Extracto

Se describe la aplicación con éxito de un enfoque novedoso para la generación de inhibidores de Myc diméricos mediante la modificación y reversible que une dos moléculas pequeñas descritos anteriormente. Se sintetizaron dos bibliotecas dirigidas de monómeros, cada uno compuesto por un ligando, un conector, y un elemento de engarce bioorthogonal, para identificar la configuración dímero óptima requerida para inhibir Myc. Se identificaron combinaciones de monómeros, denominados inhibidores de dímeros de autoensamblaje, que muestran la inhibición sinérgica del crecimiento celular Myc-dependiente. Se confirmó que estos inhibidores de dímeros se unen directamente a Myc bloquear su interacción con Max y afectan a la transcripción de los genes dependientes MYC. combinaciones de control que son incapaces de formar un dímero no muestran efectos sinérgicos en estos ensayos. Colectivamente, estos datos validan nuestra nueva aproximación para generar los inhibidores más potentes y selectivos de Myc por auto-ensamblaje de los componentes de afinidad más pequeños, más bajos. Este enfoque proporciona una oportunidad para el desarrollo de nuevas terapias contra Myc y otras proteínas desafiante:. Clases de interacción de proteínas (PPI) de destino

Visto: Wanner J, D Romashko, Werner DS, mayo EW, Peng Y, R Schulz, et al. (2015) Vinculación reversible de dos distintos inhibidores de molécula pequeña de Myc Genera un inhibidor Dimérica con potencia mejorada que es activo en Myc sobre-expresión de líneas celulares de cáncer. PLoS ONE 10 (4): e0121793. doi: 10.1371 /journal.pone.0121793

Editor Académico: Alessandro Datti, Instituto de Investigación Lunenfeld-Tanenbaum, Canada |
Recibido: 8 de Diciembre, 2014; Aceptado: January 19, 2015; Publicado: 15 Abril 2015

Derechos de Autor © 2015 Wanner y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Coferon, Inc. proporcionó apoyo en forma de salarios de los autores JW, DR, DSW, EWM, YP, RS, KWF, SR, MP y ST y LDA en el momento del estudio. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección "Contribuciones de autor '

Conflicto de intereses:. JW, DR, DSW, EWM, YP, RS, KWF, SR, MP, ST y LDA están afiliados a Coferon Inc en el momento del estudio. LDA está afiliada con Biosciences, Inc. Asamblea MP, FB y DEB son fundadores y accionistas de Coferon, Inc. JW, KWF, DSW y LDA son autores en una solicitud de patente presentada por Coferon Inc, que abarca las moléculas descritas en este manuscrito. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.

Introducción

El uso de pequeñas moléculas como fármacos para inhibir los objetivos del cáncer ha hecho enormes progresos en los últimos 20 años, con numerosos fármacos en uso clínico rutinario en una amplia gama de diferentes tipos de cáncer. Este enfoque ha sido particularmente exitoso para los objetivos enzimáticos, en los que el sitio de unión es un bolsillo distinto bien definido en la proteína que se presta para el diseño racional de inhibidores muy potentes. Sin embargo, los esfuerzos para ampliar el uso de moléculas pequeñas para apuntar a áreas superficiales más grandes o más desordenadas que son críticos para la regulación de las interacciones proteína-proteína (PPI) se han reunido con más éxito limitado. inhibidores prototípicos PPI tienden a ser grandes en tamaño y tienen una mala droga como propiedades y utilidad por lo que han limitado en la clínica. Es claro entonces que se necesitan enfoques innovadores para habilitar completamente el descubrimiento de medicamentos para el gran número de los que se consideran generalmente clases objetivo terapéuticamente relevantes, pero undruggable en muchas áreas de la enfermedad.

Como un enfoque para abordar la droga más desafiante objetivos que están desarrollando una nueva tecnología para permitir el autoensamblaje de moléculas pequeñas en grandes inhibidores de dímeros, primero descritos por Barany et al [1]. La plataforma tecnológica permite la entrega de moléculas dímeras con una gran superficie de unión para inhibir dianas biológicas que han desafiado con frecuencia los enfoques tradicionales de química médica (fig. 1A). Los dímeros se componen de dos monómeros, comprendiendo cada uno un ligando, un conector, y un elemento de engarce bioorthogonal. En condiciones fisiológicas, los monómeros pueden equilibrar rápidamente para formar dímeros a través de la formación de enlaces covalentes reversibles entre los elementos de engarce. Los enlazadores están diseñados para ser restos de bajo peso molecular que se pueden anexar fácilmente a dirigido específicamente ligandos a través de conectores adecuados. Los ligandos, enlazadores y conectores todo se pueden modificar para ajustar las propiedades de los monómeros y permiten la optimización de buenas propiedades similares a fármacos para conseguir el perfil farmacocinético deseado. Los monómeros optimizados pueden ser absorbidos, distribuidos a los tejidos, y entran en las células. Una vez dentro de la célula, los monómeros pueden unirse a la diana directamente, permitiendo que el objetivo de conducir auto-ensamblaje del dímero. Alternativamente, los monómeros pueden volver a equilibrar el interior de la célula para formar el dímero en solución, y el dímero pueden unirse directamente e inhibir el objetivo. La medida en que cada vía contribuye al efecto inhibidor depende de las afinidades intrínsecas de los ligandos para sus respectivos sitios de unión en la diana, la longitud del conector, y la constante de dimerización de los enlazadores utilizados. De cualquier vía conduce a la proteína diana están vinculados por las dímeros con una mayor afinidad y una mayor especificidad que los monómeros constituyentes. La principal ventaja de este enfoque es que permite la generación intracelular de un gran inhibidor de molécula, muy adecuado para la orientación superficies de interacción proteína-proteína, mientras se mantiene la capacidad de capitalizar sobre las propiedades similares a las drogas de los pequeños componentes de moléculas.

A) representación esquemática del enfoque dímero auto-montaje. monómeros individuales (azul y verde) compuestas de ligando, conector y un enlazador bioorthoganol emparejado se entregan a las células, cruzar la membrana plasmática y reaccionar para formar un inhibidor dimérica activa en las células. montaje Dimer puede producir en el medio celular o en la diana de interés. B) Representación esquemática de los equilibrios ácido /diol borónico utilizadas durante la formación de dímero. trigonal plana, especies neutras están en equilibrio con las especies tetraédricas quirales cargadas. Para un diol dado, en el medio celular a un pH de 7,4 los equilibrios son determinados por los pKas de los ácidos borónicos empleadas y por los pKas de los ésteres de boronato formados. Racemización de las especies quirales cargada ocurre muy rápidamente y la diana biológica seleccionará para el dímero más preferido. C) Resumen de diseño de la biblioteca: Estructuras de las dos moléculas de partida C01 (izquierda) y C02 (derecha) y posiciones de fijación; conectores son o cadenas de alquilo o PEG-unidades; R y R 'están unidos a los conectores a través de enlaces amida o de carbono; detalles sintéticos de miembros de la biblioteca seleccionados se proporcionan en los procedimientos experimentales complementarios.

Una variedad de conectores bioorthogonal son susceptibles de esta plataforma tecnológica. Nosotros y otros han descrito enlazadores de ácido borónico de arilo de átomos-eficiente que puede dimerize reversiblemente con diversos catecoles y
cis
alquilo diol socios en condiciones acuosas [1, 2, 3, 4] (Fig. 1B). Los ácidos borónicos y los dioles asociadas establecer el equilibrio rápidamente, con constantes de dimerización típicamente en el intervalo M a mM [5, 6]. Es importante destacar que la constante de dimerización se puede ajustar a través de sustituyentes. Por ejemplo, la introducción de efectos estéricos a cada componente enlazador desfavorece la hidrólisis del éster boronato, desplazando el equilibrio monómero-dímero hacia la formación de dímero, lo que resulta en constantes de dimerización mejoradas [7, 8] y puede traducirse en una mejora de las potencias del inhibidor dimérica resultante. Tanto el ácido bórico y el diol enlazadores se pueden adjuntar a ligandos deseados a través de una amplia gama de restos de conectores utilizando métodos sintéticos fáciles. Esta tecnología se puede aplicar a cualquier diana que comprende dos o más sitios de unión proximales que podrían ser puenteados con ligandos que llevan los conectores y los enlazadores adecuados. Normalmente los dímeros se disocian de la diana con más lenta fuera de tasas, lo que conduce a la inhibición prolongada de la diana.

Aquí hemos aplicado esta tecnología para desarrollar inhibidores contra el c-Myc (en adelante como Myc) la transcripción factor. Myc pertenece a una familia de factores de transcripción cuyos miembros otra incluir MycL y MYCN y estos factores de transcripción tienen un papel importante en el control de la proliferación celular, la supervivencia y la diferenciación [9, 10]. Myc está estrechamente regulada normalmente, pero su nivel de expresión se puede aumentar de manera significativa en el cáncer, y esto se piensa que es un importante motor de la biología del tumor. actividad Myc puede desregulado a través de aumento de la expresión por cualquiera de amplificación de genes [11] o el gen de translocación [12]. En los casos más limitados, en particular en el linfoma de Burkitt, la
Myc
gen está mutado [13, 14], que puede dar lugar a una proteína más estable [15, 16]. Para funcionar biológicamente, Myc forma un heterodímero con su socio Max, y el dímero resultante se une al promotor motivos específicos, recluta a los complejos de activación de la transcripción, y en última instancia activa los genes Myc-dependientes. Está claro que la inactivación de Myc puede conducir a efectos antitumorales significativos en modelos de ratón de cáncer [17, 18]. Además, la inactivación funcional de Myc en el tejido normal usando una forma dominante negativa (OmoMyc) es bien tolerado [19], apoyando el concepto de que la orientación terapéuticamente esta vía puede ser un medio para tratar el cáncer
.
Numerosos directa y métodos indirectos se han desarrollado para orientar la biología Myc [20]. Recientemente pequeñas moléculas que inhiben la familia de las proteínas BET lector epigenéticos y el impacto
Myc
la expresión de genes han demostrado una excelente eficacia preclínica en modelos de tumores dependientes de Myc [21, 22, 23] y que están actualmente en ensayos clínicos. Varios grupos han informado también de inhibidores de moléculas pequeñas que se unen directamente a Myc e inhibir su interacción con Max [24, 25]. Estos inhibidores, introducidos originalmente por Prochownik et al, se unen con afinidad micromolar e interrumpen la interacción Myc: Max, así como la proliferación de inhibición de líneas celulares tumorales que expresan Myc. Dos de tales moléculas pequeñas, 10058-F5 y 10074-G5, se han demostrado que se unen de forma independiente y al mismo tiempo a la conformación desordenada de la base de dominio de la cremallera de hélice-bucle-hélice leucina (bHLHZip) de Myc, inhibiendo así su interacción con Max [26 , 27, 28]. Además, se han descrito cerca de 10058 análogos-F4 y 10074-G5 con potencias similares y mejoradas [29, 30, 31, 32, 33].

Hemos utilizado nuestra plataforma tecnológica para desarrollar auto-montaje dimérica inhibidores de Myc utilizando estas moléculas pequeñas descritos anteriormente como nuestra partir ligandos individuales. Estas moléculas son, además, modificadas con conectores adjuntas y enlazadores diseñados para facilitar la formación de dímero reversible. Se demuestra que nuestros nuevos inhibidores se unen directamente a Myc con afinidad mejorada sobre los inhibidores de pequeñas moléculas existentes, e interrumpir la interacción Myc: Max
in vitro
, y el impacto expresión de genes regulados MYC en las células resultantes en los efectos antiproliferativos en Myc-expresando líneas celulares tumorales.

Materiales y Métodos

Compuesto Síntesis

Una descripción completa de rutas sintéticas para las moléculas descritas en este documento se puede encontrar en S1 archivo .

Cultivo celular, proliferación y, Daudi células (CCL-213), Raji (CCL-86) y MV4-11 (CCL-9591) Sinergia análisis

K562 (CCL-243) fueron comprados directamente de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y cultivaron de forma rutinaria en las condiciones recomendadas. El crecimiento y la proliferación se determinó mediante el uso de la célula Titer 96 Aqueous One Solution (Promega, Madison, WI). Todas las células se cultivaron en placas a 10.000 células por pocillo en medio de crecimiento en una placa de claro de 96 pocillos. Después se añadieron 3 días de tratamiento con el compuesto reactivo, y la absorbancia a 490 nm se leyó después de la incubación durante 4 horas a 37 ° C. Una placa de control de compuesto diluido en medios de comunicación a las mismas concentraciones se trató de una manera similar y estos valores se resta de los datos de la placa de células para controlar de ninguna interferencia de compuesto en el ensayo. La sinergia se determinó utilizando el modelo de independencia de Bliss.

La lisis celular y Western Blot

células tratadas con la droga se lavaron en PBS y se lisaron en tampón RIPA (complementado con proteasa y los inhibidores de la fosfatasa) (Sigma, St. Louis, MO) sobre hielo durante 30 minutos. Las concentraciones totales de proteína se determinaron usando un kit BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Se realizaron transferencias Western mediante la resolución de proteínas por SDS-PAGE y transferencia a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se sondearon con anticuerpos frente a: c-Myc (9E10) (sc-40); HRP conjugado GAPDH (FL-335) (sc-25778 HRP) (todos de Santa Cruz Biotechnology); Max (AF4304) (R & amp; D Systems); PARP escindida (Asp214) (D64E10) XP (5625; Cell Signaling). Las proteínas se visualizaron utilizando peroxidasa de rábano conjugada secundaria de ratón o de conejo (1: 5000) (GE Healthcare) o de cabra (1: 1000) (R & amp; D Systems) anticuerpos y el kit SuperSignal ELISA Femto máxima sensibilidad del sustrato se utiliza para la detección (Thermo científico).

Surface Plasmon resonancia

Todos los experimentos de SPR se realizaron en un instrumento Bio-Rad XPR36 a 25 ° C. Su-etiquetados dominio bHLH-LZ de proteína Myc humana (aa353-439, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) se inmovilizó en tampón (20 mM fosfato de Na, pH 7,5, NaCl 300 mM, KCl 4 mM corriendo ,. 05% Tween 20) en ausencia de DMSO a 25 l /min durante 400 segundos en Bio-Rad HTE (Ni-NTA) chips con un valor RU resultante de aproximadamente 4500 después de la inmovilización. La unión del compuesto se analizó en el mismo tampón en funcionamiento con una concentración final de DMSO del 2%. Los compuestos se inyectaron en 30μL /min durante 180 segundos con un tiempo de disociación de 300 segundos. Las inyecciones consistieron en 5 concentraciones de compuestos además de un canal en blanco de remisión que se derramaba sobre todos los ligandos inmovilizados en un formato de matriz. etapas de regeneración no fueron necesarios debido a la rápida disociación de compuestos. ajustes de equilibrio se realizaron con el software PROTEON después de inter-punto y canal de referencia sustracciones

Myc libre de células:. Max ELISA

High placas de 96 pocillos se revistieron con la unión completa GST conjugado proteína de longitud máxima (Productos Biológicos entre China) a 1 ng /l en 100 pl de PBS durante la noche a 4 ° C. La placa se lavó 4x 200 l /pocillo con PBS y se bloquearon en 200 l /pocillo de 5% de leche en polvo sin grasa en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. de longitud completa de proteína Myc (Origene) se diluyó a 1 ng /l en tampón A (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, NaCl 150 mM, 0,002% NP-40). Los compuestos se diluyeron en serie en 100% de DMSO y después se diluyeron secuencialmente 1: 100 en la solución de Myc antes de la incubación durante una hora a temperatura ambiente. Para consistencia interna, las concentraciones finales de DMSO se mantuvieron a 2%. La placa bloqueada se lavó 4x 200μl /pocillo con tampón A, antes de la adición de 100 l de la mezcla de compuestos Myc. Las placas se incubaron durante cuatro horas a RT, y se lavaron 4x 200 l de tampón A /pocillo. El anticuerpo anti-Myc (Señalización Celular) se diluyó 1: 1000 en leche en polvo sin grasa 5% en tampón A. 100 l de anticuerpo primario /pocillo diluida se añadió a cada pocillo y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 4x 200 l /pocillo de anticuerpo de cabra anti-conejo de Buffer A. conjugado con HRP (GE Healthcare) se diluyó 1: 5000 en leche en polvo sin grasa 5% en tampón A. Se añadieron 100 l de anticuerpo secundario /pocillo diluida a cada pocillo y se incubaron durante treinta minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron /pocillo se añadieron 200 l de tampón de 4x A. 50 l /pocillo de FEMTO reactivo quimioluminiscente (Thermo Scientific), y la luminiscencia se leyó inmediatamente en un lector de placas Victor X5 (PerkinElmer) con un tiempo de integración 0,1 seg. IC
50 años se han generado a través del acople no lineal de los datos con prisma (GraphPad).

ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)

c-Myc humano (NP_002458.2) que contiene el bHLH-LZ dominio se clonó en un vector pET21a modificado y luego se transformó en el sistema de expresión BL21StarDE3, expresó y se purificó en Cayman Chemical. La construcción se compone de una etiqueta 6xHis N-terminal con un sitio de escisión TEV, los residuos de c-Myc Asn352 a Ala439, y una extensión GGCD C-terminal (peso molecular 12,9 kDa). Los compuestos se añaden a 200 ng c-Myc en tampón de reacción (mM KCL 100, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, Tris 50 mM pH 7,4, 5 mM MgCl
2, 0,002% NP40) y se incubaron durante 60 minutos a la habitación temperatura. Se añadió 350 ng de proteína marcada con His y marcada con GST humana de longitud completa Max (Productos Biológicos chino,#12885-H20B), y la reacción se incubó durante 60 minutos adicionales. Finalmente, se añadió recocido caja E de doble cadena que contiene oligonucleótido de ADN con la secuencia 5'-GATCAGTTGACCACGTGGTCTGGG-3 'a una concentración final de 100 nM durante veinte minutos de incubación a temperatura ambiente. La concentración final de DMSO se mantuvo constante a 2%. Los complejos de proteína-DNA (volumen final 10 l) se resolvieron en NativePAGE Novex 4-16% geles de proteínas Bis-Tris (tecnologías de la vida,#BN1002BOX) a 4 ° C con TBE pre-enfriado (89 mM Tris-borato, 1 mM EDTA) a 125 V durante 90 minutos. mancha SYBR Green EMSA de nucleótidos gel (Molecular Probes,#E33075) se utilizó para manchar los complejos de ADN de doble cadena y el ADN-proteína. Las imágenes fueron capturadas con un reproductor de imágenes Alfa Innotech FluorChem Q instalado con software AlphaView.

Aislamiento de ARN y Time-PCR real

RNeasy mini kit (Qiagen) fue utilizado para la purificación de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante . ADN complementario de primera cadena se sintetizó y la expresión de genes humanos analizados utilizando un Myc-objetivos matriz PCR (SABiosciences,#SPAS-177Z) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Resultados

El diseño y la proyección de una biblioteca combinatoria basada en dos ligandos diferentes para identificar inhibidores de dímeros de autoensamblado de Myc

Hemos establecido una plataforma de tecnología novedosa que tiene como objetivo desarrollar inhibidores frente a dianas farmacológicas desafiantes a través del uso de la química enlazador bioorthogonal reversible. Aquí hemos aplicado esta tecnología para desarrollar inhibidores del factor de transcripción Myc. La molécula pequeña inhibidores 10058-F4 y 10074-G5 y sus análogos se unen a myc y bloquear su interacción con Max. Además se ha demostrado que conducir un efecto antiproliferativo en líneas de células Myc impulsado a altas concentraciones [26]. Recientemente, se han descrito sondas bivalentes tales como LinkN1 que enlazan los armazones centrales de estas moléculas y son inhibidores Myc más potente en comparación con cualquiera de los andamios individuales en los ensayos bioquímicos y celulares [30] (S1 Fig.). Estos datos sugirieron que la vinculación de estos dos andamios de núcleo (denominado aquí como C01 y C02;. S1 Fig) utilizando nuestro enfoque podría conducir a un inhibidor más potente y selectivo del factor de transcripción Myc, con potencial para los perfiles de monómero farmacocinéticas mejoradas con respecto a la bivalentes más grandes. Por lo tanto, hemos diseñado y sintetizado dos pequeñas bibliotecas de monómeros añadiendo seleccionado diol catecol /alquilo y enlazadores de ácido borónico a través de conectores adecuados para los ligandos de C01 y C02, respectivamente (Fig. 1C). Designamos monómeros que llevan enlazadores de ácido borónico como monómeros "E" (electrófilos) y aquellos que llevan catecol o alquilo enlazadores diol como monómeros "N" (nucleófilos). Las bibliotecas contenían 10 "E" y 12 monómeros "N", respectivamente, que pueden interconectarse para formar dímeros 120, que nos permite identificar de manera eficiente "+" N E pares que la mayor parte de forma sinérgica inhiben Myc. Estos dímeros tienen distancias máximas entre Spanning sus ligandos de aproximadamente 7-25Å y regioisómeros función de engarce para cada distancia de expansión en particular.

Hemos examinado pares de combinaciones de monómeros a partir de nuestras bibliotecas en un ensayo de proliferación celular. Aumento de las concentraciones de cada compuesto se dosificaron en un formato de matriz de 8x6 y sus efectos sobre la proliferación de células controlados. Nuestro objetivo era identificar combinaciones que mostraron una inhibición sinérgica de la proliferación celular. El efecto teórico aditivo sobre la proliferación para cada combinación, sobre la base de la actividad de cada monómero, se calculó utilizando el análisis de la dicha [34], y combinaciones que mostró que la actividad mayor que este valor predicho se considera que es sinérgica (S2 Fig.). La mayoría de las combinaciones fueron aditivos en la naturaleza, un resultado consistente con la combinación de los dos ligandos de padres C01 y C02 (S1 Fig.). Se identificaron una serie de combinaciones que eran sinérgica y gráficas representativas que muestran la inhibición dependiente de la dosis de la proliferación con 2 combinaciones diferentes (E07 + N12 y N11 E08 +) se muestran (Fig. 2 A y B). Las estructuras de estas moléculas se muestran en la Fig. 2C. No hubo actividad de los compuestos individuales E07, E08, N12, N11 o en el ensayo de proliferación a concentraciones de hasta 30 mM. Sin embargo, la actividad de E07 (Fig. 2A) o E08 (Fig. 2B), se mejoró drásticamente en presencia de 10 mM o 30 mM N12 N11 respectivamente. Además, la actividad de los + N12 y E08 + N11 combinaciones E07 fueron significativamente mayor que el efecto aditivo predicho (línea de Bliss), lo que indica sinergia entre estos compuestos.

Las curvas de dosis-respuesta (A y B) para dos combinaciones diferentes, E07 + N12 (a) y E08 + N11 (B) probados en la pantalla de la proliferación celular. En cada caso se representa la curva de dosis-respuesta para cada monómero individual. Las curvas de dosis-respuesta para la respuesta predicha aditivo (dicha) y la combinación de datos experimentales se representan con una concentración creciente de E07 orE08 en presencia de N11 o N12 (30 M). Los datos se representan como la media ± SEM de 3 experimentos independientes.

Estos resultados de detección iniciales indicaron que sólo las combinaciones de selección fueron capaces de conducir un efecto sinérgico en el ensayo de proliferación celular. Como la biblioteca fue diseñado inicialmente para abarcar una gama de longitudes de conector, las orientaciones y las propensiones de dimerización, estos resultados sugieren que ciertas longitudes, orientaciones y combinaciones enlazador se prefieren para conducir la respuesta sinérgica en una lectura celular. Una discusión más extensa en torno a las relaciones estructura-actividad y la estructura de propiedad entre estos diferentes moléculas se presenta en otro lugar, y por lo que para los fines del presente informe nos hemos centrado en las combinaciones que mostraron la sinergia más significativo para su posterior validación.

Myc dirigidos dímeros de autoensamblaje se unen a myc y bloquear su interacción con Max

una vez identificadas las combinaciones específicas de monómeros que eran capaces de conducir una respuesta anti-proliferativa en las células Daudi, el próximo confirmó la capacidad de estos monómeros para formar dímeros en el rango de concentración utilizado en los ensayos de proliferación. Se combinaron los inhibidores monoméricos Myc E07 y N11 o E08 y N12 en una mezcla 1: 1 utilizando 10μM de cada compuesto y se analizaron para determinar la presencia de dímero mediante LC-MS. A estas concentraciones se observó 67% y 24% de dímero, respectivamente (S3 y S4 Figs.), Que confirma que estos monómeros fueron capaces de formar cantidades significativas de dímero a las concentraciones utilizadas en estos experimentos.

A continuación analizaron si estos inhibidores dímeros podrían unirse directamente a Myc. Para ello hemos desarrollado un ensayo de resonancia de plasma de superficie (SPR) para comparar las afinidades de unión de los monómeros a la de los inhibidores de dímeros. Nos inmovilizados el dominio bHLHZip de Myc a la superficie de un chip de Ni-NTA a través de un His-tag y medimos las afinidades de unión para los monómeros o dímeros. Hemos observado débil unión de cada monómero (media Kd valores E07 = 42 micras y N12 & gt;.. 50 M figura 3A y la Tabla 1), en consonancia con un reciente informe utilizando los ligandos parentales 10058-F4 y 10078-G5, que mostraron afinidades de 39,7 mM y 31,7 mM, respectivamente, para Myc en un ensayo de SPR similares [35]. En contraste, la combinación de E07 + N12 atado con una Kd de 8,6 M, una mejora notable sobre los monómeros individuales. Observamos datos similares con el dímero E08 + N11. En particular, se observó unión por saturación de las combinaciones con la estequiometría de unión dímero menor que uno, descartando la posibilidad de que la agregación compuesto causada por la dimerización era responsable de la unión potenciada observada.

A) Inhibidores muestran saturar la unión de Myc en los experimentos de SPR. Equilibrium Unidades de Respuesta (RU), normalizado a la máxima valores saturados en experimentos individuales, se representan (media ± SEM) como una función de la concentración de inhibidor. B) Dosis curvas de respuesta para la inhibición de Myc: interacción Max como se determina por ELISA. Los datos se representan como una fracción de la actividad en comparación con una muestra de control tratado con DMSO y se representan como una media de 2-5 experimentos ± SD. El eje X se refiere a la concentración de cada monómero utilizado.

Con el fin de confirmar que el inhibidor dimérico conducía la mejora de la unión a Myc, se sintetizó un análogo de N12 que era similar en todos los aspectos, excepto que carece del grupo diol requerida para la reacción con su homólogo de ácido borónico (C12, Fig. 2C). C12 solo o en combinación con E07 tenía valores de Kd & gt; 50 M (Fig. 3A y la Tabla 1), apoyando la conclusión de que la capacidad de formar dímeros era importante para la unión mejorada de estos monómeros

siguiente. pregunta si la unión de estos dímeros a Myc podría interrumpir la interacción con su socio transcripcional Max. Hemos desarrollado un ELISA usando proteína purificada Myc y Max que nos permitió medir los efectos en Myc: unión Max. La placa de ELISA se recubrió inicialmente con proteína Max y los compuestos pre-incubó con proteína Myc antes de la adición a la placa recubierta-Max. Después de un extenso lavado, la unión a Myc Max se detectó utilizando un anticuerpo anti-Myc. inicialmente Hemos probado las moléculas de ligando padre, C01 y C02, y observamos poca inhibición con cualquiera de los monómeros (IC
50 & gt; 30 M) o la combinación (IC
50 23 M) en los Myc: interacción Max (Tabla S1). A continuación centramos en uno de nuestros inhibidores diméricas identificadas, E07 + N12 y observamos de manera similar que los monómeros individuales E07 y N12 mostraron poca inhibición de los Myc: interacción Max (IC
50 24 M y & gt; 30 M, respectivamente; Fig. 3B y la Tabla 1). En contraste, la combinación de E07 + N12, dosificada en una proporción de 1: 1, inhibe Myc unión a Max en una manera dependiente de la dosis (IC
50 3,3 M) (Fig 3B y en la Tabla 1.), Una mejora 8 veces el monómero individuo más activo. Observamos efectos similares para el inhibidor dimérico E08 + N11 (Tabla 1)

La combinación de control de C12 con E07 no mostró actividad en los Myc:. Max ELISA más allá de la actividad de E07 solo (Fig. 3B) , lo que sugiere que la capacidad de E07 + N12 para dimerizar conducía el efecto inhibidor mejorado. No se observaron efectos limitados con la combinación de control no dimerizables adicional E08 + C11 (Tabla 1)

dímeros de auto-montaje inhiben selectivamente Myc:. Max unión a ADN

Después de haber confirmado que los dímeros se unen a myc y bloquear su unión a Max próximo querían confirmar que estos inhibidores bloquean selectivamente la actividad biológica de Myc en un ensayo libre de células. Se requiere heterodímero Max para su capacidad para unirse a secuencias de ADN y de activación del activador transcripcional de genes Myc-dependientes: La formación de la Myc. Max tiene la capacidad adicional para formar homodímeros que pueden unirse a las mismas secuencias de ADN, pero en general reprimir la expresión de genes [9, 10]. Para ello hemos realizado un ensayo de cambio de movilidad en gel de electroforesis para determinar si nuestros inhibidores tenían selectividad para inhibir la unión de Myc: Max heterodímeros de ADN sobre Max:. homodímeros Max

La incubación de la proteína Max con el oligonucleótido caja E resultó en un cambio de banda de ADN indicativo de Max: Max homodímeros (Fig. 4A). La adición de Myc resultó en una disminución en la cantidad de Max: Max homodímeros y la aparición de Myc: heterodímeros Max en complejo con el ADN. Ninguno de los dos monómeros, o E07 N12, tuvieron ningún efecto notable en los Myc: Max o Max: Max complejos, sin embargo E07 + N12 causó una disminución dependiente de la dosis en los niveles de los Myc: Complejo Max. Cabe destacar que la disminución de Myc: complejo Max está inversamente correlacionado con un aumento en los niveles de la Max: Max complejo, lo que sugiere el dímero está bloqueando específicamente los Myc: interacción Max, liberando Max a homodimerize y se unen al ADN

ensayo de cambio de movilidad en gel que muestra los efectos sobre Myc: DNA Max formación del complejo por el inhibidor dimérico E07 + N12 (A) y la combinación de control no dimerizables E07 + C12 (B). Las bandas que representan complejo de proteína-ADN o ADN desnudo se muestran en la parte derecha de cada panel. Las concentraciones indicadas son en M.

Como prueba adicional de que la formación del inhibidor de dimérica era crítica para la actividad inhibidora, hemos realizado experimentos similares con el C12 monómero de control no dimerizables (Fig. 4B) . En contraste con E07 + N12, la combinación de E07 + C12 no tuvo ningún efecto sobre la unión de la Myc: Max o Max: Max complejos con el ADN. Estos datos son consistentes con los efectos de estos compuestos en el ensayo de SPR y ELISA.

En conjunto, estos datos de ensayos libres de células demuestran que los inhibidores de dímeros de autoensamblaje identificados en los ensayos de células pueden unirse directamente a e inhibir Myc su interacción con Max, el apoyo a un mecanismo en el blanco de acción de estos inhibidores. Además, el uso de monómeros de control no dimerizables confirma que la capacidad de formar un inhibidor dimérico gran peso molecular es clave para la posibilidad de orientar la proteína Myc.

autoensamblaje de dímero es crítica para la actividad celular de inhibidores de Myc

Nuestros experimentos libres de células habían demostrado claramente que la capacidad de auto-ensamblaje del dímero fue importante en la conducción del efecto inhibidor mejorado en comparación con la proteína Myc. Para probar esto en un contexto celular se comparó el efecto sobre la viabilidad celular del dímero E08 + N11 frente a su combinación de control no dimerizables E08 + C11. El tratamiento de células Daudi con E08 + N11 causado una reducción significativa en la viabilidad celular después de 72 horas de tratamiento, mientras que la combinación E08 + C11 no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular (Fig. 5A, panel izquierdo). Los informes anteriores han indicado que el tratamiento de células con concentraciones relativamente altas (& gt; 50 M) de la molécula pequeña Myc inhibidores 10058-F4 y 10078-G5 causar una disminución en Myc los niveles de proteína [31, 35] y por lo que se utiliza esto como una medir el impacto de los dímeros en la vía Myc.