Extracto
La selección de "conductor" oncogénico quinasas con inhibidores de molécula pequeña ha demostrado ser una estrategia terapéutica muy eficaz en cáncer seleccionado de pulmón no microcítico (CPNM) de los pacientes. Sin embargo, la resistencia adquirida a las terapias dirigidas invariablemente surge y es una importante limitación para el cuidado del paciente. proteínas de fusión ROS1 son una clase recientemente descrita de conductor oncogénico, y los pacientes de NSCLC que expresan estas fusiones generalmente responden bien a la terapia dirigida-ROS1. En este estudio, hemos tratado de determinar los mecanismos de resistencia adquirida a la inhibición ROS1. Para lograr esto, se analizaron muestras de tumor de un paciente que inicialmente respondió al crizotinib inhibidor ROS1 pero eventualmente desarrolló resistencia adquirida. Además, hemos generado un derivado resistente a la inhibición ROS1 de la línea celular inicialmente sensibles HCC78 NSCLC. descrito anteriormente mecanismos de resistencia adquirida a los inhibidores de la tirosina quinasa, incluyendo objetivo quinasa dominio de la mutación, el aumento de número de copias de la diana, la transición epitelio-mesenquimal, y la conversión a histología del cáncer de pulmón de células resultaron no ser la base de la resistencia en la muestra del paciente o una línea celular resistente. Sin embargo, sí observamos un cambio en el control del crecimiento y la supervivencia de las vías de señalización del EGFR en ROS1 a la línea celular resistente. Como resultado de este interruptor, las células HCC78 inhibición resistente ROS1 se convirtieron en sensibles a la inhibición de EGFR, un efecto que fue mejorada por co-tratamiento con un inhibidor ROS1. Nuestros resultados sugieren que la co-inhibición de ROS1 y EGFR puede ser una estrategia eficaz para combatir la resistencia a la terapia dirigida en algunos pacientes con CPNM fusión positivo ROS1
Visto:. Davies KD, Mahale S, Astling DP, Aisner DL , Le AT, Hinz los conocimientos tradicionales, et al. (2013) La resistencia a ROS1 la inhibición mediada por EGFR vía de activación de células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (12): e82236. doi: 10.1371 /journal.pone.0082236
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Junio, 2013; Aceptado: 22 Octubre 2013; Publicado: 13 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Davies et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos de investigación de la Sociedad del cáncer de Colorado para KD Davies, el Premio de la Fundación Boettcher Webb-Waring de Investigación Biomédica de R. C. Doebele, y la Universidad de Colorado subvención del cáncer de pulmón de esporas (P50CA058187) a M. Varella-García y R. C. Doebele. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos o análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. D. L. Aisner ha recibido honorarios de Abbott Molecular. PENSILVANIA. Bunn Jr. ha recibido honorarios por asesoramiento de Pfizer, Novartis, Genentech /Roche, AstraZeneca, Boehringer Ingelheim, Astellas, y GlaxoSmithKline. DR. Camidge ha recibido honorarios de la junta asesora de Pfizer. R. C. Doebele ha recibido financiación de la investigación, los honorarios de consultoría, y los honorarios de la junta asesora de Pfizer, honorarios de Abbott Molecular, honorarios de consultoría y honorarios de la junta asesora de Boehringer Ingelheim, fondos de investigación de ImClone, y la financiación de la investigación de Eli Lilly. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de pulmón, de los cuales aproximadamente el 80-85% puede ser categorizado como no microcítico cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer en el mundo [1]. Recientemente, se ha puesto de manifiesto que el CPCNP es una enfermedad heterogénea que puede subdividirse en gran medida basada en las alteraciones genéticas que crean los oncogenes dominantes del controlador [2]. células tumorales de NSCLC son a menudo 'adictos' a estos oncogenes activados, tales que la inhibición de sus bloques de la actividad proliferativa y la señalización celular favor de la supervivencia, en última instancia conduce a la detención del crecimiento y /o muerte celular. Es importante destacar que muchos de los conductores oncogénicos descubiertos hasta la fecha son las quinasas que pueden ser objetivo de los inhibidores de molécula pequeña activa. Gefitinib y erlotinib tratamiento de pacientes con CPNM que albergan
EGFR
mutaciones activadoras y crizotinib tratamiento de pacientes con CPNM que alberga la activación de
ALK
reordenamientos son ejemplos exitosos de esta estrategia [3], [4]. El tratamiento con estos fármacos inhibidores de la quinasa resultado una mejora en la eficacia y tiene efectos secundarios más tolerables en comparación con la quimioterapia estándar en pacientes que están pre-seleccionados para las alteraciones genéticas que activan [5], [6], [7].
a pesar de la eficacia inicial de gefitinib, erlotinib, y crizotinib en pacientes con CPNM seleccionados, la resistencia adquirida invariablemente surge, por lo general en menos de un año. A nivel celular, esta resistencia se produce por varios mecanismos. El primero de ellos es la mutación del dominio quinasa diana que reduce la capacidad del fármaco para inhibir la quinasa. Por ejemplo, la mutación T790M, denominada la mutación 'gatekeeper', reduce la capacidad de los inhibidores de EGFR a outcompete unión a EGFR ATP [8]. Esta mutación (junto con otras mutaciones asociadas a la resistencia mucho menos frecuentes) se encuentra en los modelos de líneas celulares de resistencia y en aproximadamente el 50% de los pacientes que desarrollan resistencia adquirida a los inhibidores del EGFR [9], [10], [11]. La posición gatekeeper análoga en ALK, L1196, se encuentra de manera similar a ser mutado en el cáncer de pulmón de fusión-positivo ALK en el momento de resistencia a la crizotinib y en modelos de líneas de células resistentes, así como varios otros aminoácidos para la que la mutación también reduce la capacidad de el medicamento para inhibir la quinasa [12], [13], [14], [15], [16]. El segundo mecanismo de resistencia es la amplificación de la quinasa diana. En teoría, un aumento en la cantidad de quinasa que se expresa por la célula puede reducir la capacidad del fármaco para saturar el objetivo. La amplificación de
ALK
fusiones se ha demostrado en las células y los pacientes resistentes que han desarrollado resistencia [13], [14], [16]. Además, la amplificación de
EGFR
se ha correlacionado con la resistencia en
EGFR
cáncer de pulmón mutante, aunque en la mayoría de los casos el alelo amplificado alberga la mutación T790M [17], [18]. Otro mecanismo importante de la resistencia es la activación de los componentes de señalización alternativos. En este caso, las proteínas que son o aguas abajo de esa función en paralelo a la quinasa diana se activan y subvertir la dependencia de la quinasa diana para estimular exclusivamente proliferativa y de señalización pro-supervivencia. MET, PI3K, BRAF, IGF-1R, FGFR1, MEK, y 2 de activación /ERK1 han sido observados en resistentes a los inhibidores
EGFR
enfermedad mutante y /o modelos de línea celular de EGFR [18], [19] , [20], [21], [22], [23], [24]. La activación o la amplificación de EGFR, KRAS, y de manera similar KIT se han observado en el crizotinib resistente
ALK
pacientes reordenados y líneas celulares [14], [15], [16], [25]. Además, un estudio reciente ha demostrado que la exposición a factores de crecimiento comunes es suficiente para inducir resistencia a las terapias dirigidas en líneas celulares de cáncer a partir de una variedad de orígenes genéticos, y este efecto se correlacionó con un rescate de AKT inducida por fármacos y ERK inactivación [26]. Finalmente, los cambios histológicos y morfológicos han demostrado que se correlaciona con la resistencia. En concreto, la conversión a la histología del cáncer de pulmón de células pequeñas y la transición epitelio-mesenquimal (EMT) se han observado en
EGFR
pacientes mutantes y líneas celulares resistentes a los inhibidores de EGFR [11], [18]. Las bases mecanicistas detrás de estos cambios no se entienden completamente.
ROS1
es un receptor tirosina quinasa que está estrechamente relacionado con
ALK
, y, como
ALK
, que sufre un reordenamiento genómico que crea proteínas de fusión en NSCLC y otros tipos de cáncer [27]. Está bien establecido que estas proteínas de fusión actúan como conductores oncogénicos y que la inhibición ROS1 es anti-proliferativa en las células que expresan fusiones ROS1 [28]. Además, el crizotinib, que tiene actividad contra ROS1, está demostrando su eficacia en
de fusión positivo ROS1
pacientes con CPNM en un ensayo de fase I [29]. Por lo tanto, teniendo en cuenta el éxito de crizotinib en
ALK-positivo sobre Fusion NSCLC, parece que ROS1 terapia dirigida es probable que pronto será el estándar de atención para esta población de pacientes. Sin embargo, en base a las experiencias con otros inhibidores de la quinasa en el cáncer de pulmón, se tiene plena confianza de que se produzca resistencia adquirida a la inhibición ROS1, y esto en última instancia, limitar las opciones de tratamiento para estos pacientes. En apoyo de esto, un estudio reciente informó de un caso clínico de un paciente
ROS1
reordenamiento-positivo que desarrolló resistencia al crizotinib después de una respuesta inicial [30]. Se encontró que el paciente que ha sufrido una mutación en el
ROS1
dominio quinasa que interfería con las drogas vinculante [30]. En este estudio, hemos tratado de determinar los mecanismos de resistencia a la inhibición ROS1. Esto se logró a partir de muestras clínicas de un paciente que se hizo resistente al crizotinib y un derivado de la inhibición resistente ROS1 de la
ROS1
línea celular de NSCLC reordenado HCC78.
Resultados
ya se ha informado de la identificación de un paciente NSCLC que expresa el
SDC4-ROS1 sobre fusion y el éxito del tratamiento de este paciente con crizotinib [28]. El paciente experimentó 57% la reducción del tumor después de dos ciclos de tratamiento de 28 días. Sin embargo, a pesar del tratamiento continuo, se descubrió evidencia de progresión de la enfermedad aproximadamente 18 semanas después del inicio del tratamiento. En este momento, se tomó una biopsia por escisión del tumor progresa. secuenciación selectiva de esta muestra de biopsia resistentes reveló que, de forma similar a la biopsia pre-tratamiento, la totalidad de
ROS1
dominio quinasa era de tipo salvaje (WT), significado que
ROS1
mutación del dominio quinasa se no el mecanismo de resistencia (Tabla 1). El análisis también indicó Snapshot estado de WT de residuos frecuentemente mutados en varios otros oncogenes conocidos (incluyendo
EGFR
,
KRAS
, y
BRAF
) tanto en el pre-tratamiento y post muestras de resistencia a (Tabla 1). A continuación, examinó el aumento de número de copias del gen de fusión
ROS1
como un mecanismo potencial de resistencia. Esto se logró usando fluorescencia
hibridación in situ
(FISH) con sondas a ambas las regiones 5 'y 3' del gen. La "señal media solo 3 (representante del gen de fusión) por célula tumoral fue de 1,7 en la muestra pre-tratamiento y 1,82 en la muestra posterior a la resistencia, una diferencia no significativa (Figura 1A). Este hallazgo sugiere que el aumento de número de copia no era el mecanismo de resistencia en el tumor de este paciente. La muestra posterior a la resistencia sí reveló una pérdida de la señal individual 5 '; sin embargo esto no se espera que sea funcionalmente importantes (Figura 1A). Verificamos que el gen de fusión se estaba expresando en el momento de resistencia, y que la relación de largo (
SDC4
exón 2 fusionado a
ROS1
exón 32 (SD2; R32)) a corto (
SDC4
exón 2 fusionado a
ROS1
exón 34 (SD2; R34)) variantes fue similar a la muestra pre-tratamiento (Figura 1B). el examen morfológico de la pieza tomadas en resistencia demostró células epitelioides rollizos con una gran relación entre núcleo y citoplasma, nucleolos prominentes y citoplasma eosinófilo, similar a la biopsia de pre-tratamiento (Figura 1C). Estos resultados sugirieron que no se había producido la transformación de células pequeñas. Por último, como spindling celular, no se observó ninguna evidencia morfológica de EMT, y la biopsia tomada en la resistencia demostró tinción inmunohistoquímica negativa para vimentina, un marcador de EMT (Figura S1). La falta de evidencia de estos mecanismos de resistencia comunes era sugestivo de la regulación positiva de la señalización alterativa como el mecanismo subyacente de la resistencia al crizotinib en este paciente
.
(A) Pre-tratamiento y post-resistencia muestras de pacientes analizados por desglose prueba FISH separados por
ROS1
. sondas rojas son de 'región de ROS1 y sondas verde al extremo 3' de la región 5. Los valores representan la media del número de señales por célula. La "señal solo 3 (valores subrayados) es indicativo de la
ROS1
número de copias del gen de fusión. (B) RT-PCR, usando cebadores de
SDC4
y
ROS1 Windows que abarcan el punto de fusión, realizada en pre-tratamiento y post-muestras tumorales de resistencia. SD2; R32 es la variante "largo" (fusión de
SDC4
exón 2 a
ROS1
exón 32) y SD2; R34 es la variante "corta" (fusión de
SDC4
exón 2 a
ROS1
exón 34). (C) Hematoxilina y eosina tinción de muestras de pacientes de pre-tratamiento y post-resistencia.
Con el fin de crear un modelo de línea celular de la resistencia a la inhibición ROS1, hemos tratado crónicamente el
Slc34a2-ROS1
expresar NSCLC HCC78 línea celular con concentraciones crecientes del inhibidor TAE684 ROS1. Este método ha sido utilizado anteriormente para crear modelos resistentes para ambos inhibidores de EGFR en
EGFR
células mutantes y crizotinib en
ALK
células reordenados, y los mecanismos observados en estos modelos han correlacionado con lo que se observa en pacientes [13], [15], [19]. Se optó por utilizar TAE684 (un compuesto no clínica) sobre el crizotinib (un fármaco con actividad clínica contra ROS1) porque crizotinib tiene un relativamente alto CI
50 en HCC78 células y sólo en muy estrechas ventanas salidas entre el CI
50 y fuera de la meta actividades de la droga [28], [31]. En otras palabras, mediante el uso de TAE684 para hacer las células resistentes a la inhibición ROS1 en lugar de crizotinib, hemos sido capaces de garantizar una inhibición más completa de la proteína de fusión ROS1 a dosis que no presentaban fuera de objetivo efectos antiproliferativos. Después de 4 meses de cultivo en concentraciones crecientes, el derivado resistente de la línea HCC78, que hemos denominado HCC78-TR, fue capaz de proliferar normalmente en 500 nM TAE684. Los primeros intentos de aumentar la dosis en cultivo eran más éxito, por lo que 500 nM se consideró un máximo y las células se cultivaron de forma continua en esta concentración de fármaco. Cuando la sensibilidad de estas células a TAE684 se analizó en ensayos de proliferación, se determinó que el IC
50 de TAE684 fue mayor que 1 M (Figura 2A). Esto es similar a otras líneas celulares de cáncer que no contienen ALK o fusiones ROS1 (H322 y HCC4006), lo que sugiere que los efectos antiproliferativos de esta gama son probablemente debido a las actividades fuera de objetivo. células HCC78-TR eran también menos sensibles a crizotinib, y de nuevo, el nivel de sensibilidad fue más similar a las células que no expresan ALK o fusiones ROS1 (Figura 2B). Sin embargo, la desensibilización es específica a la inhibición ROS1, como las células HCC78-TR retienen su sensibilidad a pemetrexed, una quimioterapia aprobado por la FDA para el cáncer de pulmón no escamosas (Figura 2C). La resistencia a la inhibición ROS1 no era dependiente de la cultivo continuo en presencia de 500 nM TAE684, porque las células que se tomaron de drogas se mantuvo resistente para hasta 6 meses y 47 pasajes (Figura S2).
Células fueron tratados con TAE684 (a), crizotinib (B), o pemetrexed (C) como agentes únicos-durante 3 días y después se analizaron mediante el ensayo de MTS. Los valores representan la media ± SEM (n = 3-7). Calculado IC
50 valores para TAE684: HCC78 parental = 0,14 M, HCC78-TR = 1,09 m, H322 = 1,42 m, y HCC4006 = 1,15 M. Calculados IC
50 valores para crizotinib: HCC78 parental = 0,79 m, HCC78-TR = 1,95 m, H322 = 4.13 m, y HCC4006 = 3,03 m. Calculado IC
50 valores de pemetrexed: HCC78 parental = 11 nM y HCC78-TR = 14 nM. células HCC78-TR fueron significativamente menos sensibles que las células HCC78 parentales para TAE684 (p & lt; 0,000005) y crizotinib (p & lt; 0,05), pero no pemetrexed (p & gt; 0,05). tal como se determina por la prueba t de Student pareada
la secuenciación del HCC78 parental y las células HCC78-TR indicó que el dominio quinasa de
ROS1
era WT para ambas líneas, lo que sugiere que
ROS1
mutación no era responsable de la resistencia a la inhibición ROS1 (Tabla 1).
EGFR
,
KRAS
, y
BRAF
también resultaron ser WT en ambas líneas celulares (Tabla 1). análisis FISH demostró que las células HCC78-TR perdieron 1 copia del gen de fusión
ROS1
en comparación con la línea parental (1 copia vs. 2 copias, respectivamente), lo que sugiere que el aumento de número de copias del gen de fusión se no el mecanismo de resistencia (Figura 3A). Como resultado de la pérdida genómica de 1 copia del gen de fusión, menos
Slc34a2-ROS1
mRNA se expresó en las células HCC78-TR (figura S3). Aunque el significado de la expresión del gen de fusión reducido está claro, la expresión de una proteína de fusión ROS1 activado (SDC4-ROS1) forzado en las células HCC78-TR no re-sensibilizar a TAE684 (Figura S4). Aproximadamente el 40% de las células HCC78-TR muestra un aumento en el número de copias de la región 5 'de
ROS1
(de 2 a 4 copias de copias), aunque esto no se espera que sea funcionalmente significativo como el 5 'región no exhibe actividad quinasa (Figura 3A). Además, la morfología de las células HCC78-TR no difirió visualmente a partir de la de la línea parental HCC78, lo que sugiere que la conversión a un pequeño morfología cáncer pulmonar de células no se produjo (Figura 3B). Por la cuantificación de ARNm,
CDH1
niveles fueron similares entre las dos líneas celulares y
VIM
niveles se redujeron de 3 veces en la línea HCC78-TR (Figura S5). Estos resultados sugieren que EMT no era el mecanismo de resistencia. Por último, no se observó un aumento significativo en la expresión del ARNm de cualquiera de los que unen ATP genes de la familia de cassette transporter en las células HCC78-TR, lo que sugiere que el flujo de salida de medicamentos mejorada más probable es que no tomaron en cuenta para la resistencia a la inhibición ROS1 (Tabla S1). células
(a) HCC78 parental y HCC78-TR analizados mediante el ensayo FISH ruptura separados por
ROS1
. sondas rojas son de 'región de ROS1 y sondas verde al extremo 3' de la región 5. Los valores representan el número de señales por célula. La "señal solo 3 (valores subrayados) es indicativo de la
ROS1
número de copias del gen de fusión. En la línea de HCC78-TR, dos poblaciones existían que difieren en función del número de 5 'señales detectadas. (B) representativos imágenes de campo claro de HCC78 de los padres y las células HCC78-TR.
A continuación, se le preguntó si la resistencia a la inhibición ROS1 podría ser debido a los cambios en la señalización celular aguas abajo. HCC78 Parental y células HCC78-TR fueron tratados con una dosis de gama de TAE684 durante 4 horas y a continuación, los lisados celulares se analizaron por Western blot. De manera similar a lo que hemos informado anteriormente, el tratamiento reduce TAE684 ROS1 autofosforilación y la activación de la fosforilación de SHP-2, AKT, y ERK1 /2 en las células HCC78 parentales (Figura 4A) [28]. Como se predijo a partir de la pérdida del número de copias del genoma de la
ROS1
gen de fusión y la expresión de mRNA reducido, las células HCC78-TR expresaron menos de la proteína de fusión de la línea parental y autofosforilación ROS1 no podía ser detectado. La reducción en la cantidad de proteína de fusión ROS1 correlacionado con una reducción en la fosforilación basal de SHP-2. Sin embargo, a pesar de la pérdida de proteína de fusión, los niveles basales de ERK1 /2 fosforilada eran similares a la línea parental y los niveles basales de AKT fosforilada fueron mayores que en la línea parental. Es importante destacar que, el tratamiento TAE684 no dio lugar a de-fosforilación de AKT o ERK1 /2 en las células resistentes. Se observaron resultados similares con el tratamiento con crizotinib (Figura 4B).
Las células se trataron con TAE684 (A) o crizotinib (B) durante 4 horas. Los lisados de las células se analizaron entonces mediante transferencia de Western usando los anticuerpos indicados.
La reducción en la cantidad de proteína de fusión expresada ROS1, la persistencia de AKT basal y la activación de ERK1 /2, y la falta de inhibición de AKT y ERK1 /2 por los inhibidores ROS1 sugirió que una vía de señalización alternativa se estaba activa en las células HCC78-TR. En un intento de identificar los componentes de la vía upregulated, se realizó dos experimentos de matriz fosfo-proteína: uno que examina los receptores tirosina quinasas (RTK) y uno que analizó quinasas aguas abajo (entre otras proteínas). Como hemos observado anteriormente, la línea parental HCC78 expresa EGFR fosforilado y MET cuando se examina con la matriz de fosfo-RTK (Figura 5A) [28]. La línea de HCC78-TR todavía expresa EGFR fosforilado, pero fosfo-MET se redujo significativamente (Figura 5A). No se observaron otras tirosina quinasas de receptores fosforilados de manera significativa. Como se predijo a partir del análisis de transferencia de western, AKT fosfo-S473 se incrementó en las células HCC78-TR en comparación con las células parentales, al igual que varios sitios de fosforilación de p53 (Figura 5A). Estas fueron las únicas diferencias observadas por matriz fosfo-proteínas.
(A) fosfo-RTK (arriba) y fosfo-quinasa (parte inferior) matriz de análisis realizados en HCC78 los padres no tratadas y células HCC78-TR. Las proteínas de interés están marcados. lugares no marcados en las esquinas de ambos conjuntos de matrices son el control positivo. (B) HCC78 HCC78 parental y de células-TR fueron tratados con TAE684, gefitinib, o una combinación de ambos durante 4 horas. Los lisados de las células se analizaron entonces mediante transferencia de Western usando los anticuerpos indicados. las células (C) HCC78 padres (P) y HCC78-TR (T) se dejaron sin tratar, se trataron con 1 uM gefitinib durante 4 horas, o se trataron con 100 ng /ml de EGF durante 10 minutos. Los lisados de las células se analizaron entonces mediante transferencia de Western usando los anticuerpos indicados.
Hemos demostrado anteriormente que la señalización de EGFR es parcialmente activo en la línea de HCC78 parental, como un efecto anti-proliferativo potente de TAE684 podría sólo puede lograrse con el co-tratamiento con el inhibidor de EGFR gefitinib [28]. Debido a las observaciones que el EGFR fue el RTK solamente significativamente fosforilada en la línea HCC78-TR, y que AKT, que comúnmente se activó aguas abajo del EGFR, era más fuertemente fosforilada en la línea HCC78-TR, la hipótesis de que tal vez la señalización del EGFR habían sido más comprometida en las células resistentes. Para probar esta hipótesis, se trataron HCC78 parental y las células HCC78-TR con 200 nM TAE684, 1 gefitinib mu M, o una combinación de ambos durante 4 horas. Una vez más, fosfo-AKT y fosfato ERK1 /2 eran sensibles al tratamiento TAE684 en la línea parental pero no la línea HCC78-TR (Figura 5B). Sin embargo, la situación se invirtió cuando estas líneas fueron tratados con gefitinib, con la señalización aguas abajo siendo sensibles en la línea HCC78-TR, pero no la línea parental (Figura 5B). Se observaron efectos similares con el químicamente distinto inhibidores de EGFR erlotinib, lapatinib, y afatinib, lo que sugiere que los efectos se deben a la inhibición del EGFR en-blanco (Figura S6). Por lo tanto, WT EGFR se había convertido en el conductor dominante de crecimiento y supervivencia vías de señalización en las células HCC78-TR. Este cambio en la señalización celular correlaciona con un aumento modesto en los niveles totales de EGFR en las células HCC78-TR en comparación con las células parentales HCC78 (Figura 5C). La autofosforilación de EGFR, como se determina por transferencia de western usando un cóctel de anticuerpos específicos del sitio de fosforilación, fue relativamente baja en ambas líneas celulares. Sin embargo, tras la estimulación con el ligando de EGFR EGF, la autofosforilación se aumentó y fue mayor en las células HCC78-TR (Figura 5C). la cuantificación de ARNm reveló que la mayoría de los ligandos de EGFR no fueron significativamente más expresan en las células HCC78-TR, con la excepción de NRG1 que muestra un aumento de 4 veces en los niveles de mRNA (Figura S7).
Debido al interruptor en el control del crecimiento y la supervivencia de las vías de señalización ROS1 a EGFR en las células HCC78-TR, la hipótesis de que la proliferación de estas células sería sensible a la inhibición del EGFR. Para probar esta hipótesis, se trataron células tanto HCC78 y HCC78-TR parentales con gefitinib como agente único en ensayos de proliferación. Como hemos informado anteriormente, gefitinib en concentraciones de hasta 5 mM, no afectó a la proliferación de células parentales HCC78 (Figura 6A) [28]. Sin embargo, el fármaco moderadamente inhibido la proliferación de HCC78-TR células (Figura 6A). Se observaron efectos similares con erlotinib (datos no mostrados). entonces la hipótesis de que, puesto que las células HCC78-TR todavía expresan algunos, aunque a niveles reducidos de la proteína de fusión ROS1, un efecto antiproliferativo completa inducida por gefitinib requeriría co-inhibición de ROS1. Para probar esta hipótesis, se trataron células HCC78-TR con un intervalo de dosis de gefitinib en combinación con 500 nM TAE684 (la concentración de fármaco que estas células fueron cultivadas en forma continua). La adición de 500 nM TAE684 no tuvo ningún efecto antiproliferativo por sí solo; sin embargo, se sensibilizó a las células a tratamiento gefitinib (Figura 6B). En estas condiciones, las células HCC78-TR no eran tan sensibles como la línea celular de NSCLC HCC827 que es accionado por E746_A750del EGFR. Esto se espera debido a la activación de mutaciones en EGFR mejorar su afinidad para EGFR inhibidores de quinasa [32]. Sin embargo, las células HCC78-TR eran tan o más sensible que las líneas de NSCLC que expresan EGFR WT H358 y H322, respectivamente (Figura 6B). Estas dos líneas celulares se han notificado a ser muy sensibles a gefitinib en comparación con otros WT EGFR que expresan líneas de NSCLC [33]. Es importante destacar que, en las células HCC78-TR, se observó actividad anti-proliferativa significativa a dosis clínicamente relevantes de gefitinib (~ 1 mM) cuando se combina con la inhibición ROS1 [34].
(A) HCC78 Parental y HCC78- células TR fueron tratados con gefitinib como un agente único para 3 días y después se analizaron mediante el ensayo de MTS. (B) HCC78 HCC78 parental y de células-TR fueron co-tratadas con 500 nM TAE684 y gefitinib, y HCC827, H322, H358 y las células se trataron con un solo agente gefitinib durante 3 días y después se analizaron mediante el ensayo de MTS. Calculado IC
50 valores: HCC78 los padres (por debajo del 50% con un solo agente TAE684), HCC78-TR = 0,86 M, HCC827 = 0,04 M, H322 = & gt; 5 M, y H358 = 1,0 uM. Todos los valores representan la media ± SEM (n = 4).
Como una prueba de concepto de que la activación de EGFR puede desensibilizar a las células de fusión impulsada ROS1 a la inhibición ROS1, hemos examinado el efecto de la activación del receptor inducida por el ligando en la sensibilidad. Para lograr esto, se realizaron ensayos de proliferación que examinan la sensibilidad a TAE684 en ausencia o presencia del EGFR ligando EGF. Hemos encontrado que la adición de EGF al comienzo del ensayo desensibilizado significativamente las células parentales HCC78 a la inhibición de ROS1 (Figura 7A). Por el contrario, el EGF no tuvo efecto sobre la sensibilidad de las células HCC78-TR, que se esperaba debido a la insensibilidad ya máxima de esta línea (
cf
Figura 2A). Mecánica, la desensibilización de las células parentales HCC78 correlaciona con un rescate por EGF de la TAE684 inducida de-fosforilación de Akt y ERK1 /2 (Figura 7B).
células HCC78 parental y HCC78-TR (A) fueron tratados con TAE684 durante 3 días con o sin la adición de 100 ng /ml de EGF y luego se analizó por el ensayo de MTS. Los valores representan la media ± SEM (n = 3). Calculado IC
50 valores para TAE684: los padres + vehículo = 0,18 M, los padres + EGF = 0,57 M, HCC78-TR + vehículo = 1,39 m, y HCC78-TR + EGF = 1,45 M. EGF desensibilizado significativamente HCC78 los padres, pero no las células HCC78-TR a TAE684 según lo determinado por la prueba t de Student pareada (p & lt; 0,05). (B) células HCC78 parentales fueron tratadas con TAE684 durante 4 horas, EGF durante 10 minutos, o una combinación de ambos. Los lisados de las células se analizaron entonces mediante transferencia de Western usando los anticuerpos indicados. (C) CUTO-2 células fueron tratadas con TAE684 durante 4 días con o sin la adición de 100 ng /ml de EGF y luego se analizaron mediante el ensayo de MTS. Los valores representan la media ± SEM (n = 3). Calculados los valores de CI
50 para TAE684: + vehículo = 0,2 M y + EGF = 0,81 m. EGF desensibilizado significativamente células CUTO-2 a TAE684 como se determinó mediante la prueba t de Student pareada (p & lt; 0,01). (D) CUTO-2 células fueron tratadas con TAE684 durante 4 horas, EGF durante 10 minutos, o una combinación de ambos. Los lisados de las células se analizaron entonces mediante transferencia de Western usando los anticuerpos indicados. bandas fosforilada ROS1 estaban por debajo del límite de detección y, por tanto, no se incluyeron.
Una línea celular se deriva de la biopsia que fue tomado de tumor resistente del paciente. El establecimiento de esta línea celular, que hemos denominado de Colorado Universidad de Oncología Torácica-2 (CUTO-2), tomó aproximadamente un año en la cultura y se llevó a cabo en ausencia de un inhibidor de ROS1. Cuando las células alcanzaron suficiente número de pases (& gt; 35 pasajes) y tasa de crecimiento suficiente para el análisis experimental, hemos examinado ROS1 estado de fusión de genes, expresión de la proteína de fusión ROS1, y sensibilidad a la inhibición ROS1. Se verificaron las células CUTO-2 para exhibir todavía reordenación de la
ROS1
gen y expresar una proteína de fusión ROS1 (Figura S8A, B). En los ensayos de proliferación, las células CUTO-2 demostraron una sensibilidad similar a TAE684 y un ligero aumento de sensibilidad a crizotinib comparación con las células parentales HCC78 (Figura 7C y la Figura S8C). Curiosamente, al igual que las células parentales HCC78, sensibilidad a la inhibición ROS1 podría reducirse mediante la aplicación EGF y esta desensibilización correlacionada con rescate de la reducción inducida por TAE684 de AKT fosforilada y ERK1 /2 (Figura 7 C y D).
discusión
adquirido resistencia a las terapias dirigidas es una limitación importante para el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón. Sin embargo, los enfoques racionales para combatir la resistencia se puede desarrollar una vez que se identifican los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a ella. En este estudio, hemos investigado los mecanismos de resistencia a la inhibición ROS1 en el CPNM. Esto se logró usando muestras de tumor de un paciente NSCLC que se hizo resistente a la crizotinib y una línea celular de NSCLC que hicimos resistente a la inhibición por ROS1 cultivo continuo en el TAE684 inhibidor ROS1. Idealmente, los estudios realizados para examinar los mecanismos de resistencia incluyen bancos de muestras de varios pacientes y varias líneas celulares diferentes. Sin embargo, como
ROS1
reordenamientos sólo están presentes en el 1-2% de los pacientes con CPNM, que sólo tenía acceso a un paciente que se hizo resistente al tratamiento. Además, antes de nuestra derivación de la línea de CUTO-2, HCC78 era la única línea celular de NSCLC publicado conocido para expresar una proteína de fusión ROS1. A pesar de estas limitaciones, los resultados de este estudio tienen implicaciones importantes para
pacientes ROS1
reordenamiento positivas que quedan resistente a crizotinib tratamiento. Antes de nuestro estudio, sólo un informe publicado había identificado un mecanismo de resistencia a la inhibición ROS1. En el estudio de Awad et al., Un
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paciente reordenamiento-positivas que inicialmente respondieron a crizotinib, pero se volvieron resistentes se encontró que han adquirido una mutación en el codón 2032 de un gen de fusión
ROS1
(
CD74-ROS1). Esta mutación se ha demostrado para interferir con crizotinib unión al sitio de unión a ATP ROS1 [30].