Extracto
miRNAs desregulada juegan un papel crítico durante la carcinogénesis y la progresión del cáncer. En el presente estudio, la función de miR-1228 * en la regulación de la progresión del cáncer se investigó en el cáncer gástrico. Se observó una menor expresión de miR-1228 * en tejidos de cáncer gástrico humano que comparan a los tejidos normales. Posteriormente, se evaluó el papel de miR-1228 *
in vivo
utilizando el modelo de xenoinjerto de tumor. En este modelo, el miR-1228 * sobreexpresión suprime la formación de tumores de xenoinjertos. Por otra parte, hemos demostrado miR-1228 * regulada negativamente la actividad de NF-kB en las células de cáncer gástrico SGC-7901 y encontramos que CK2A2 era un objetivo de miR-1228 *. La regulación positiva de miR-1228 * disminuyó la expresión de marcadores mesenquimales y aumentó el marcador epitelial E-cadherina, lo que sugiere su posible papel en la represión de la transición epitelio-mesenquimal. En conjunto, estos resultados proporcionan la primera evidencia de que el miR-1228 * juega un papel importante en la regulación del crecimiento del cáncer gástrico y sugieren que la restauración selectiva de MIR-1228 * podría ser beneficioso para el tratamiento del cáncer gástrico
Visto:. Jia L , Wu J, Zhang L, Chen J, Zhong D, Xu S, et al. (2013) Restauración de miR-1228 * Expresión Suprime epitelio-mesenquimal transición en el cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (3): e58637. doi: 10.1371 /journal.pone.0058637
Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 25 Octubre, 2012; Aceptado: 5 Febrero 2013; Publicado: 12 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Jia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los microARN (miRNA) son una clase de corto ( 20-23 nucleótidos de longitud), ARN endógenos, de cadena simple que regulan la expresión de genes por causando traslacional represión o ARNm degradación [1], [2]. A través de estos mecanismos moleculares, miRNAs poseen funciones biológicas normales, tales como la regulación de la proliferación celular, diferenciación y apoptosis. Por otra parte, miRNAs dysregulated se ha demostrado que desempeñan papeles críticos en la regulación de la carcinogénesis y la progresión del cáncer [3], [4]. expresión de Abberant miRNAs se han observado en muchos tipos de tumores malignos, incluyendo el cáncer gástrico [5].
epitelial-mesenquimal transición (EMT) es un evento biológico que permite la reprogramación de células epiteliales a someterse a múltiples cambios bioquímicos para adquirir una célula mesenquimal fenotipo. Mientras EMT es crítica para el desarrollo embrionario adecuado, el aumento de la evidencia sugiere que la activación aberrante de EMT conduce a la progresión del tumor maligno [6]. Se ha demostrado que EMT es un proceso clave que contribuye al desarrollo de cáncer, que se caracteriza por la pérdida del marcador epitelial E-cadherina, un aumento en el marcador mesenquimal vimentina, y un aumento en el comportamiento migratorio e invasivo [7], [8].
En nuestro estudio anterior, mediante el análisis de la matriz de esferas miARN cáncer de páncreas, el miR-1228 * se encontró como uno de los miRNAs relacionados con el cáncer (datos no mostrados). Aquí, nos presentó pruebas de que el miR-1228 * se había reducido regulado en los tejidos de cáncer gástrico en comparación con los tejidos normales. Restauración expresión de miR-1228 * en células de cáncer gástrico inhibe significativamente la migración celular y el crecimiento tumoral. Mecánica, hemos demostrado que el miR-1228 * inhibe la activación de NF-kB y potencialmente suprime la EMT.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
líneas celulares de cáncer gástrico humano SGC-7901 , AGS y BGC-823 se adquirieron en el Instituto de Bioquímica y Biología celular (Academia de Ciencias de china). Uno GES-1 normales de células del epitelio gástrico se adquirió en el Instituto para la Investigación de Cáncer de Beijing. Estas células se mantuvieron a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% en medio RPMI-1640 (SGC-7901 y BGC-823), F-12K (AGS) o DMEM (GES-1) complementado con suero bovino fetal al 10% [ ,,,0],9], [10].
muestras clínicas
Cincuenta pares de cáncer gástrico y muestras de tejido no cancerosas adyacentes fueron obtenidas de pacientes sometidos a resección quirúrgica en el Segundo hospital Afiliado de la Facultad de Medicina , la Universidad de Zhejiang. Los tejidos adyacentes no cancerosas emparejados se obtuvieron al menos 5 cm de distancia del sitio del tumor. Ninguno de los pacientes había recibido radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía. Se recogieron muestras de tejido, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su utilización [11]. Todos los tejidos fueron diagnosticados histológicamente como adenocarcinomas gástricos. El estudio fue aprobado por la Segunda Comisión de Ética del Hospital Afiliado de la Zhejiang University College of Medicine. El consentimiento informado firmado se obtuvo de todos los participantes o de los representantes de los pacientes si no se pudo obtener el consentimiento directo.
La extracción de RNA y PCR en tiempo real
El ARN total se extrajo de las células cultivadas o se determinó tejidos usando TRIzol (Invitrogen), y la concentración de ARN total. Síntesis de ADNc y la PCR en tiempo real se realizó utilizando el TaqMan MicroARN Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) y el Kit de Ensayo TaqMan microARN (Applied Biosystems), respectivamente. PCR en tiempo real se realizó en un Sistema de PCR ™ Real-Time Applied Biosystems StepOnePlus acuerdo con el protocolo. El nivel de expresión de miR-1228 * se normalizó a RNU6B. El tiempo real de las reacciones de PCR se realizaron por triplicado. La expresión relativa de miRNAs se calculó utilizando el método comparativo Ct [12].
Tumor Inoculación de ensayo en ratones desnudos
hembra Balb /c atímicos ratones desnudos a la edad de 4 semanas fueron adquiridos de el Laboratorio Animal Center Shanghai (Academia de Ciencias de china). Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal Experimental de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang. transfección estable SGC-7901 células suspensiones de miR-1228 * o miR-NC (2,5 × 10
7 células /ml) en 200 l de medio libre de suero fueron inyectados por vía subcutánea en los costados de ratones desnudos, respectivamente. El crecimiento del tumor fue examinado dos veces por semana durante 5 semanas y el volumen del tumor (V) se controló mediante la medición de la longitud (L) y el ancho (W) del tumor con calibradores y se calculó con la fórmula V = 1/2 (L x W × W) [13].
migración de células
La capacidad de migración de miR-1228 * o células SGC-7901 transfección estable miR-NC fueron detectados utilizando Transwells (tamaño de poro de 8 mm, Corning). Los Transwells se pusieron en las placas de 24 pocillos. células recién tripsinizadas y lavadas se suspendieron en 100 l RPMI1640 libre de suero que contenía suero bovino fetal al 1%. Acerca de 1 × 10
5 células /pocillo se colocó en la cámara superior de cada inserción. se añadieron 200 l de RPMI1640 que contenía suero bovino fetal al 20% en las cámaras inferiores. Después de incubar durante 24-48 horas a 37 ° C en un 5% CO
2 incubador humidificado, las células se fijaron con alcohol absoluto 95% y se tiñeron con cristal violeta [14]. Las células en la cámara interior se eliminaron con un hisopo de algodón y las células unidas a la parte inferior de la membrana se contaron y la imagen en un microscopio invertido a 200 × magnificación en cinco campos aleatorios en cada pocillo. Cada experimento se realizó por triplicado.
Western Blot
Las proteínas totales se midieron utilizando el kit BCA (Pierce) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las proteínas de las células se fraccionaron por electroforesis en gel de SDS poliacrilamida membranas y electro-transfirió a nitrocelulosa 12% (NC) durante 2,5 horas a 200 V. El membranas NC se incubaron con tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de tratamiento durante la noche con el anticuerpo primario a 4 ° C, y luego con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (MBL). Después del lavado, se detectaron las bandas reactivas utilizando un kit de detección por transferencia Western ECL (Millipore) según las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos utilizados en este experimento fueron conejo monoclonal anti-E-cadherina (Epitomics), anti-vimentina (Epitomics), anti-β-catenina (Epitomics), anti-Snail (Señalización Celular), anti-Slug (Señalización Celular), anti -ZEB1 (Señalización celular), anti-ZEB2 (Santa Cruz), anti-CK2A2 (Santa Cruz) y el ratón anti-GAPDH (Kangchen Biotech).
La inmunohistoquímica
secciones de parafina, 3- m de espesor, se cocieron durante 2 horas a 60 ° C y desparafinaron. La recuperación del antígeno se llevó a cabo usando tampón de citrato de sodio (pH 7,2) a 95 ° C durante 15 minutos y luego portaobjetos se enfrió a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de ser tratado con peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 minutos para bloquear la peroxidasa endógena, las secciones se trataron con confinar suero normal de cabra líquido durante 30 minutos para reducir la unión no específica y luego policlonal de conejo anti-E-cadherina (Santa Cruz) o monoclonal de conejo anti-vimentina (Epitomics) se incubaron las secciones durante 12 horas a 4 ° C. Después de recalentamiento para 1 h y lavado 5 veces, las secciones se incubaron con anticuerpo secundario durante 30 minutos a temperatura ambiente. Diaminobencidina se utilizó para reacciones de color.
Construcción del plásmido y transfección celular
El MIR-1228 * vector de expresión (MIR-1228 *) o un control negativo (miR-NC) se construyó por clonación de oligonucleótidos hibridados que contenían el optimizado de miR-1228 * tallo-bucle (oligonucleótidos fueron diseñados como: cadena superior, 5'-TGC TGG TGG GCG GGG GCA GGT TGG GTG TTT TGG CCA CTG ACT GAC CAC ACA CCC CCC CGC CCA C-3 ' ;. cadena inferior, 5'-CCT GGT GGG GGG CGG GGT TGG GTG TCA GTC AGT GGC AAC AAC AAC CAC ACA GCC GCC CCC CAC C-3 ') o un control negativo de tallo-bucle en pcDNA6.2-GW /EmGFP vector ( Invitrogen) [15]. El 2-kb de miR-1228 * región promotora se amplificó (cebadores se diseñaron como: adelante, 5'-ATC TAG GGT ACC CTC ACT TGG AG CCA CAC AGA-3 '; revertir, 5'-GAC AGA TCT TGA TCA ACC AGA GTT GGG GTG TG-3 '.) y coloned de pGL3-Enhancer vector (Promega) [16], nombrado como pGL3-MIR-1228 * -promoter. El vacío pGL3-Enhancer Vector actuó como control negativo (pGL3-control). El MIR-1228 * región diana de la secuencia CK2A2 3'UTR fue sintetizado químicamente por Shanghai Biotech y se insertó aguas abajo del plásmido PMIR-INFORME luciferasa (Applied Biosystems), nombrado como PMIR-CK2A2. El clon Preceiver-c-Rel ORF con GFP-tag se adquirió de GeneCopoeia. Para generar células transfectadas estables, el miR-NC construcciones de expresión de miR-1228 * y se transfectaron en la línea celular SGC-7901 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Después de 48 horas, blasticidina (14 g /ml) fue añadido al medio. El pGL3-MIR-1228 * -promoter /control, GFP-c-Rel /control, PMIR-CK2A2 /o control de NF-kappa B reportero vector (Promega) se transfectaron transitoriamente en células SGC-7901 utilizando Lipofectamine 2000, PRL-TK ( Promega) se utilizó como normalización interna [17].
Luciferase reportero de ensayo
ensayo indicador de luciferasa se realizó en células SGC-7901. Las células se lavaron con PBS dos veces y lisaron en tampón de lisis pasiva (Promega) y las actividades de luciferasa se midieron a partir de 20 l de lisado usando el Sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega) en GloMax 20/20 luminómetro (Promega). Todos los datos fueron obtenidos promediando los resultados de al menos tres repeticiones independientes.
Análisis estadístico
Las diferencias entre los niveles de expresión del miR-1228 * en pacientes con cáncer gástrico se determinaron mediante el Wilcoxon prueba de rangos con signo. Los datos clínicos se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrado. La prueba t de Student y ANOVA se utilizaron para analizar los
in vitro
y
in vivo
datos. Todos los
P
valores fueron de dos caras y se definieron como las diferencias estadísticamente significativas para
P Hotel & lt; 0.05. Los resultados fueron analizados utilizando el software SPSS V.16.0 (SPSS Inc). * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0.01.
Resultados
MIR-1228 * Con frecuencia se ha reducido regulado en el cáncer gástrico humano
En primer lugar, para determinar si el MIR-1228 * se expresa diferencialmente en primaria humana cáncer gástrico, el nivel de expresión de la madurez de miR-1228 * se examinó utilizando TaqMan PCR en tiempo real en 50 pares de tejidos de cáncer gástrico humano y los tejidos no cancerosos gástricos adyacentes pareados. Nuestros resultados mostraron que el nivel de expresión de miR-1228 * se redujo significativamente en los tejidos de cáncer gástrico en comparación con los tejidos adyacentes no cancerosos gástricas (Fig. 1A). Alrededor del 72% de las muestras tumorales se expresaron con el miR-1228 * (fig. 1B) inferior. Usando los valores 2
-ΔΔCT, pliegue del cambio de miR-1228 * & lt; 1.0 Se consideró como bajo, mientras que & gt; 1,0 se consideró como alta expresión [18]. MIR-1228 * expresión también se evaluó en líneas celulares de cáncer gástrico y una línea inmortalizada de la mucosa gástrica normal de células epiteliales (GES-1). Como se muestra en la Fig. 1C, el miR-1228 * fue significativamente más baja expresión en todas las líneas celulares de cáncer en comparación con GES-1. Tomados en conjunto, estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de que el miR-1228 * se había reducido regulado en el cáncer gástrico.
(A) En los tejidos de cáncer gástrico humano en comparación con los tejidos no cancerosos adyacentes apareados (normales) gástricos, el MIR-1228 * se había reducido regulado. La expresión de miR-1228 * fue analizado por PCR en tiempo real y normalizado a RNU6B. Los resultados se muestran en una escala logarítmica. Las diferencias estadísticas entre las muestras se analizaron con la prueba de Wilcoxon de rangos con signo (n = 50). (B) Expresión relativa de miR-1228 * 50 en tejidos de cáncer gástrico en comparación con los tejidos normales emparejados. Los datos se muestran como 2
valores -ΔΔCT. (C) La expresión de miR-1228 * en 3 líneas celulares de cáncer gástrico y una línea celular inmortalizada normal de la mucosa del epitelio gástrico (GES-1) se llevó a cabo mediante PCR en tiempo real y normalizado a RNU6B. Los resultados son medias ± SEM, n = 3.
Además, el miR-1228 * expresión se evaluaron con respecto a las características clínico-patológicas de los pacientes. Todos los pacientes tenían metástasis a distancia y todos los tejidos fueron confirmados histológicamente con adenocarcinomas gástricos. Todos los casos (n = 50) fueron estratificados en dos grupos: el miR-1228 * baja expresión (n = 36) y miR-1228 * alta expresión (n = 14). El grupo de baja expresión de miR-1228 * tenía inclinaciones hacia mayor tamaño del tumor. Sin embargo, no hubo relaciones significativas entre el MIR-1228 * expresión y otras características clínico-patológicas tales como la edad, sexo, tipo histológico o el estadio TNM (Tabla 1).
El aumento de miR-1228 * Expresión Suprime xenoinjerto de tumor Formación
con el fin de evaluar el papel funcional de miR-1228 * en el cáncer gástrico, el MIR-1228 * optimizado tallo-bucle se clonó en pcDNA6.2-GW /EmGFP vectorial. línea celular de células gástricas SGC-7901 fueron transfectadas con /EmGFP-MIR-1228 * o pcDNA6.2-GW /EmGFP-NC líneas celulares estables vectoriales y pcDNA6.2-GW se generaron y nombrado el miR-1228 * o miR-NC, respectivamente. Como era de esperar, el análisis RT-PCR mostró que las células estables * miR-1228 tuvieron un incremento de madurez de miR-1228 * expresión cuando se comparan con las células estables miR-NC (Fig. 2A). No hubo cambios morfológicos en las células *-transfectadas estables miR-1228 en comparación con las células no transfectadas. células SGC-7901 con o sin la transfección de miR-1228 * Se implantaron subcutáneamente en los flancos de ratones desnudos para evaluar los efectos potenciales de MIR-1228 * en el crecimiento del cáncer gástrico
in vivo
. La sobreexpresión de miR-1228 * suprimió significativamente el crecimiento del tumor (Fig. 2B). Al final del período experimental, el tamaño y el peso húmedo de los tumores con miR-1228 * sobreexpresión fue significativamente más pequeña y más baja que la del grupo control (Fig. 2C-D). Por lo tanto, los datos indican que el miR-1228 * inhibe el crecimiento de tumores de xenoinjertos de células de cáncer gástrico
in vivo
.
(A) de miR-1228 * fueron los cambios más de diez veces en el miR 1228 * estable transfectadas SGC-7901 en comparación con NC. Los resultados son medias ± SEM, n = 3. (B) Aumento de miR-1228 * expresión suprime el crecimiento de tumores de xenoinjertos. transfección estable de células SGC-7901 con el miR-1228 * o miR-NC se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos. El volumen de cada tumor se midió dos veces cada semana. El volumen medio de los tumores desarrollados en ratones desnudos se muestra como medias ± SEM, n = 6 por grupo de tratamiento. Las diferencias estadísticas entre las muestras se determinaron mediante el ANOVA de dos vías. (C) En comparación con el control, los xenoinjertos con el miR-1228 * sobreexpresión fueron significativamente más pequeño. Los ratones fueron sacrificados 5 semanas después de la inoculación. Se muestra la fotografía de los tumores de ambos grupos. (D) Tumores de cada grupo se pesaron inmediatamente después de la eliminación. El peso del tumor se indica como medias ± SEM, n = 6.
NF-kB activación es responsable de la expresión de miR-Baja 1228 * en el cáncer gástrico
tiene Trabajos recientes demostrado que la mayoría de miRNAs tienen factor de transcripción (TF) sitios de unión y muchos estudios han informado de que los miRNAs podrían ser reguladas por TFS [19]. Aquí hemos utilizado programas bioinformáticos (Promotor 2.0 y P-partido) para identificar posibles reguladores de los genes miARN-1228 * [16], [17]. Encontramos tres c-Rel dominios de unión en el 2-kb de miR-1228 * región promotora (Fig. 3A). Desde c-Rel subunidad es un miembro de la familia NF-kB y la hiperactivación de la actividad de NF-kappa B se ha demostrado que se asocia con el cáncer gástrico [20], [21]. La hipótesis de que la activación de NF-kB se atribuye a la regulación a la baja de miR-1228 * en el cáncer gástrico.
(A) Las representaciones esquemáticas del MIR-1228 * región promotora (las puntas de flecha negras es la unión de c-Rel dominios), menor es la pGL3-MIR-1228 * constructo -promoter. (B) 24 horas después de la transfección con pGL3-miR-1228 * -promoter o control pGL3, las células SGC-7901 se estimularon con o sin TNF-α y /o PDTC durante 8 horas, a continuación, se midió la actividad de luciferasa relativa. La actividad luciferasa se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla expresada por PRL-TK y después se compara con el nivel relativo de luciferasa pGL3-control. *
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control.
#
P
& lt; 0,05 en comparación con el grupo de TNF-α-tratada. células (C) SGC-7901 fueron co-transfectadas con pGL3-MIR-1228 * -promoter /pGL3-control y GFP-c-Rel /GFP-control, y la expresión relativa de luciferasa se detectó a las 48 horas. La actividad luciferasa se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla expresada por PRL-TK y después se compara con el nivel de luciferasa relativa de GFP-control. Los datos se expresan como medias ± SEM, n = 3.
Para probar nuestra hipótesis, hemos creado un constructo de luciferasa con el miR-1228 * región promotora y evaluamos su actividad en respuesta a la activación de NF-kB. Se realizó un experimento mediante el cultivo de células SGC-7901 para 8 horas en presencia de TNF-α (50 o 100 ng /ml, clásico vía activador de NF-kappa B) y /o pirrolidina ditiocarbamato (PDTC, 100 M), un ampliamente utilizado inhibidor del factor de transcripción NF-kB [22]. células SGC-7901 fueron transfectadas con pGL3-miR-1228 * -promoter o control pGL3, 24 horas más tarde, las células transfectadas SGC-7901 se expusieron durante 8 horas a TNF-α con o sin PDTC para investigar si regula la activación de NF-kB MIR-1228 * la actividad promotora. Hemos observado que el tratamiento TNF-α inhibida marcadamente miR-1228 * la actividad del promotor y la inhibición de NF-kappa B con PDTC impidieron downregulation TNF-α-mediada de los niveles de actividad (Fig. 3B), lo que sugiere que NF-kappa B puede regular negativamente miR 1228 * expresión. A fin de determinar si el NF-kB subunidad c-Rel es responsable de la desregulación de miR-1228 *, las células transfectadas SGC-7901 miR-1228 * -promoter con o sin GFP-c-Rel y observó una disminución significativa de la actividad luciferasa en GFP grupo-Rel -c de control (Fig. 3C). En conjunto, los datos sugieren que NF-kappa B subunidades c-Rel contribuye funcionalmente a la regulación a la baja de miR-1228 * en el cáncer gástrico.
MIR-1228 * Suprime NF-kB actividad y la expresión CK2A2 en SGC-7901
con el fin de investigar la influencia del MIR-1228 * en la vía de señalización NF-kappa B, NF-kappa B reportero construcciones fueron transfectadas en cualquiera de miR-1228 * o miR-NC estable transfectaron células SGC-7901 y la actividad de NF-kB de luciferasa se determinó después de 48 horas. Nuestros resultados mostraron que la actividad de NF-kB se redujo significativamente por la sobreexpresión de miR-1228 * (Fig. 4A), lo que indica un bucle de retroalimentación negativa entre el miR-1228 * expresión y la actividad de NF-kB. Para identificar más abajo objetivos de miR-1228 * en la ruta de NF-kB, se realizó un análisis de la bioinformática y encontramos CK2A2 fue uno de los genes diana putativos que se predijo. El uso de Miranda y RNA22 [23], [24], que encuentran un sitio de unión potencial para MIR-1228 * en el 3'UTR de CK2A2 (Fig. 4B). CK2A2 es una subunidad de la proteína quinasa CK2 que está implicado en la ruta de NF-kB [25], [26] y su expresión se ha observado que hasta reguladas en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer gástrico [27], [28]. Otras investigaciones sobre la asociación entre CK2A2 y miR-1228 * demostraron que los niveles de proteína de CK2A2 fue concomitantemente las reguladas en el miR-1228 * sobreexpresión estable en células SGC-7901 (Fig. 4C). Con el fin de verificar si CK2A2 es un verdadero objetivo de miR-1228 *, un segmento de la CK2A2 3'UTR que contiene el sitio de unión se clonó en el 3'UTR del gen de la luciferasa en PMIR-INFORME plásmido [29]. La intensidad fluorescente del gen indicador se redujo significativamente en el grupo que fue co-transfectadas con PMIR-CK2A2 y miR-1228 * en comparación con el control (Fig. 4D). Estos resultados sugieren que el miR-1228 * interactúa con el CK2A2 3'UTR de ARNm.
(A) SGC-7901-MIR-1228 * y SGC-7901-miR-NC fueron transfectadas con el reportero NF-kB construir, respectivamente. 48 horas después de la transfección, se midió la actividad de luciferasa. La actividad luciferasa se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla. Los resultados son medias ± SEM, n = 3. (B) gráfico esquemático del sitio de unión putativo de miR-1228 * en el CK2A2 predicho por Miranda. (C) Análisis de transferencia Western reveló que el nivel de proteína de CK2A2 en * sobreexpresión estable de células SGC-7901 miR-1228 fue significativamente disminuyó en comparación con el miR-NC. El nivel de GAPDH se utilizó como control de carga. (D) de miR-1228 * redujo significativamente la lectura de la luciferasa cuando se co-transfectaron con PMIR-CK2A2 3'UTR plásmido, lo que indica la interacción entre el miR-1228 * y CK2A2 3'UTR en este sitio. La actividad luciferasa se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla expresada por PRL-TK. Los datos se expresan como medias ± SEM, n = 3.
MIR-1228 * Inhibe la EMT
Se ha informado de que la activación de NF-kappa B juegan un papel esencial en la EMT de la progresión del cáncer [30], [31], y la inhibición de la actividad de NF-kB en algunas líneas celulares tumorales causaron una reversión de EMT [32]. Dado que el miR-1228 * parece negativamente regula la actividad de NF-kappa B, por lo que investigó si el miR-1228 * también podría regular negativamente la EMT en el cáncer gástrico. Western blot mostró que la sobreexpresión de miR-1228 * en células SGC-7901 marcadores mesenquimales reguladas por (vimentina, β-catenina, caracol, barra, y ZEB1 /2), mientras que hasta reguladas marcadores epiteliales E-cadherina (Fig. 5A ). Además, miR-1228 * sobreexpresión causó una disminución de la migración celular (Fig. 5B-C). La tinción inmunohistoquímica se utilizó para confirmar aún más proteínas relacionadas con la EMT cambios de miR-1228 * transfectadas las células SGC-7901 en el modelo de xenoinjerto. Se demostró que la expresión de vimentina se redujo y la expresión de E-cadherina aumentó en comparación con el que en las células control (Fig. 5D). Los resultados similares se observaron en otra línea celular de cáncer gástrico AGS (Fig. S1). Los datos proporcionan la primera evidencia de que el miR-1228 * restauración en el cáncer gástrico regula negativamente la EMT.
(A) Western blot de marcadores epiteliales (E-cadherina) y marcadores mesenquimales (vimentina, β-catenina, Caracol , Slug, y ZEB1 /2) en el miR-1228 * estables transfectadas las células y el control SGC-7901. ensayo de migración (B) Transwell mostraron que las células SGC-7901 estables transfectadas con el miR-1228 * tenían menor potencial migratorio en comparación con el miR-NC (× 100). (C) El nivel relativo de la migración celular se presenta como la media ± SEM, sobre la base de tres experimentos independientes. (D) Expresión de marcadores relacionados con la EMT en xenoinjertos de tumores. La tinción inmunohistoquímica se indica disminuyó vimentina y el aumento de la expresión de E-cadherina en el miR-1228 * xenoinjertos de tumores en comparación con el control (× 400).
Discusión
El cáncer gástrico es el cuarto más común tumor maligno en todo el mundo y en la actualidad es la segunda causa de mortalidad relacionada con el cáncer [33], [34]. A pesar de que la práctica actual que combina la quimioterapia o la radioterapia con resección quirúrgica ha aumentado en gran medida la supervivencia global de los pacientes con cáncer gástrico, la tasa de supervivencia global a los 5 años es aún baja. carcinogénesis gástrica se considera que es un proceso multifactorial y de múltiples etapas que implica la activación de oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores [35].
miRNAs son endógenas no codificantes de proteínas ARN cortos que desempeñan papeles importantes en celular la fisiología, el desarrollo, y las enfermedades regulando negativamente la expresión génica. Los análisis de los perfiles de expresión de genes miARN han demostrado que muchos miRNAs se expresan y se correlacionaron con la tumorigénesis, la progresión y pronóstico de diversos tumores hematológicos y sólidos, incluyendo cáncer gástrico [36] de manera aberrante. Para identificar y aclarar las funciones biológicas de miRNAs desregulación en el cáncer gástrico puede ayudar a comprender mejor la patogénesis de esta enfermedad mortal y proporciona nuevas oportunidades para el desarrollo de terapias basadas en genes miARN. Por ejemplo, miR-221 y miR-222 se ha demostrado que ser regular positivamente la proliferación de células de cáncer gástrico y la invasión, lo que sugiere que la inhibición de selección de esos miRNAs ser beneficioso para los tratamientos de cáncer gástrico [37]. miRNAs juegan un papel en la etiología y la patogénesis de diversos tipos de cáncer por la orientación de un número de oncogenes o supresores de genes tumorales. miR-21 se sobreexpresa en la mucosa gástrica infectada por H. pylori y cáncer gástrico tejidos. la expresión forzada de miR-21 aumenta la invasividad de las células de cáncer gástrico, RECK es el objetivo directo de miR-21 [38]. miR-218 inhibe la invasión y la metástasis de cáncer gástrico por diana es el receptor Robo1 [39]. Ueda et al [40] identificado 22 hasta reguladas y 13 miRNAs-regulado en el cáncer gástrico en comparación con la mucosa no tumoral, baja expresión de let-7 g y miR-433 y la alta expresión de miR-214 se asociaron con un resultado desfavorable en general la supervivencia independiente de covariables clínicas, incluyendo la profundidad de la invasión, metástasis de los ganglios linfáticos, y el escenario. miR-375 es con frecuencia el regulado en el cáncer gástrico y funcionar como un supresor de tumores para regular la proliferación celular de cáncer gástrico potencialmente por la orientación del oncogén JAK2 [10]. Nuestro otro estudio mostró el miR-1228 * estaba relacionado con el cáncer epitelial de un miARN (sin publicar). Sin embargo, sólo se han publicado pocas investigaciones de MIR-1228 *. Guled et al [41] demostró que el miR-1228 * fue altamente expresado en las muestras de mesotelioma maligno en comparación con las muestras normales. Pero la función biológica de este miARN todavía no ha sido evaluado. En el presente estudio, hemos identificado que el miR-1228 * se había reducido regulado en más de un 70% de las muestras de cáncer gástrico en comparación con sus homólogos no tumoral y proporcionar evidencia experimental de que puede funcionar como un supresor tumoral a través de la regulación negativa de EMT y la inhibición de NF -κB actividad.
Nuestros datos indicaron regulación a la baja de miR-1228 * en tejidos de cáncer gástrico y las líneas celulares de cáncer gástrico. Varios mecanismos moleculares conducen a miRNA desregulación, tales como mutación genética, la aberración epigenética y desregulado actividad transcripcional [42]. TFS podría regular la expresión de los genes miARN mediante la unión a regiones promotoras, ya sea en contextos fisiológicos o patológicos [43]. * Para investigar cómo el miR-1228 fue desregulado en el cáncer gástrico, analizamos la región del promotor de 2 kb aguas arriba del MIR-1228 * y encontramos tres supuestos dominios de unión a c-Rel. Aunque NF-kappa B es el más conocido por su función de activación transcripcional, trabajo reciente con p65, RelB y c-Rel demostraron que NF-kB puede regular a la baja los genes específicos [17], [44], [45]. El uso de un MIR-1228 * de promotor-indicador constructo que contenía fragmentos de 2 kb del promotor * miR-1228, se encontró que activador de NF-kB vía de TNF-α disminuyó el miR-1228 * la actividad promotora. Y NF-kB inhibidor PDTC notablemente antagonizado TNF-α mediada por el miR-1228 * promotor de baja actividad. Nuestros datos también mostraron que el c-Rel pudo une directamente con el miR-1228 * promotor y regular negativamente su expresión. Desde c-Rel subunidad es un miembro de la familia NF-kappa B, la activación de NF-kB phenocopied los efectos de c-Rel en la regulación de miR-1228 * expresión, lo que sugiere que NF-kB participó negativamente en la regulación a la baja de miR-1228 * en el cáncer gástrico. Por otra parte, el miR-1228 * sobreexpresión también resultó en la regulación a la baja de la actividad de NF-kB. Por lo tanto, nuestros datos esbozan un doble bucle de retroalimentación negativa entre el NF-kB y miR-1228 *. El mecanismo exacto de cómo se produce este retroalimentación negativa debe ser estudiado más.
CK2A2 es una subunidad de la proteína quinasa CK2, que es una proteína ubicua serina /treonina quinasa altamente conservada y. La sobreexpresión de CK2 se ha observado en un número de cánceres, incluyendo los de la glándula mamaria, próstata, riñón, pulmón, cabeza y cuello y el estómago [27], [46]. La sobreexpresión de CK2 en las glándulas mamarias de ratones transgénicos provoca hiperplasia y displasia que eventualmente conducen a adenocarcinomas [47]. CK2 se sobreexpresa en la cabeza y el cuello escamosas líneas de carcinoma de células y tejidos. Desmontables de subunidades CK2 diferencialmente inhibe la degradación de I? B?, NF-kB de localización nuclear, la fosforilación, la unión de ADN, y la actividad del indicador [25]. CK2 juega un papel importante en Her-2 de señalización /neu, la promoción de la degradación de I? B y la activación de NF-kappa B [26]. En este estudio, hemos demostrado que el miR-1228 * reduce la expresión de CK2A2 a nivel de proteínas. El ensayo de luciferasa con un reportero que contiene el MIR-1228 * secuencia de unión en el 3'UTR del ARNm CK2A2 sugirió que el miR-1228 * se dirige directamente a la 3'UTR de CK2A2. Tomados en conjunto, estos datos indican que la supresión de la actividad de NF-kB por el miR-1228 * Puede ser a través de la expresión de segmentación CK2A2. EMT está ahora todos sabe que se producen en una variedad de enfermedades, incluyendo la progresión del cáncer. Se reconoce que EMT es un proceso importante para formar la histología difusa e iniciar la metástasis mediante la mejora de la motilidad de las células tumorales [48]. EMT está regulada por diferentes vías de señalización oncogénicas tales como Akt y NF-kB [49], [50]. Específicamente, la activación de NF-kappa B se ha demostrado que la promoción de EMT mientras que la inhibición de la actividad de NF-kB en las células mesenquimales causa una reversión de EMT [30]. La pérdida de expresión de E-cadherina y el aumento de la expresión de vimentina se considera que son los marcadores moleculares más importantes de la EMT [51].