se muestran en la Figura 4, y los resultados obtenidos utilizando BS10-1, BS10-3, y BS10-4 se muestran en la Figura S1.

ADN genómico promotor RGS10 se alineó con las secuencias individuales de los productos de PCR clonados a partir de la amplificación de par BS10-2 cebador de tratado con bisulfito de ADN genómico de las líneas celulares indicadas. Las secuencias fueron sometidos a análisis de control de calidad y alineados utilizando software BIQ Analyzer. En esta representación convencional 'piruleta', cada sitio CpG en la región (-121 303 076 -121 302 726 →) se indica con un círculo; círculos rellenos están metilados, círculos vacíos no están metilados. Lollipop representaciones del estado de metilación de cada sitio CpG en regiones promotoras RGS10-1 amplificada por BS10-1, BS10-3, y conjuntos de primer BS10-4 están disponibles en la información de apoyo.

Uso de la los datos de secuenciación de bisulfito, se determinó la frecuencia de metilación de CpG sitios en todo el promotor RGS10-1 en A2780 y A2780 células-AD (Figura 5, el cuadro S1). La frecuencia de metilación CpG en los sitios en todo el promotor RGS10-1 fue baja; la mayoría de los sitios CpG no metilado eran completamente o se metilado en el 10-20% de los clones. Una excepción fue el dinucleótido en la posición -121 030 162, que fue altamente metiladas en ambas líneas celulares. En el conjunto del promotor, la tasa de metilación fue ligeramente mayor en las células A2780-AD que en las células A2780 parental (Figura 5A, recuadro). Esta diferencia fue más pronunciado en múltiples sitios CpG adyacentes en la región de -121 303 155 → -121 303 007 (indicado por la barra horizontal de puntos, la Figura 5A). La tasa global de metilación en toda esta región se duplicó en las células chemoresistant comparación con las células parentales (Figura 5A, recuadro). Estos datos sugieren que la metilación de ADN mejorada local en una región de aproximadamente 800 pares de bases aguas arriba del sitio de inicio transcripcional se correlaciona con la pérdida de la expresión RGS10 en quimiorresistencia adquirida. A continuación realizó el mismo análisis de los promotores RGS10-1 en IOSE y células Caov-3. tasas de metilación a través de todo el promotor RGS10-1 y en la región identificada anteriormente fueron similares en IOSE y Caov-3 células (Figura 5B).

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