Extracto
Un problema importante en la investigación del cáncer es la falta de un modelo manejable para la metástasis tardía. En este documento se muestra que las células de cáncer suprimidos por SISgel, un material normal ECM de formación de gel derivada de intestino delgado submucosa (SIS), en xenoinjertos de flanco muestran propiedades de supresión y re-activación que son muy similares a la metástasis retraso normal y sugieren que estas células suprimidas puede servir como un nuevo modelo para el desarrollo de terapias para apuntar micrometástasis o células cancerosas suprimidas. Co-inyección con SISgel suprime el fenotipo maligno de las células de cáncer de vejiga altamente invasivos J82 y las células de cáncer de vejiga JB-V altamente metastásicas en xenoinjertos de flanco ratón desnudo. Las células pueden permanecer viables hasta 120 días sin que se formen tumores y parecía mucho más altamente diferenciados y menos atípica que los tumores de células co-inyectados con Matrigel. En el 40% de los xenoinjertos SISgel, el crecimiento se reanudó en el fenotipo maligno después de un período de supresión o de latencia durante al menos 30 días y era más probable con la implantación de 3 millones o más células. El colágeno de tipo I ordinaria no suprimió el crecimiento maligno y tumores desarrollado tan bien como con colágeno con Matrigel. Una señal clara en la expresión génica a través de diferentes líneas de células no se observó por análisis de transcriptoma de microarrays, pero en contraste, Reverse Phase análisis de proteínas de 250 proteínas a través de 4 líneas celulares identificadas integrina Vinculado quinasa (CIC) de señalización que se confirmó funcionalmente por un inhibidor de ILK. Sugerimos que las células cancerosas suprimidas en SISgel podrían servir como modelo para la latencia y re-despertar para permitir la identificación de dianas terapéuticas para el tratamiento de micrometástasis
Visto:. Hurst RE, Hauser PJ, Kyker KD, Heinlen JE , Hodde JP, Hiles MC, et al. (2013) La represión y la activación del fenotipo maligno por la matriz extracelular en xenoinjertos de cáncer de vejiga modelos: un modelo para la célula tumoral "latencia". PLoS ONE 8 (5): e64181. doi: 10.1371 /journal.pone.0064181
Editor: G. Hidayatullah Munshi, Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 23, 2012; Aceptado: April 12, 2013; Publicado: 24 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Hurst et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado, en parte, por becas de investigación R01CA75322, R01DK69808, una subvención del cocinero Biotech y una subvención del Centro de cáncer Stephenson (REH); R01 CA136944 y R43 CA135867 (MAI) y R43CA139804 (PJH). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: Robert Hurst, Paul Hauser, Kim y Michael Kyker Ihnat son todos los accionistas en DormaTarg, Inc. Michael Hiles y Jason Hodde son empleadas por Cook Biotech. Ninguno de los otros autores no tienen intereses en competencia. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La expresión del fenotipo maligno no es ni una consecuencia inmediata ni siquiera inevitable de la mutación de genes supresores de tumores u oncogenes. Desde hace tiempo se sabe que sin la remodelación de la matriz extracelular (ECM), las células cancerosas son capaces de formar tumores [1], [2] y que el ECM en sí contiene elementos tanto de antagonistas y agonistas del fenotipo maligno [1]. La importancia de la ECM se ha vuelto más evidente a medida que el fenómeno de la latencia de las células metastásicas se ha reconocido [3] - [5], y que el primer paso comprometido en la metástasis es el escape de células micrometastásicas de factores inhibidores locales que tienden a favorecer seguido latencia [6], [7]. Además, el descubrimiento de que las células con genomas anormales expresan antígenos asociados a tumores en urotelio histopatológicamente normal [8] o células con mutaciones de p53 característicos del tumor primario se encuentran mucosa oral en histopatológicamente normal [9] demuestra que las células cancerosas pueden enmascararse como células normales . La supresión de las propiedades malignas de células con el potencial de formación de tumor bien puede ser la base del período de latencia de crecimiento del tumor primario, así como de recidiva local y distal retardada. Tal vez "latencia" puede contribuir a la razón por la que incluso con terapias más nuevas "selectivos" y miles de millones de dólares en la investigación del cáncer, la supervivencia global específica del cáncer ha cambiado poco [10], [11]. células inactivas incluso no han sido reconocidos como un objetivo potencial hasta hace poco [12], y claramente tales células son resistentes a la quimioterapia convencional debido a la eficacia muy limitada de la quimioterapia adyuvante [3], [13]. Lo que se necesita es un sistema modelo con el que investigar los mecanismos de la represión y la activación de las células cancerosas por el ECM, que también puede ser utilizada para identificar y probar drogas que se dirigen a las células cancerosas ECM-suprimida.
A principios demostramos que el fenotipo de las células cancerosas de la vejiga fue radicalmente diferente en cultivo organotípico 3-dimensional cuando se crece en una preparación normal de la matriz extracelular (SISgel) en comparación con la observada en una preparación de cáncer modulada permisiva extracelular de matriz (Matrigel) [14]. SISgel es un material formador de gel derivada de acelular submucosa de intestino delgado porcino, mientras que Matrigel es una preparación de membrana basal obtenido a partir de un sarcoma de ratón [15]. Cuando se cultiva en Matrigel de las células de cáncer de vejiga recapitulan el fenotipo reportado para el tumor original. En agudo contraste, la mayoría de las propiedades malignas se perdieron cuando se cultivaron las células en SISgel [14]. Las líneas celulares derivadas de papilomas cultivaron en SISgel forman una estructura en capas que recuerda a urotelio normal, mientras que las líneas celulares derivadas de tumores de grado superior forman una capa no invasiva de las células [14]. Estos hallazgos sugieren que el crecimiento de las células cancerosas en el normal ECM podría servir de modelo para investigar el fenómeno de la supresión de tumores malignos por ECM normal y su papel en la metástasis y la recurrencia.
En esta comunicación se exploró si la supresión fenotípica visto en la cultura organotípicos de las células de cáncer de vejiga en SISgel también se observa
in vivo
. Los resultados positivos apoyan el uso de SISgel como un modelo para las investigaciones del fenotipo de las células tumorales latente o suprimido y de los mecanismos por el que la ECM normal, ejerce una influencia inhibitoria sobre la tumorigénesis y metástasis. Los resultados sugieren fuertemente que las interacciones de las células de cáncer con normal ECM desempeñan un papel importante en la recidiva y metástasis y además sugieren que la orientación células suprimidas podría representar un punto sin explotar hasta ahora de vulnerabilidad en la terapia del cáncer.
Resultados
El fenotipo de una de las líneas celulares de cáncer de vejiga agresivos cultivadas en SISgel, colágeno y Matrigel en cultivo se ilustra en la Fig. 1. Se observa un fenotipo agresivo invasora en Matrigel y colágeno. En Matrigel, las células invadidas, pero como un frente, como se observa en los tumores clínicos. En el colágeno, las células individuales invadido, mientras que algunas células se mantuvieron en la superficie del gel, y los que invadió tenía un aspecto mesenquimal. Las células cultivadas en Matrigel también mostraron una gama de tamaños y orientaciones nucleares indicativos de un fenotipo agresivo. Este fenotipo contrasta marcadamente con la observada en SISgel, donde las células no pudieron invadir y forman una capa en la parte superior del gel. Las células mostraron un fenotipo epitelial, y los núcleos fueron más uniformes y organizados indicativo de un fenotipo normalizado.
Nota la pérdida de la invasión y de la apariencia más ordenada de las células cultivadas en SISgel. Todos los aumentos son 200X. Las imágenes son representativas de un mínimo de 4 experimentos.
A continuación se determinó si también se observó la supresión de propiedades malignas visto en la cultura de 3 dimensiones
in vivo
en xenoinjertos de flanco. Los resultados típicos que usan las células J82 se ilustran en la Fig. 2. Una imagen de fluorescencia de las células justo después de la inyección se muestra en la Fig. 2A. La aparición de un tumor que creció a partir de células co-inyectados con Matrigel se ilustra en la Fig. 2B. Higo. 2C muestra el resultado típico con las células co-inyectados con SISgel. Las células se mantienen como un punto plano que brilla débilmente bajo iluminación emocionante, pero que por lo general no forma un tumor en crecimiento y permanece visible durante semanas. En una fracción de estos xenoinjertos SISgel, sin embargo, las células escapan de supresión y comienzan a crecer como un tumor activo, como se ilustra en la Fig. 2D. Como se muestra a continuación, la fracción que se escapa de reanudar el crecimiento activo depende del número de células inyectadas.
Las células (A) observaron 24 horas después de la implantación. (B) las células co-inyectados con Matrigel observado después de 60 días que muestran crecimiento activo tumor. (C) las células co-inyectados con SISgel observaron después de 50 días, que muestre las células permanecen viables, pero no están creciendo en un tumor ( "punto brillante"). células (D) co-inyectados con SISgel que escapó tras la supresión inicial mostrada 60 días después de la inyección. Las células se mantuvieron como un punto brillante (véase C) durante 45 días, y luego volvieron a crecer rápidamente como un tumor. El crecimiento se define como dos aumentos consecutivos de tamaño.
Los tumores que se forman a partir de células co-inyectados con Matrigel, colágeno I o que se escapó de las células co-inyectados con SISgel se examinaron histopatológicamente junto con uno de las manchas de células fluorescentes suprimidas no pudo convertirse en un tumor en crecimiento. Estos resultados, presentados en la Figura 3, confirman que las células son suprimidas por SISgel. Higo. 3A muestra una sección típica de las células JB-V que crecieron en un tumor tras la co-inyección con Matrigel. La apariencia es la de un tumor agresivo con numerosos cuerpos apoptóticos y figuras mitóticas. Las células son marcadamente pleiomorphic y altamente anaplásico, áreas de necrosis por coagulación están presentes y la mayoría de los barcos parecen anormales. La histopatología de uno de los parches suprimidas de las células co-inyectados con SISgel se muestra en la Fig groseramente. 2C se presenta en la Fig. 3B. En contraste con los tumores en crecimiento activo, las células son más diferenciado, menos anaplásico o pleiomorphic con vasos normales que aparecen, muy pocas figuras mitóticas, y las pruebas de mimal zonas apoptóticas o necróticas. Higo. 3C ilustra una sección de uno de los tumores que crecieron de SISgel tras un período de latencia de 8 semanas. El tumor es histopatológicamente similar a la Fig. 3A y confirma que cuando los tumores escapan de la represión, se reanuden en un fenotipo agresivo. Higo. 3D muestra que las células co-inyectados con colágeno también formar un tumor de aspecto agresivo con características similares a las figuras 3A y 3B. Trichrome tinción para colágeno en todos los tejidos reveló que por el momento se recogieron estos tumores o parches de células suprimidas, el colágeno original en el medio de co-inyección había desaparecido (no mostrado). La única colágeno discernible en la Fig. 3B era los vasos. Higo. 4 contrasta expresión del marcador de proliferación, Ki67 y el marcador mesenquimal, vimentina en xenoinjertos de flanco y confirma la evaluación histopatológica presentado en la Fig. 3. Como se muestra, muy pocas células en el tejido celular suprimida están en el ciclo celular, y hay muy poca expresión de vimentina. Por el contrario, los tumores en crecimiento activo se caracterizan por un alto nivel de expresión de ambos, lo que indica un fenotipo agresivo en crecimiento. Los tumores de células J82 fueron muy similares a los presentados para las células JB-V en todos los aspectos.
características identificadas histopatológicamente se muestran como sigue. Las áreas de las células malignas se resumen en negro, y áreas de necrosis coagulativa se muestra en amarillo. Las flechas negras muestran cuerpos apoptóticos. Las flechas amarillas identificar figuras de mitosis. A nivel de zoom que se muestra aquí éstas son difíciles de distinguir, pero se identificaron con el aumento máximo. (A) Las células co-inyectados con Matrigel que inmediatamente presentó un patrón de crecimiento maligno. La descripción natural observada grandes áreas de necrosis coagulativa con la inflamación aguda (las células pequeñas y densas son neutrófilos) con una superficie de células muy atípicas que revelan marcada pleomorfismo nuclear, todos los indicativos de neoplasia de alto grado. (B) Las células co-inyectados con SISgel que quedaba en el fenotipo suprimido o inactivo. En esta diapositiva se leyó como células con atipia celular moderado y pleomorfismo con evidencia mínima de la necrosis coagulativa, la mitosis y apoptosis. (C) Las células co-inyectados con SISgel que inicialmente presenta un fenotipo suprimido durante 8 semanas pero luego se reanuda el crecimiento en el fenotipo maligno. Este fue leído como que contiene un área de necrosis coagulativa con la inflamación aguda y focos de células marcadamente atípicos junto con mitosis prominente y la apoptosis. Algunos campos contenían células gigantes multinucleadas tumor generalmente indicativos de neoplasia de alto grado (D) Las células co-inyectados con colágeno I demuestra un patrón de crecimiento maligno similares a los ilustrados en los paneles A y C. Todas las imágenes son a 400X.
células JB-V co-inyectados con Matrigel y etiquetados para Ki67 (a) y vimentina (C). células JB-V co-inyectados con SISgel y en el fenotipo suprimido etiquetado para Ki67 (B) y vimentina (D). Controles omitiendo el anticuerpo primario (no mostrado) eran completamente negativas para ambos marcadores. Imágenes de 200X.
gráficos de Kaplan-Meier de los datos se muestran en la Fig. 5A con un punto final de iniciar el crecimiento del tumor; es decir, en este caso de "supervivencia" se cuenta como la supervivencia de un fenotipo suprimido. Debido a que todos los experimentos contenían los controles positivos de Matrigel con los mismos números de células en las mismas proporciones que se utilizaron para SISgel, Fig. 5A combina los experimentos con diferentes números de células. Cuando se co-inyectados con Matrigel, las células se desarrollaron en tumores dentro de los 30 días en 100% de los animales, incluso con tan poco como 250.000 células. Con SISgel, esto claramente no era el caso, y sólo alrededor del 40% de los animales con el tiempo desarrolló tumores en crecimiento con un retraso de entre cuatro y hasta 18 semanas. La diferencia en el comportamiento entre las células co-inyectados con Matrigel y SISgel fue estadísticamente muy significativa (p & lt; 0,0001). Un total de 70 xenoinjertos se prepararon a partir SISgel. De los 60% de los animales en los que no desarrollaron tumor, muchas de las células implantadas se mantuvo como una mancha fluorescente verde, aunque en algunos casos el punto ya no era discernible por varias semanas. En dos xenoinjertos en el que las células implantadas aparentemente habían desaparecido, tumores reaparecieron en un animal a las 12 semanas después de la inyección inicial, mientras que en otro animal un tumor en crecimiento se estaba formando claramente por 15-16 semanas. A pesar de que al menos 95% de las células eran fluorescente cuando se prepara, en dos casos, los tumores re-emergentes no pudieron expresar GFP como se muestra por el examen macroscópico, y en otra, el examen macroscópico mostraron un mosaico de células fluorescentes y no fluorescentes. La reaparición del fenotipo maligno depende de número de células, con más tumores más probable que ocurra cuando se inyectan más de 3 millones de células que cuando se inyectaron menos de 3 millones de células (p & lt; 0,0001) (Fig 5B.). No se encontraron diferencias discernibles en el comportamiento de las células J82 JB-V y (valores de p de las curvas de supervivencia fueron todos superiores a 0,2), aunque las células JB-V habían sido seleccionados para ser altamente metastásico y crecer preferentemente en la vejiga [ ,,,0],16].
(A) vs SISgel Matrigel. (B) Tres o más millones de células implantadas frente a menos de tres millones de células.
También probó si el gel co-inyectados con las células tumorales fue dominante sobre el fenotipo de las células cancerosas alcanzado en la cultura. La Tabla 1 resume el crecimiento de tumores de acuerdo con la ECM en los que se hicieron crecer en cultivo, así como los que se co-inyectaron ECM en el flanco con las células tumorales después de un crecimiento en ECM en cultivo. El ECM co-inyectan en animales con las células tumorales de la vejiga regirá si los tumores formados, y el fenotipo establecido por ECM en la que las células fueron cultivadas fue superada por el ECM co-inyectado. Como era de esperar, las células que fueron co-inyectados con Matrigel uniformemente formaron tumores en crecimiento, independientemente de la forma en que habían sido cultivadas en cultivo. Co-inyección con SISgel suprime las células del cáncer de vejiga que había estado creciendo activamente y expresar completamente el fenotipo maligno en Matrigel
in vitro.
Curiosamente, las células cultivadas en Matrigel y co-inyectados con medio de cultivo por sí solo no era capaz de tumor formación, apoyando además que la matriz local es más importante que el fenotipo de las células en el momento en que fueron inyectados. No hay diferencia en el tamaño, la tasa de crecimiento o la apariencia bruta fue detectable entre los tumores formados a partir de células que habían sido cultivadas en el fenotipo supresor sobre SISgel pero se co-inyectados con Matrigel en comparación con células que habían sido cultivadas en Matrigel o de plástico y fueron co- inyectado con Matrigel.
Debido a que el componente principal de SISgel es el colágeno I [17], también las células J82 que habían sido cultivadas en plástico con colágeno I. en contraste con SISgel co-inyectado, colágeno I los tumores crecieron rápidamente; y en ocho de 12 animales en tres experimentos diferentes tumores crecieron dentro del plazo establecido para Matrigel. En estos mismos experimentos ninguno de 12 animales co-inyectados con SISgel desarrollado tumores. La diferencia entre las células co-inyectados con colágeno y SISgel fue altamente significativa (p = 0,0013), pero la diferencia entre las células co-inyectados con colágeno y Matrigel no lo fue (p & gt; 0,05).
También investigamos el mecanismo para la supresión mediante la comparación de la expresión génica y de expresión de proteínas perfiles de las células cultivadas en SISgel con las mismas células cultivadas en Matrigel. Los estudios de microarrays fueron esencialmente informativo, lo que sugiere que el fenómeno de la supresión no está regulada a nivel de la expresión génica. A pesar de que 243 genes fueron expresados diferencialmente entre células J82 cultivadas en SISgel vs. Matrigel y 214 fueron expresados diferencialmente por las células JBV cultivadas bajo las mismas condiciones, había muy poca superposición. Sólo 11 genes eran comunes a las dos listas, y ninguno fue consistentemente expresadas diferencialmente a través de matrices en la misma dirección por ambas líneas celulares. El examen de las ontologías de los conjuntos de genes mostró que el conjunto de genes expresados diferencialmente por las dos líneas de células cultivadas en Matrigel o SISgel eran diferentes ontologías. Llegamos a la conclusión de que la falta de una expresión genética consistente entre diferentes líneas celulares cultivadas en diferentes preparación de matriz indica que las diferencias fenotípicas obvias deben ser el resultado de la expresión diferencial en el nivel de proteína en lugar de en el nivel de expresión del gen de la regulación.
análisis de fase inversa de la proteína de matriz de proteínas (RPPA) para 250 proteínas de señalización clave identificó (Fig. 6A) una firma consistente a través de todas las 4 líneas celulares. análisis de la vía por el IPA usando los nombres de genes mostró los siguientes fueron altamente involucrados de manera significativa. PI3K /AKT señalización (p = 1,00 × 10
-8, mTOR, GSK3A, GSK3B, TNNB1, EIF4E), receptor de la insulina de señalización (p = 1,70 × 10
-8 BRAF, RB1, mTOR, GSK3B, CTNNB1 ) y CIC señalización (p = 9,12 × 10
-8 mTOR, IRS1, GSK3A, GSK3B, CTNNB1). El papel funcional de la ILK se confirmó usando un inhibidor de molécula pequeña de la ILK, que mostró que la inhibición de la ILK en células J82 cultivadas en Matrigel produce un fenotipo invasivo muy similar a la observada cuando las células se cultivaron en SISgel como se muestra en la Fig. 7. El fenotipo típico-tumor invasivo como se ve en la Fig. 7A con células J82 cultivadas en Matrigel. En contraste, el fenotipo invasivo es abolida cuando se añade 10 QLT0267 mu M al medio de cultivo de las células cultivadas en Matrigel (Fig. 7B). El fenotipo es similar a la observada cuando las células se cultivan en SISgel (Fig. 1), excepto que se forman múltiples capas.
El símbolo (V) indica el anticuerpo se validó para mostrar una sola banda por Western mancha. Una "P" indica que el anticuerpo se dirige contra una forma fosforilada de la proteína, con la posición de aminoácidos y la identidad proporcionada. Las dos entradas de mTOR representan duplicados. Una lista completa de los anticuerpos utilizados en el momento del análisis se ofrece como el cuadro S1.
J82 células cultivadas en Matrigel durante cinco días sin inhibidor de ILK (arriba) o con 10 mM QLT0267 inhibidor de ILK (panel inferior). Nota supresión de la invasión. Todos los aumentos son 200X. Las imágenes son representativos de 3 experimentos.
Discusión
Cuando una célula cancerosa adquiere el requisito permitiendo mutaciones cancerígenas metastásicas o unos escapes de células de la circulación no deja de ser en un entorno normal que no es permisiva del crecimiento del tumor debido a múltiples controles redundantes que funcionan para diferenciar e inhibir la replicación de las células epiteliales [1], [2], [7]. Escape de estos controles normales probablemente representa el primer paso, comprometidos en la formación de primaria, localmente recurrente, y los tumores metastásicos. Proponemos que el modelo de cultivo presentada anteriormente [14] y el modelo de xenoinjerto de que aquí se presenta representar un nuevo modelo para la investigación de los fenómenos importantes de la supresión de la malignidad y la inactividad, y para la identificación de nuevas terapias para atacar la metástasis y la recurrencia a su punto más vulnerable.
Este modelo capta varios elementos esenciales de la represión y la reactivación que se observa clínicamente. El fenotipo maligno de las líneas celulares de cáncer de vejiga es suprimida por SISgel
in vitro
, y
in vivo
cuando se implanta con SISgel en xenoinjertos de flanco. No sólo las células co-inyectados con SISgel no crecen inmediatamente como tumores (Fig. 2), pero histopatológicamente son sustancialmente normalizada sobre el fenotipo de crecimiento activo (Fig. 3B vs Figs. 3A, C y D). Por otra parte, la mayoría de las células no están en el ciclo celular y la expresión de vimentina se reduce considerablemente en lo que se ve en los tumores en crecimiento activo (Fig. 4). Esto no es sólo un efecto de crecimiento supresor generalizado de SISgel porque los estudios anteriores mostraron que las células cancerosas sembradas sobre SISgel tienen aproximadamente la misma tasa de proliferación como en Matrigel, y sólo a medida que comienzan a llegar a la confluencia ocurre con la tasa de proliferación lenta drásticamente [13 ]. Las células co-inyectados con SISgel pueden permanecer reprimidos durante semanas o incluso meses, mucho después de que se absorba el SISgel, sólo para emerger como tumores en crecimiento, como ocurrió con el 40% de los implantes con SISgel. En el 60% restante, las células permanecieron viables, ya sea como una mancha fluorescente verde o desaparecieron por completo. Tres observaciones sugieren que la reaparición de un tumor se debe a una pequeña población de células en lugar de a la población mayor. En primer lugar, re-emergencia se correlacionó positivamente con el número de células implantadas (Fig. 5B). En segundo lugar, en dos casos las células cancerosas humanas GFP-etiquetados aparentemente desaparecieron, pero en una fecha posterior después de la inyección inicial el punto reaparecieron y crecieron en un tumor. Por último, dos tumores re-emergentes no pudieron expresar GFP, y uno era un mosaico de células que expresan GFP y no expresan. Debido a que al menos el 90-95% de las células inyectadas expresó GPF, los findins sugieren los tumores re-emergentes derivan clonalmente o de un número muy pequeño de células que, o bien su eliminación con experiencia del gen de GFP a partir de su posición de inserción en el genoma o nunca adquirida uno inicialmente. En contraste, el crecimiento del tumor inmediata, rápida en Matrigel sugiere la supervivencia y el crecimiento de las células a granel en estas condiciones permisivas y es inherente a una fracción significativa de las células inyectadas.
Aunque otros mecanismos pueden estar implicados en la producción de latencia o supresión [4], [5], [18] - [21], el paso comprometido parece estar escapar de la ECM de supresión normal [7], [22]. Los resultados confirman nuestra hipótesis previa de que el ECM ejerce un efecto supresor
in vivo
basado en la pérdida de propiedades malignas en SISgel
in vitro
[23]. El efecto supresor de SISgel no se debe a la proteína dominante, colágeno I, o a la ausencia de algún factor en SISgel necesario para adulto maligno porque los tumores formados con colágeno co-inyectados I crecieron casi tan bien a medida que crecían cuando se co-inyectados con Matrigel . Supresión por SISgel parece ser activo, no pasivo, en que algún factor en la matriz extracelular normal, suprime activamente el fenotipo maligno, tal como se sugirió hace más de 15 años por Renato Iozzo [1]. La investigación anterior en nuestros laboratorios sugiere que, a diferencia de las células epiteliales mamarias, α6β4 integrinas no estaban involucrados [24]. Microarrays y estudios proteómicos implicados redes complejas que incluyen TGF, cMYC y una serie de factores de transcripción [23], [25], [26]. Debido a que una firma genética coherente no pudo ser identificado, es probable que un interruptor de proteína regula la conversión entre los fenotipos malignos y suprimidas. Los resultados sugieren que la señalización RPPA CIC está involucrado, que es apoyado por el hallazgo de que la inhibición de la ILK en sí impide la invasión. Se necesitan investigaciones adicionales para identificar el receptor y los mecanismos de señalización detalladas.
A pesar de que el fenómeno de la supresión de tumores malignos está más obviamente relacionado con la metástasis, las células cancerosas fenotípicamente suprimidas probable que también juegan un papel importante en la recidiva local. Aunque algunos 80-85% de los cánceres de vejiga no son inicialmente músculo invasivo, la tasa de recidiva local, hasta el 70% en algunos estudios [27], con un poco de 15 a 25% de progresar a la enfermedad invasiva muscular mortal [27] crea un importante clínica problema. Las recurrencias de cicatrices en los márgenes no estaban libres de tumor es más probable debido a la falta de detección de células tumorales francas en la evaluación histopatológica original, sino que es el resultado de la promoción de las células suprimidas por el microambiente de la cicatriz [28]. Además, la búsqueda de células con contenido de ADN y la expresión aberrante de biomarcadores en el urotelio morfológicamente normales [8] en pacientes con cáncer de vejiga apoya firmemente la hipótesis de que ECM-modula la supresión del fenotipo maligno se desarrolla
in vivo
. La identificación y el seguimiento de estas células podría proporcionar un importante avance en la terapia del cáncer de vejiga. Resultados similares en la cabeza y el cuello carcinomas de células escamosas sugieren que el problema puede ser más general [9].
Mientras que la supresión de tumores malignos por ECM normal de probabilidades en general, funciona y es de importancia para la biopatología del cáncer de vejiga humana, la comprensión el mecanismo de supresión puede identificar nuevas dianas para el control no sólo de cáncer de vejiga, pero otros tipos de tumores con micrometástasis retardados o recurrencia local. Tanto el
in vitro
y
in vivo
modelos presentados aquí puede ser muy útil en la identificación de estos mecanismos y en la provisión de modelos manejables para la identificación de nuevos fármacos a las células diana cancerosas suprimidas por la matriz extracelular normal. La prevención de la metástasis tardía podría salvar miles de vidas al año.
Materiales y Métodos
Fluorescent Protein expresan las células del cáncer de vejiga
La línea celular JB-V se deriva de la TCC J253 línea (ATCC, Manassas, VA) por C. Dinney [16] sea altamente metastásico. La línea J82 es una línea agresiva TCC obtenida de la ATCC. Las células fueron transfectadas con pLEGFP C1-retrovirus (Clontech, Mountain View, CA) preparado por co-transfección de la línea celular de empaquetamiento GP2-293 (Clontech, Mountain View, CA) con el vector pVSV-G (Clontech, Mountain View, CA ) que contiene un gen de la envoltura viral. El sobrenadante de las células de empaquetamiento que contienen el virus infeccioso se recogió cada 24 horas durante 4 días. células diana fluorescentes se hicieron mediante la infección de líneas de células uroteliales J82 de carcinoma de células de transición con 1 ml de sobrenadante fresco que contiene el virus /pocillo que contenía 100.000 células diana junto con 8 g /ml de polibreno (Sigma Aldrich, St. Louis JB-V y, MES). Cada aplicación de sobrenadante viral se filtró a través de un filtro de 0,4 micras jeringa antes de la aplicación a las células diana. Se eliminó el sobrenadante y los medios que contienen virus frescas repone en las células diana cada 24 horas hasta que se completaron 4 cambios de medios de comunicación. medio que contenía virus se reemplazó con medio esencial mínimo, MEM, (Life Technologies, Carlsbad, CA) que contiene 1% de ácidos no esenciales aminoácidos, 1% de L-glutamina, piruvato de sodio 1% y suero de ternera fetal 10%, y las células se les permitió crecer hasta 90% de confluencia. transfecta estables fueron seleccionados a través de clasificación secuencial y el enriquecimiento de células fluorescentes utilizando citometría de flujo.
crecimiento de células en ECM
matrices de gel se hicieron por capas o bien 0,8 ml de hielo frío Matrigel (Becton-Dickinson , Bedford, MA), SISgel, o colágeno de tipo I (BD Biosciences, San Jose, CA) a membranas de tereftalato de polietileno de insertos de 6 pocillos de cultivo celular (Falcon, Becton-Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ), que luego se les permitió a gel a 37 ° C. SISgel se preparó bien por solubilizado submucosa del intestino delgado proporcionada a nosotros por Cook Biotech (West Lafayette, IN) o por el material nos hemos preparado a partir descelularizado submucosa del intestino delgado utilizando técnicas establecidas [29]. Brevemente, planta SIS se digirió parcialmente con pepsina a pH 2,8 a 4 ° C durante 12 días. Esto representa una optimización; demasiado poco la digestión y las formas materiales coágulos en lugar de gelificación, y la digestión excesiva produce material que no lo hará en gel. La pepsina se inactivó elevando el pH a 10 e incubando el gel a 4 ° C durante 2 horas, seguido por reducción del pH a 4 con HCl 6 N. El producto se dializó frente a HCl 10 mM y se esterilizó con CHCl
3, que después se dializó en contra de HCl 10 mM. Para formar un gel, el material se mezcló con 1/10
TH volumen de 10 veces de solución salina tamponada con fosfato y una pequeña cantidad de rojo de fenol para ayudar con el ajuste del pH. El pH se ajustó a 7,4 con NaOH 1 M estéril utilizando un estándar de color visual que se comprueba con un medidor de pH. geles de colágeno se prepararon mezclando colágeno de cola de rata, de tipo I con 1/10
TH volumen de 10X PBS, ajustando el pH a 7,4 ± 0,1, y luego capas de 0,8 ml en transwell insertos como se describe anteriormente. Las células se dispusieron en capas sobre cualquiera de Matrigel, SISgel o colágeno a una concentración de 5 × 10
5 células /200 medios de comunicación l, y 2 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Life Technologies, Carlsbad, CA) que contiene 1% de penicilina, estreptomicina y suero de ternero fetal al 10% se dispusieron en capas por debajo de la transwell apoya en placas de 6 pocillos como se describe [14]. Los cultivos se desarrollaron durante 6 días con cambios de medio cada dos días. Los cultivos se eliminan de los cultivos polarizados, fijados en formalina al 1% después de la superposición de agarosa o con SISgel para evitar la pérdida de células en el corte de secciones. Secciones (5 m) se tiñeron con hematoxilina y eosina. (http://www.affymetrix.com/browse/level_seven_software_products_only.jsp?productId=131414&categoryId=35623#)