Extracto
Antecedentes
jugadas angiogénesis patológica un papel esencial en la agresividad del tumor y lleva al pronóstico desfavorable. El objetivo de este estudio es detectar la posible función de la proteína de unión de Retinoblastoma 2 (RBP2) en la angiogénesis tumoral del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).
Métodos
La tinción inmunohistoquímica fue se utiliza para detectar la expresión de RBP2, el factor-1α inducible por hipoxia (HIF-1α), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y CD34. Dos pares de secuencias de siRNA y pcDNA3-HA-RBP2 se utilizaron para regular a la baja y hasta de regular la expresión RBP2 en H1975 y SK-MES-1 en las células. Un ensayo de formación de tubo celular endotelial, VEGF ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas, en tiempo real PCR y Western Blot se realiza para detectar los posibles mecanismos mediados por RBP2 en la angiogénesis tumoral.
Resultados
de la 102 en estadio I muestras de NSCLC analizados, la expresión de proteínas de alta RBP2 está estrechamente relacionado con el tamaño del tumor (p = 0,030), la alta expresión de HIF-1α expresión elevada de VEGF (p = 0,028), (P = 0,048), aumento de la angiogénesis tumoral (p = 0,033 ) y de mal pronóstico (p = 0,037); alta MVD se asoció con una alta expresión de HIF-1α (P = 0,034), la expresión de alto VEGF (P = 0,001) y un mal pronóstico (P = 0,040). El análisis multivariado indicó que RBP2 tuvo una influencia independiente en la supervivencia de los pacientes con CPCNP en estadio I (P = 0,044). Mediante la modulación de la expresión de RBP2, nuestros hallazgos sugieren que RBP2 agotamiento proteína disminuyó la formación de tubo HUVEC de VEGF-regulación hacia abajo en un medio acondicionado. RBP2 estimuló la regulación de VEGF, que era dependiente de HIF-1α, y activa el HIF-1α a través de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /vía de señalización de Akt. Además, el VEGF aumenta la activación de Akt regulada por RBP2.
Conclusiones
La proteína RBP2 puede estimular la expresión de HIF-1α a través de la activación de la vía PI3K /Akt vía de señalización bajo normoxia y luego estimular VEGF expresión. Estos hallazgos indican que RBP2 puede jugar un papel crítico en la angiogénesis tumoral y servir como una atractiva diana terapéutica contra la agresividad del tumor de pacientes con CPNM en estadio temprano
Visto:. Qi L, Zhu M, Li Sh, Si Lb, Hu Lc, Tian H (2014) Retinoblastoma Binding Protein 2 (RBP2) promueve la angiogénesis inducida por HIF-1α-VEGF de células no pequeñas de cáncer de pulmón a través de la Akt. PLoS ONE 9 (8): e106032. doi: 10.1371 /journal.pone.0106032
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: April 9, 2014; Aceptado: 27 Julio 2014; Publicado: 27 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Qi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. El proyecto fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30571844), la Fundación de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo de la provincia de Shandong (n . 2009GG10002007), y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong (núm ZR2009CM090). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) es una de las neoplasias más comunes que conducen a la muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo [1]. A pesar de numerosas mejoras en las técnicas quirúrgicas y la quimiorradioterapia adyuvante para el CPCNP en las últimas décadas, el pronóstico sigue siendo relativamente pobres [2]. Se ha encontrado una variedad de nuevos marcadores moleculares y las posibles nuevas dianas para el tratamiento de la enfermedad. Sin embargo, la progresión tumoral es un proceso de múltiples etapas y el mecanismo molecular que subyace a la carcinogénesis de pulmón es en gran medida poco clara.
angiogénesis patológica es un evento relativamente temprano en la carcinogénesis, y el aumento de la angiogénesis tumoral se correlaciona con el crecimiento del tumor invasivo y la metástasis y un mal pronóstico [3], [4]. Se ha propuesto que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor-1α inducible por hipoxia (HIF-1α) desempeñan papeles críticos en la angiogénesis tumoral. VEGF, que es el factor angiogénico específico de células endoteliales más ampliamente caracterizado, conduce a aumento de la permeabilidad vascular y desempeña un papel importante en la angiogénesis fisiológica y patológica [5], [6]. La acumulación de pruebas ha demostrado que HIF-1α, una proteína heterodimérica compuesta de HIF-1α y subunidades HIF-1β, se asocia con diversos aspectos de proceso celular y fisiológico. Bajo normoxia, HIF-1α es prolil-hidroxilado, ubiquitylated y degradada en proteasomas mediante la unión al complejo de von Hippel Lindau (VHL). Después de la estabilización hipoxia, HIF-1α se une a HIF-1β en el núcleo e inicia la transcripción de genes diana a través del elemento sensible a la hipoxia [7], [8], [9]. En los últimos años, muchos estudios han sugerido que HIF-1α también podría conducir a la elevada expresión de diversos genes implicados en diversas funciones biológicas bajo normoxia, incluyendo la proliferación celular, apoptosis, migración, invasión y la angiogénesis [10], [11].
Retinoblastoma proteína de unión 2 (RBP2), un miembro de la familia Jarid de las proteínas, es una fosfoproteína nuclear con actividad desmetilasa de lisina 4 de la histona H3 (H3-K4) [12], [13], [14 ]. Parecía que RBP2 ejerce su función en parte por la represión de la transcripción de genes diana implicados en la diferenciación y que la unión a la proteína de retinoblastoma (pRb) convierte RBP2 de un represor transcripcional a un activador transcripcional [15], [16]. La investigación reciente en el cáncer de pulmón se ha establecido que RBP2 está correlacionada con la migración y la invasión tumoral mediante la unión directamente a la integrina β1 (ITGB1) promotores [17]. Otro estudio demostró que RBP2 hasta regula la expresión de N-cadherina y caracol a través de la activación de Akt señalización [18]. Por otra parte, ITGB1 y la señalización de Akt se correlacionan significativamente con la angiogénesis del tumor [19], [20], [21], [22]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren un papel oncogénico para RBP2 en la angiogénesis tumoral y la progresión.
En este estudio, se encontró expresión RBP2 que aumentarse en líneas celulares de cáncer, así como en los tejidos de NSCLC de pacientes. Para investigar más a fondo la posible función de RBP2 en la angiogénesis tumoral, aportar pruebas que muestran que la expresión de alto RBP2 en líneas celulares de cáncer promueve significativamente la angiogénesis tumoral y dilucidar los mecanismos implicados en la activación de la señalización Akt, la inducción de la acumulación de la proteína HIF-1α y la expresión de VEGF en virtud de normoxia.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del hospital Qilu. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente para publicar los detalles del caso, y la adquisición de las muestras de tejido se llevó a cabo según lo prescrito por las directrices institucionales.
Los pacientes
Un total de 102 pacientes (71 hombres y 31 mujeres, edad media 62 ± 3,56 años) con CPCNP en estadio I que fueron sometidos a resección completa del tumor (lobectomía o neumonectomía) con linfáticos regionales disección de los ganglios entre enero de 2006 y diciembre de 2008 en el Departamento de Cirugía Torácica, hospital Qilu, se incluyeron en el estudio. El examen histológico y el grado de diferenciación de las células del cáncer se basan en el sistema de clasificación de la Organización Mundial de la Salud revisada en 2004 y el sistema de estadificación TNM de la UICC 2009. Además, 3 pacientes (2 casos con cáncer de células grandes y 1 caso de cáncer adenoescamosa ) fueron sometidos a resección completa del tumor durante este período fueron excluidos debido al tamaño de la muestra demasiado pequeña. Las características clínicas de los 102 pacientes se presentan en la Tabla 1.
La inmunohistoquímica
tinción inmunohistoquímica para RBP2, HIF-1α, VEGF y CD34 se llevaron a cabo utilizando el método de estreptavidina-peroxidasa . En resumen, las secciones de 4 micras de espesor fueron cortadas de los bloques incluidos en parafina, y los portaobjetos se incubaron con anticuerpos primarios contra RBP2 (Bethyl, Montgomery, TX, USA, dilución 1:100), HIF-1α (BD Biosciences, Pharmingen , Lexington, MA, EE.UU., dilución 1:100), VEGF (A-20; Santa Cruz Biotecnologías, CA, EE.UU., dilución 1:150) y CD34 (sc-19621; Santa Cruz Biotecnologías, CA, EE.UU., dilución 1: 100) la noche a 4 ° C. Posteriormente, se aplicaron los anticuerpos secundarios biotinilados y reactivo de complejo de estreptavidina conjugada con peroxidasa, seguido de contratinción con hematoxilina de Mayer. Los controles positivos y negativos fueron incluidos en cada paso. La expresión de la proteína RBP2 se evaluó mediante el cálculo de una puntuación total inmunotinción como el producto tanto de la puntuación de intensidad (0, tinción negativa; 1, tinción débil; 2, tinción moderada; 3, fuerte tinción) y la puntuación de porcentaje (0, ninguno; 1, & lt; 10%; 2, 10 a 50%; 3, 51 a 80%; 4, & gt; 80%). Por lo tanto, la puntuación total varió de 0 a 7. Los immunostained diapositivas fueron evaluados por dos investigadores independientes de una manera ciega y reevaluados por estos investigadores bajo un microscopio multicabezal en los casos discordantes para llegar a un consenso. Para la evaluación de la tinción positiva de RBP2, se puntuaron al menos 3 secciones o áreas de cada muestra.
Para la cuantificación de la angiogénesis asociada a tumores, la densidad de microvasos (MVD) se evaluó contando las células endoteliales immunostained CD34-positivas. células endoteliales CD34-positivas, así como grupos de células endoteliales que se separan claramente de los microvasos adyacentes se midieron como microvasos contables [23], [24], [25]. Para cuantificar el MVD, cinco áreas altamente vasculares fueron escaneadas a baja potencia para identificar los "puntos calientes" y se contaron microscópicamente en alta potencia (200 aumentos) campos. El recuento promedio de diez campos de visión se registró como el MVD final (dos observadores y cinco puntos calientes vasculares cada uno).
El valor de corte para RBP2 y expresión MVD se determina en base a un valor medido a través de una heterogeneidad de log análisis estadístico rango con respecto a la supervivencia global [26]. El marcador final de 4 tinción fue elegido como el punto de corte para la discriminación entre la expresión de alto y de bajo RBP2. Por lo tanto, los tumores con un marcador final de tinción ≥4 se definieron como la sobreexpresión de la proteína RBP2. Los tumores con microvasos ≥57 fueron clasificados como de alto MVD; tumores con microvasos & lt; 57 fueron clasificados como de bajo MVD. HIF-1α fue considerado sobreexpresa cuando & gt; 1% de los núcleos eran positivos como se describe antes [27]. Los tumores con un marcador final de tinción ≥3 se definieron como la sobreexpresión de la proteína VEGF [28].
Líneas Celulares, condiciones de cultivo, transfección y ARN interferente pequeño Tratamiento
El adenocarcinoma de pulmón humano A549 líneas de células , SPCA-1 y H1975 se adquirieron en el Instituto Nacional del cáncer (Bethesda, MD, EE.UU.). La línea de células escamosas de pulmón humano SK-MES-1 y la línea de células del epitelio bronquial humano BEAS2B se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Los, A549, células SPCA-1 y H1975 BEAS2B se cultivaron en Park Memorial Institute de Roswell (RPMI) 1640 (Hyclone, Logan, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS; Gibco, Gaithersburg, EE.UU.). Los SK-MES-1 en las células se cultivaron en MEM (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 20% FBS. HUVECs se cultivaron en medio de crecimiento de células endoteliales M199 suplementado con 15% FBS, 1 mg /suplementos de crecimiento séricos bajos ml y glutamina 2 mM. Todas las células se incubaron en 5% de CO
2 a 37 ° C. RBP2 se sobreexpresa usando pcDNA3-HA-RBP2, fue adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.) un generoso regalo de W.G Kaelin [12], y siRNA para RBP2. El plásmido pcDNA3-HA-HIF-1α fue adquirido de Addgene (plásmido 18949) [29], y siRNA para se adquirió de Dharmacon ARN Tecnologías (Chicago, IL, EE.UU.) HIF-1α (ONTARGET más piscina de SMART, L-004018) . El plásmido pcDNA3 Myr HA Akt1 se adquirió de Addgene (plásmido 9008) [30]. Para el tratamiento de pequeños ARN de interferencia (siRNA), las células se incubaron en placas de 6 pocillos (3,0 x 10
5 /pocillo) durante la noche y después de la transfección se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las siguientes secuencias de siRNA se utilizaron en este estudio: RBP2 siRNA1 5'-UUGUGUACUCGUCAAACUCUACUCC-3 '; RBP2 siRNA2 5'-UUAACAUGCCGGUUAUCCAGGCUCU-3 '; siRNA control 5'-UUCUCCGAAGGUGUCACGUTT -3 '.
Preparación de Condicionada
Medio
Las células células RBP2-siRNA1 H1975, células y RBP2-H1975 siRNA2 control de siRNA-H1975 fueron cultivadas en suero libre condiciones en medio RPMI 1640 durante 24 h, respectivamente. A continuación, se recogió el sobrenadante, se centrifugó, se filtró a través de un filtro de 0,22 mm (Millipore, Billerica, EE.UU.) y almacenados a -20 ° C hasta que se usaron en el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y la formación del tubo.
tubo endotelial celular formación ensayo
El ensayo de formación de tubo se realizó como se describió anteriormente [31]. Brevemente, HUVECs (1 × 10
4 /pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas con Matrigel (50 l) y después se incubó a 37 ° C durante 1 h para polimerizar. HUVEC (1 × 10
4 células) se sembraron en pocillos con diferentes medios de comunicación condicionado de células RBP2-siRNA1 H1975, células RBP2-siRNA2 H1975 y células de control de siRNA-H1975. Se añadió una inhibidor de VEGFR (malato de sunitinib, 2,5 M) [32] para el medio del control acondicionado células y siRNA H1975 recombinante humano VEGF-165 (rhVEGF165, Millipore, Billerica, MA, EE.UU., 2 ng /ml) se añadió a el medio condicionado de las células RBP2-siRNA2 H1975. Las placas de 96 pocillos se incubaron durante 6 h, y a continuación, la formación del tubo fue fotografiado bajo un microscopio invertido. La capacidad de formación de tubo se cuantificó contando el número total de tubos completos, y el promedio de tres × azar 200 campos por pocillo se registró como el valor por pocillo.
VEGF inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
los niveles de VEGF en los diferentes medios acondicionados se determinaron utilizando un kit de ELISA (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante y se analizaron usando un lector Labsystems Multiscan. El experimento se repitió dos veces con mediciones por triplicado en cada experimento.
SDS-PAGE y Western Blot
Las proteínas se extrajeron usando tampón de lisis RIPA. Igual cantidad (20 g) de proteína se sometieron a análisis de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sondearon con anticuerpos primarios contra RBP2 (Tecnologías de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.), HIF-1α (Tecnologías de Señalización Celular, Danvers, MA , EE.UU.), VEGF (Santa Cruz biotecnologías, Santa Cruz, CA, EE.UU.), Akt y fosfo-Akt (Ser-473) (Tecnologías de señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.). LY294002 fue adquirido de Beyotime Instituto de Biotecnología (Haimen, China). Las bandas de proteínas se detectaron utilizando el método de quimioluminiscencia (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). La densidad de banda óptica se cuantificó (Imager de Alfa Corporation, San Leandro).
La extracción de RNA, transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa
El ARN celular total de las células de diferentes tratamientos fue extraído por medio de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). El ADN complementario (ADNc) se sintetizó por el Sistema de superíndice III primer capítulo de síntesis (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) se realizó utilizando SYBR Green Supermix (Bio-Rad) para HIF-1α y VEGF de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de HIF-1α y ARN VEGF mensajero (ARNm) se normalizaron al nivel de expresión β-actina humana y calcularon utilizando el
2 (- ΔΔCT) método [33]. Los cebadores para la HIF-1α fueron 5'-TTTTTCAAGCAGTAGGAATTGGA-3 '(hacia delante) y 5'-GTGATGTAGTAGCTGCATGATCG-3' (hacia atrás). Los cebadores para VEGF fueron 5'-ATCTTCAAGCCATCCTGTGTGC- 3 '(hacia delante) y 5'-CAAGGCCCACAGGGATTTTC-3' (hacia atrás). Los cebadores para la β-actina fueron 5'-GCATCCACGAAACTACCT-3 '(hacia delante) y 5'-GAAAGGGTGTAACGCAAC-3' (hacia atrás). Las condiciones del ciclo fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 15 s
Siga. -up
Todos los pacientes dados de alta del hospital fueron seguidos en el ambulatorio cada 3 a 6 meses. La evaluación de seguimiento de los pacientes consistió en el examen físico, análisis de sangre, tomografía computarizada, ecografía, radiografía de tórax y broncoscopia con fibra óptica, si es necesario. El seguimiento se completó en todos los pacientes hasta diciembre de 2013, y el período medio de seguimiento fue de 66 meses (rango: 16~96 meses).
Análisis estadísticos
Todos los análisis estadísticos fueron examinados con el programa SPSS 17,0 software estadístico. Los datos cuantitativos se expresan como media ± desviación estándar para cada grupo, y las comparaciones se realizaron mediante la prueba t de Student. Se realizaron pruebas de chi-cuadrado para examinar la asociación entre RBP2, MVD y diversos factores clínico-patológicos. La correlación entre MVD intratumoral y los niveles de proteína RBP2 se analizó mediante una prueba no paramétrica (prueba de Mann-Whitney). El tiempo de seguimiento fue censurado si el paciente se perdió durante el seguimiento. Las curvas de supervivencia se extrajeron utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank. Se utilizó un análisis de regresión multivariante de Cox para identificar los factores pronósticos independientes.
valores de p se calcularon a partir de pruebas estadísticas de dos colas. Se consideró una diferencia estadísticamente significativa cuando
P
. & Lt; 0,05
Resultados
1. Correlación de la proteína RBP2 y MVD con factores clinicopatológicos
La inmunohistoquímica con anticuerpos RBP2 (Fig. 1A y la Fig. 1B) y HIF-1α (Fig. 1D y la Fig. 1E) mostraron una reacción positiva en el núcleo, y anticuerpos VEGF (Fig. 1F y Fig. 1G) mostraron una reacción positiva en el citoplasma de las células tumorales. RBP2 se detectó como se sobreexpresa en 52 (51%) de 102 muestras de NSCLC de acuerdo con los criterios anteriormente mencionados. Las relaciones entre la expresión de proteínas RBP2 y los factores clínico-patológicas fueron examinados por la prueba de chi-cuadrado y nuestros datos muestran que la sobreexpresión RBP2 se asoció con el tamaño del tumor (
P = 0,030
), la alta expresión de HIF-1α (
P
= 0,028) y la expresión de VEGF alta (
P = 0,048
). Sin embargo, no hubo significación estadística en las relaciones entre la expresión RBP2 y otras variables clínico-patológicas (
P Hotel & gt; 0,05, Tabla 1)
(A) la expresión de proteínas de alta RBP2 en el cáncer de células escamosas. ; (B) la expresión de proteínas de alta RBP2 en el adenocarcinoma; (C) la expresión de proteínas RBP2 negativo en el CPNM; (D) la expresión de HIF-1α alta en el cáncer de células escamosas; (E) de alta HIF-1α expresión de la proteína en el adenocarcinoma; (F) la expresión alta de VEGF en el cáncer de células escamosas; (G) de alta VEGF en el adenocarcinoma; (H) de alta expresión de CD34 en el cáncer de células escamosas; (I) la expresión de alto CD34 en adenocarcinoma.
intratumoral MVD se cuantificó contando las células endoteliales CD34-positivas en la misma serie de tejidos de cáncer de pulmón (Fig. 1H y la Fig. 1I), y el promedio número de microvasos en diez campos se contó como una medida de MVD para cada muestra. El número medio de microvasos de MVD en cada muestra tumoral varió ampliamente, de 6,4 a 102. Como se ha descrito anteriormente, los tumores con microvasos ≥57 fueron clasificados como de alto MVD, y 46 casos (45,1%) mostraron una alta MVD. La prueba de chi-cuadrado mostró que la alta MVD se asoció con alta expresión de HIF-1α (
P = 0,034
) y la expresión de VEGF alta (
P
= 0,001), pero no se observaron correlaciones significativas entre MVD y otros factores clinicopatológicos (
P
& gt; 0,05, Tabla 1).
la tinción inmunohistoquímica de las secciones en serie de tejidos de cáncer mostró que la mediana MVD fue 59,6 en el grupo de alta expresión de RBP2 (7,8 a la 102) y 35,4 en el grupo de baja expresión RBP2 (6,4 a 94). Por otra parte, el análisis estadístico demostró que la alta MVD fue detectado con mayor frecuencia en los tumores con sobreexpresión de la proteína RBP2 que en aquellos sin sobreexpresión (
P = 0,033
, prueba de Mann-Whitney, Fig. 2A). Estos datos sugieren que RBP2 puede promover la angiogénesis patológica en la progresión del NSCLC.
(A) Correlación entre la expresión RBP2 y MVD para la etapa I NSCLC. CPNM con la expresión de proteínas de alta RBP2 mostraron significativamente mayor MVD intratumoral que aquella con la baja expresión de proteínas RBP2 (
P = 0,033
, Mann-Whitney U test). curvas (B) de Kaplan-Meier de supervivencia global demostró una baja tasa de 5 años de supervivencia global en pacientes con sobreexpresión de la proteína RBP2 (53,8% frente a 72,0%,
P = 0,037
). curvas (C) de Kaplan-Meier de supervivencia global demostró una baja tasa de 5 años de supervivencia global en pacientes con alta MVD (52,2% frente a 71,4%,
P = 0,040
).
un análisis de Kaplan-Meier de supervivencia global también demostró una tasa de supervivencia global a los 5 años pobres en pacientes con sobreexpresión de la proteína RBP2 (53,8% frente a 72,0%,
P = 0,037
; Fig. 2B) y alta MVD ( 52,2% frente a 71,4%,
P = 0,040
, Fig. 2C). Todas las variables estadísticamente significativas evaluados en el análisis univariado se incluyeron en un modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox. El análisis multivariante se indica que sólo RBP2 tuvo una influencia independiente en la supervivencia de los pacientes con CPCNP en estadio I (
P = 0,044
, Tabla 2).
2. RBP2 se sobreexpresa en líneas celulares de cáncer humano
El nivel de proteína RBP2 estaba regulado en marcha en líneas celulares de cáncer de pulmón SK-MES-1, A549, PEAC-1 y H1975 en comparación con la línea de células del epitelio bronquial humano BEAS2B (Fig. 3A). El nivel de expresión de RBP2 en H1975 células fue mayor que en BEAS2B, SK-MES-1, SPCA-1 y células A549.
(A) RBP2 se sobreexpresa en líneas celulares de NSCLC humanos SK-MES-1 , A549, SPCA-1 y H1975 en comparación con las células BEAS2B línea de células epiteliales bronquiales humanas. (B) Efectos de RBP2 siRNA1, RBP2 siRNA2 y pcDNA3-HA-RBP2 sobre la expresión de la proteína RBP2.
Se emplearon dos piezas de siRNAs y pcDNA3-HA-RBP2 focalización RBP2 para un funcional análisis en H1975 y las células SK-MES-1. Como se muestra en la Fig. 3B, los resultados demostraron que RBP2-siRNA1 y RBP2-siRNA2 podrían significativamente disminuye la expresión de la proteína RBP2 en células H1975. Además, los dos siRNAs mostraron casi los mismos efectos de ARNi, mientras que el siRNA de control negativo no afectó significativamente la expresión de RBP2. Mientras tanto, pcDNA3-HA-RBP2 significativamente hasta regulada la expresión de RBP2 en SK-MES-1 en las células, mientras que pcDNA3-HA no afectó significativamente la expresión RBP2. Por lo tanto, se seleccionaron RBP2-siRNA1, RBP2-siRNA2 y pcDNA3-HA-RBP2 estudiar más a fondo las funciones de la proteína RBP2 in vitro.
3. El agotamiento de la proteína RBP2 disminuye la formación de tubo HUVEC inducida por medio condicionado
Para evaluar la importancia funcional de RBP2 en la angiogénesis tumoral, RBP2 fue derribado en líneas celulares H1975. Los resultados demostraron que el número de tubos completos inducidos por el medio de las células RBP2-siRNA1 H1975 (12,33 + 3,06) y células RBP2-siRNA2 H1975 (9,67 + 1,53) acondicionado se redujo significativamente en comparación con la de las células control siRNA H1975 (38,67 2,52, figura 4 A-D,
P Hotel & lt; 0,01)
ensayo de formación de tubo:.. (A) las células de control siRNA-H1975; (B) células RBP2-siRNA1 H1975; (células C) RBP2-siRNA2 H1975. (D) Análisis cuantitativo de la formación de tubos por HUVECs inducidas por medio condicionado; (E) El descenso de regulación de la proteína RBP2 disminuyó los niveles de expresión de VEGF en medios acondicionados. (F) La formación de tubos inducida por el medio de control de siRNA células H1975 acondicionado fue bloqueada por el inhibidor de VEGFR (malato de sunitinib, 2,5 M). (G) La formación del tubo reducción inducida por el medio de las células RBP2-H1975 siRNA2 acondicionado fue rescatado mediante la adición de VEGF-165 (2 ng /ml).
4. El descenso de regulación de la proteína RBP2 disminuye los niveles de expresión de VEGF en medio condicionado
Teniendo en cuenta el hecho de que la alta MVD se asoció con una alta expresión del VEGF (prueba de chi-cuadrado,
P = 0,001
, Mesa 1), el próximo explorado la asociación entre los niveles de proteína VEGF RBP2 y en medio acondicionado usando un ensayo ELISA. Los resultados demostraron que los niveles de proteína VEGF en los medios de RBP2-siRNA1 acondicionado (0,99 ± 0,11 ng /ml) y RBP2-siRNA2 (0,94 ± 0,14 ng /ml) H1975 células fueron significativamente más bajos que en las células control siRNA H1975 (1,87 ± 0,10 ng /ml), (Fig 4E,
P
. & lt; 0,01). Además, nuestros resultados sugieren que la formación de tubos inducida por el medio de las células de control de siRNA H1975 acondicionado fue bloqueada con la adición de un inhibidor de VEGFR (malato de sunitinib, 2,5 M, 10,33 + 2,22,
P
& lt; . 0.01, Fig 4F); la formación de tubos reducida inducida por el medio de las células RBP2-siRNA2 H1975 acondicionado fue rescatado por la adición de VEGF-165 (2 ng /ml, 41,03 + 3,25,
P
& lt; 0,01, Fig 4G.).
5. RBP2 estimula HIF-1α y mRNA de VEGF y la expresión de proteínas
HIF-1α es un factor de transcripción importante y desempeña un papel crucial en la angiogénesis tumoral. Por otra parte, el factor de transcripción HIF-1α regula el nivel de expresión de varios genes sensibles a la hipoxia, incluyendo VEGF [11]. Hemos investigado si la próxima RBP2 podría afectar a la expresión de HIF-1α en las células SK-MES-1-expresando RBP2 ectópicos. Como se muestra en la Fig. 5A, la expresión forzada de RBP2 regulado hasta la expresión de la proteína HIF-1α en una forma dependiente del tiempo en condiciones de normoxia, y el valor máximo de la expresión de HIF-1α apareció a las 36 horas después de la transfección se llevó a cabo. Sin embargo, HIF-1α era inestable y degradadas por proteasomas bajo normoxia [9], y nuestros resultados sugieren que la expresión de HIF-1α disminuyó después de la transfección se llevó a cabo 48 horas. Por lo tanto, para investigar la posible regulación de la angiogénesis tumoral mediante RBP2, se analizó la expresión de los factores de transcripción HIF-1α y VEGF en las células que sobreexpresan RBP2 y NSCLC -agotadas bajo normoxia a las 36 horas después de la transfección. Como se muestra en la Fig. 5B y Fig. 5C, la baja regulación de RBP2 en H1975 células conducido a la disminución en la expresión de HIF-1α y VEGF, mientras que la expresión RBP2 ectópico en SK-MES-1 en las células de pcDNA3-HA-RBP2 llevó a la sobre regulación de HIF-1α y VEGF.
(a) RBP2 regulado hasta la proteína HIF-1α en una forma dependiente del tiempo en condiciones de normoxia. (B) El agotamiento de RBP2 disminuyó la expresión de HIF-1α y VEGF en células H1975. (C) Sobre regulación de RBP2 aumentó la expresión de HIF-1α y VEGF en SK-MES-1 en las células. (D) Real-time RT-PCR mostró que los niveles de expresión de ARNm de HIF-1α y VEGF se redujo significativamente en las células H1975 RBP2 empobrecido en comparación con las células de control. (E) en tiempo real RT-PCR mostró que los niveles de expresión de ARNm de HIF-1α y VEGF fueron significativamente superiores en las células SK-MES-1 RBP2 sobreexpresan.
Los niveles de expresión de ARNm de HIF -1α (
P
siRNA1 = 0,006,
P
siRNA2 = 0,001) y VEGF (
P
siRNA1 = 0,000,
P
siRNA2 = 0,000) fueron significativamente disminuida en las células H1975 RBP2-agotado. Por otra parte, HIF-1α (
P
= 0,001) y VEGF (
P
= 0,000) se incrementaron en RBP2 sobreexpresan SK-MES-1 en las células en comparación con las células de control (Fig. 5D y la Fig. 5E). Estos resultados sugirieron que RBP2 juega un papel importante en el proceso de la angiogénesis tumoral a través de la regulación de HIF-1α y VEGF.
6. RBP2 la inducción de VEGF es dependiente de HIF-1α
Para confirmar el papel de RBP2 en la regulación de HIF-1α en las células NSCLC, nos modulada expresión de HIF-1α mediante la transfección de células con un siRNA contra HIF-1α (SI -HIF-1α) y un plásmido pcDNA3-HA-HIF-1α, y se evaluaron la expresión de VEGF después de 36 horas. Como se muestra en la Fig. 6A y Fig. 6B, desmontables expresión de HIF-1α en las células que expresan ectópicos RBP2 SK-MES-1 conducido a la baja regulación de VEGF en comparación con la lucha no-siRNA de control; sobre regulación de la expresión de HIF-1α en las células H1975-RBP2 empobrecido llevado a la sobre regulación de VEGF. Estos resultados indican que la angiogénesis tumoral RBP2 mediada de células de NSCLC parcialmente podría ser regulada a través de la activación de HIF-1α.
(A) El agotamiento de HIF-1α con un siRNA contra HIF-1α en RBP2- sobreexpresan SK-MES-1 en las células dirigidas a la baja regulación de VEGF en comparación con el control de mezcla aleatoria no específica siRNA. (B) Sobre regulación de la expresión de HIF-1α en las células RBP2-H1975 siRNA2 llevado a la sobre regulación de VEGF.
7. RBP2 activa HIF-1α a través de la vía PI3K Akt /señalización
Un estudio reciente sugiere que regula RBP2 N-cadherina y el caracol a través de la activación de la señalización Akt [18]. Además, en condiciones de normoxia, la expresión y la actividad de HIF-1α y los factores angiogénicos secretados posteriores en el cáncer pueden ser anormalmente hasta reguladas por diferentes vías de señalización [34], [35], [36] que implica Akt y sus efectores [20], [22]. Por lo tanto, la hipótesis de que regula RBP2 HIF-1α través de la activación de la señalización de Akt, y se buscó además para detectar los mecanismos de señalización implicados en la angiogénesis tumoral mediada por RBP2. Nuestros resultados revelaron que el silenciamiento de la expresión RBP2, ya sea con RBP2-siRNA1 o RBP2-siRNA2 en H1975 células disminuyó significativamente la fosforilación de Akt, mientras que la expresión forzada de RBP2 con pcDNA3-HA-RBP2 en SK-MES-1 en las células aumentaron la actividad de Akt (Fig. 7A). Por otra parte, cuando se expresa una forma constitutivamente activa de Akt en células RBP2-siRNA2 H1975, la expresión de HIF-1α y VEGF fueron más altas con el control; la PI3K /Akt inhibidor LY294002 inhibió significativamente la expresión de HIF-1α y VEGF en pcDNA3-HA-RBP2 SK-MES-1 en las células (Fig. 7B). Estos datos sugieren que RBP2 promueve la angiogénesis tumoral a través de la activación de la vía PI3K /Akt vía de señalización en las líneas celulares de NSCLC.
(A) silenciamiento de la expresión RBP2 en H1975 células disminuyó significativamente la fosforilación de Akt, y la expresión forzada de RBP2 en SK-MES-1 en las células aumentó la actividad de Akt. (B) Cuando Akt se activa constitutivamente en RBP2-siRNA2 H1975, la expresión de HIF-1α y VEGF se aumentó en comparación con el control. El inhibidor de PI3K LY294002 /Akt inhibe significativamente la expresión de HIF-1α y VEGF en pcDNA3-HA-RBP2 SK-MES-1 en las células. (C) Westernblots que muestra el curso temporal de la fosforilación de Akt en células RBP2-siRNA2 H1975 debido a VEGF-165 (25 ng /ml). (D) en presencia de la estimulación de VEGF-165 recombinante humana, la activación de Akt se incrementó en las células RBP2-siRNA2 H1975 y células RBP2 sobreexpresan SK-MES-1 (25 ng /ml, 30 minutos).
VEGF se ha demostrado que es un potente activador de Akt en algunos casos [37]. A continuación exploró si el VEGF podría activar Akt. Como se muestra en la Fig. 7C, el tratamiento de células RBP2-siRNA2 H1975 con VEGF-165 recombinante humano (25 ng /ml) aumentó la activación de Akt dentro de 15 a 30 minutos. Por lo tanto, para investigar la posible regulación de Akt por el VEGF, se analizó la expresión de p-Akt a los 30 minutos después de la adición de VEGF recombinante humana-165. Como se muestra en la Fig. 7D, en presencia de estimulación de VEGF-165 recombinante humana, la activación de Akt se incrementó en las células H1975 RBP2-agotado y células RBP2 sobreexpresan SK-MES-1 (25 ng /ml, 30 minutos).