Reglamento
Extracto
Antecedentes
abajo de los genes que codifican para transportadores de nucleósidos y metabolismo de los fármacos responsables de la captación y activación metabólica de la gemcitabina nucleósido está relacionada con la resistencia del tumor adquirida contra este agente. La hidralazina ha demostrado revertir la resistencia a doxorrubicina en un modelo de cáncer de mama. Aquí hemos querido investigar si los mecanismos epigenéticos son responsables de la adquisición de resistencia a gemcitabina y si la hidralazina podría restaurar la sensibilidad a la gemcitabina en células de cáncer de cuello uterino.
Metodología /Principales conclusiones
La célula Calo línea celular de cáncer de cuello uterino línea se cultivó en presencia de concentraciones crecientes de gemcitabina. Baja regulación de
hENT1 Hotel & amp;
dCK
genes se observó en las células resistentes (CaLoGR), que no estaba asociado con la metilación del promotor. El tratamiento con hidralazina invierte la resistencia a gemcitabina y condujo a
hENT1
y
dCK
reactivación de genes de una manera independiente de la metilación del ADN del promotor. No se observaron cambios en la actividad total de HDAC ni en H3 y H4 acetilación en estos promotores. Chip análisis mostró H3K9m2 a
hENT1
y
dCK
promotores de genes que se correlacionaban con la hiper-expresión de G9A histona metiltransferasa en ARN y proteínas en las células resistentes. La hidralazina inhibió la actividad de metiltransferasa G9A in vitro y el agotamiento del gen G9A por ARNi restaurado sensibilidad gemcitabina.
Conclusiones /Importancia
Nuestros resultados demuestran que la resistencia adquirida gemcitabina se asocia con el promotor de la metilación del ADN-independiente
hENT1
y
dCK
gen baja regulación y la hiper-expresión de metiltransferasa G9A. Hidralazina revierte la resistencia a la gemcitabina en células de cáncer de cuello uterino a través de la inhibición de la histona metiltransferasa G9A
Visto:. Candelaria M, de la Cruz-Hernández E, Taja-Chayeb L, Pérez-E Cárdenas, Trejo-Becerril C, González- Fierro A, et al. Reversión (2012) La metilación del ADN-Independiente de Resistencia gemcitabina por hidralazina en células de cáncer cervical. PLoS ONE 7 (3): e29181. doi: 10.1371 /journal.pone.0029181
Editor: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de febrero de 2011; Aceptado 22 de noviembre de 2011; Publicado: 12 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Myrna et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por Psicofarma SA de CV Los donantes tenían un papel en la recopilación de datos, pero no en el diseño del estudio, análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses:. ADG ha recibido asesoría pagada de Psicofarma S.A. de materias distintas de las relacionadas con esta investigación. La institución del autor (Universidad Nacional Autónoma de México) tiene solicitudes de patentes relativas a la hidralazina. Esto no altera 'adhesión a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
La gemcitabina (2' los autores, 2'deoxycytidine de 2'-difluoro, dFdC) es una análogo de arabinósido de citosina que posee propiedades farmacológicas distintivas y la actividad antitumoral de amplio espectro de ancho. La gemcitabina tiene una actividad clínica significativa frente a una serie de tumores malignos incluyendo pancreático, de pulmón, de vejiga, de mama, de ovario y de cabeza y cuello [1], [2]. En gemcitabina más cisplatino cáncer de cuello uterino y la radiación mejora la supervivencia de los resultados en comparación con la radiación cisplatino en la enfermedad avanzada y cuando se utiliza con cisplatino es tan eficaz como otros dobletes de cisplatino contra el cáncer cervical metastásico [3].
características farmacológicas de gemcitabina son únicos en que las dos clases principales de genes son esenciales para sus efectos antitumorales y la resistencia: transportador de genes codificantes de proteínas de membrana, cuyos productos son responsables de la droga captación intracelular, y los genes del metabolismo de codificación de la droga, que catalizan su activación y la inactivación [4]. Por lo tanto, la expresión de estos genes es la clave para la respuesta tumoral y la resistencia a la gemcitabina. La mayor captación intracelular de gemcitabina está mediada por hENT1 (humana transportador de nucleósidos equilibrador 1). La sensibilidad a los análogos de nucleósidos incluyendo gemcitabina
in vitro
y en el entorno clínico se ha demostrado que se correlaciona con la expresión de este transportador mientras que las células hENT1-deficientes son altamente resistentes a este nucleósido [5] - [8]. Los pacientes con cáncer de páncreas y de pulmón expresan hENT1 tienen mayores tasas de respuesta y la supervivencia media más tiempo después de que los sujetos con gemcitabina hENT1 bajos o ausentes [9], [10]. En cuanto a los genes del metabolismo de gemcitabina,
dCK
expresión se ha asociado con la sensibilidad gemcitabina. Las líneas celulares seleccionadas para la resistencia a los análogos de nucleósidos han mostrado inactivación mutacional de
dCK
y
dCK
resultados de transfección en resensibilización de las células de Ara-C y gemcitabina [11] - [12]. En pacientes con cáncer de una menor expresión de dCK está asociada con supervivencia global más corta [13], [14]. Por otro lado, gemcitabina difosforilado es un inhibidor de la ribonucleótido reductasa, una enzima heterotetrameric compuesto de dos homodímeros (RRM1 y RMM2) que es clave en la síntesis de trifosfato de desoxinucleótido intracelular [15]. Más de expresión de RRM1 y RRM2 se ha asociado con la resistencia a la gemcitabina en líneas celulares de cáncer y NSCLC [16], [17]. citidina deaminasa (CDA) cataliza la desaminación de citidina, dexoycytidine, y sus análogos tales como gemcitabina sin embargo, su papel mediador resistencia gemcitabina es controvertido [18]. Estos datos sugieren claramente que una disminución o falta de expresión de dCK y hENT1 son cruciales para la resistencia a la gemcitabina, sin embargo, los mecanismos que conducen a su silenciamiento transcripcional todavía está por definir. Estudios anteriores han demostrado que la metilación en
dCK
gen es responsable de su silenciamiento [19] Sin embargo; esto aún no se demostró por
hENT1
La hidralazina es un agente de desmetilación del ADN de molécula pequeña [20] sabe que demethylate promotores de genes y para inducir la reactivación génica in vitro [21] -. [ ,,,0],24] e in vivo [25]. Utilizado en combinación con el ácido valproico inhibidor de la histona desacetilasa reactiva la expresión de genes en pacientes con cáncer [26] - [28]. Además, hidralazina ha demostrado revertir la resistencia a doxorrubicina en un modelo de cáncer de mama [29]. Como la mayoría de los trabajos sobre la resistencia a la gemcitabina se ha hecho en líneas celulares de cáncer de páncreas y, este fármaco se ha evaluado ampliamente en el cáncer de cuello de útero [30] hemos querido investigar si los mecanismos epigenéticos son responsables de la adquisición de resistencia a este agente y si la hidralazina podría devolvernos sensibilidad gemcitabina en células de cáncer cervical. Nuestros resultados demuestran que en este modelo, hidralazina revierte la resistencia a gemcitabina de una manera independiente de la metilación del ADN.
Resultados
líneas celulares de cáncer de cuello uterino fueron examinados para detectar la expresión basal de
hENT1
,
dCK
,
RRM1
,
RRM2
,
CDA
genes y luego se evaluó su sensibilidad a la gemcitabina. El IC
50 en la línea celular SiHa era & gt; 1.000 m, y se consideró arbitrariamente como resistente primario. El IC
50 para las otras líneas celulares fueron: 3,3 M, 0,3 M y 0,1 M durante Calo, HeLa y las células C33A, respectivamente (Figura 1A). Como se muestra en la figura 1B, la expresión basal de los genes que codifican para el transporte gemcitabina y metabolismo que se ajustaron a la actina y en referencia a cuello uterino normal, varió entre las líneas celulares y una relación entre los niveles de estos genes con el estado de sensibilidad intrínseca /resistencia a la no se ha encontrado gemcitabina en estas líneas celulares.
a. El IC
50 de gemcitabina para HeLa, Calo, SiHa y células C33A fueron 3,3 M, 0,3 M, & gt; 1,000 M y 0,1 M, respectivamente, tal como se evaluó con el ensayo de cristal violeta. B. Expresión basal de
hENT1
,
dCK
,
RRM1
,
RRM2
,
CDA
genes evaluados por RT- PCR. No hubo correlación entre el CI
50 y el estado de sensibilidad /resistencia intrínseca. La expresión se ajusta a la expresión en cérvix normal.
Para investigar si la inducción de resistencia gemcitabina está relacionado con cambios en la expresión de
hENT1
,
dCK
,
RRM1
,
RRM2
,
CDA
genes, Calo células fueron expuestas a concentraciones crecientes de gemcitabina y una vez que las células se volvieron resistentes que fueron tratados con hidralazina en diferentes tiempos y concentraciones . La Figura 2A muestra que después de cinco semanas, las células Calo adquirieron resistencia a este antimetabolito y eran capaces de crecer a 927 M de gemcitabina (concentración 280 veces). El estado de resistencia fue acompañada por regulación a la baja a la mitad de los
hENT1
y
dCK
.
RRM1
y
RRM2
genes tenían cambios de menor importancia, mientras que
CDA
también se redujo (Figura 2B). Además, la figura 2C muestra que la regulación a la baja de
hENT1
y
dCK
genes se produjo progresivamente a medida que la resistencia desarrollada. El tratamiento de células con CaLoGR hidralazina a 2 mM durante 10 días, 10 mM y 30 mM durante 5 días fue capaz de revertir la resistencia a la gemcitabina como se muestra en la figura 2D. El correspondiente IC
50 años para estos tratamientos eran 1,7 M, 2,7 M y 6,6 M, respectivamente.
A. Después de la adquisición de resistencia a la gemcitabina, el IC
50 en las células CaLoGR era 927 mM (concentración 280 veces). B. Expresión de
hENT1
,
dCK
y
CDA
se redujo casi a la mitad, y RRM1 RRM2 tuvo cambios menores. C. La reducción de los
hENT1
y
dCK
genes se produjo progresivamente a medida que la resistencia desarrollada. D. El tratamiento de células con CaLoGR hidralazina a 2 mM durante 10 días, 10 mM y 30 mM durante 5 días volvió resistencia gemcitabina. Los correspondientes IC
50 años para estos tratamientos fueron 1,7 M, 2,7 M y 6,6 M respectivamente.
Para determinar si la reversión de la resistencia de hidralazina, que es un agente de desmetilación de ADN débil se acompaña de cambios en la expresión de
hENT1
y
dCK
genes, se realizó una RT-PCR de estos dos genes. Los resultados en la Figura 3A muestra que la hidralazina como se esperaba condujo a la re-expresión de estos genes en las tres condiciones de tratamiento evaluados. ADN promotor hipermetilación se ha demostrado para silenciar genes en modelos resistencia a la quimioterapia, por lo tanto el estado de metilación en estos promotores fue evaluado por MSP. Curiosamente,
hENT1
y
dCK
promotores se metilado en parte incluso en el estado basal y no mostraron hipermetilación en la línea celular resistente CaLoGR. La hidralazina a 2 M, 10 mM o 30 mM no pudo demethylate estos promotores como se muestra por MSP en la figura 3B. Para confirmar este hallazgo, seis clones independientes (basal, resistente y resistente tratados con hidralazina) fueron bisulfito secuenciado pero no se observó en el desmetilación de CpG evaluadas (Fig. 3C). Por tanto, la reactivación de genes es independiente de su efecto de desmetilación, lo que sugiere que otros mecanismos epigenéticos podrían explicar para regular y reactivar estos genes en este modelo abajo. Para confirmar que la falta de efecto de desmetilación de la hidralazina a
dCK
y
hENT1
no era debido a su capacidad de desmetilación débil, la figura 3D muestra que en la misma línea celular y las condiciones, el gen
DAPK
fue desmetilado con hidralazina a 2 M 10 M y 30 M.
a. La hidralazina en las tres condiciones ensayadas (2 M durante 10 días, 10 mM y 30 mM durante 5 días) restauró la expresión de estos genes. B.
hENT1
,
dCK
genes fueron parcialmente metilado, basales y la metilación del promotor no cambiaron en las células resistentes ni después del tratamiento hidralazina evaluado por MSP. C. Mapas de los promotores de estos genes que muestran la densidad de islas CpG y distribución, así como las posiciones de los cebadores para la MSP, chip y secuenciación. También se muestra mediante secuenciación que la metilación CpG no cambió en
dCK
y
hENT1
genes ni en las células resistentes ni cuando son tratados con hidralazina. círculos vacíos y llenos representan desmetilados y metilado CpGs en cinco sequencences independientes. D. La hidralazina fue capaz de demethylate el
DAPK
promotor en la línea celular de Calo.
Un aumento de la actividad de la histona deacetilasa se ha demostrado inducir el silenciamiento de genes en algunos modelos. Para determinar si este fenómeno participa en la resistencia a la gemcitabina en el cáncer cervical, se midió la actividad desacetilasa en Calo células utilizando un kit que contiene el prototipo HDAC tricostatina A inhibidor como control positivo. Figura 4A muestra que no se observaron cambios en la actividad de HDAC; en realidad se observó una pequeña disminución de la actividad desacetilasa en las células resistentes. La evaluación de la acetilación total al H3 y H4 en
hENT1
y
dCK
promotores de genes de los ensayos de chip, mientras que mostraron una disminución de la H3 y H4 acetilación en el
hENT1
promotor , se observó un leve aumento de la acetilación de H3 en el
dCK
promotor y ningún cambio para H4 acetilación (Figura 4B). Estos resultados aparentemente opuestos argumentan en contra de un papel importante de H3 y H4 acetilación para explicar el silenciamiento de estos genes por esta modificación de las histonas. Además, el tratamiento ácido valproico en 1 mM durante 5 días no pudo reactivar la expresión de estos genes y para revertir la resistencia a gemcitabina (no mostrado).
A. La actividad total de la histona desacetilasa no mostró cambios importantes entre basal y las células resistentes, en realidad se observó una pequeña disminución en las células resistentes como se evaluó con un kit de actividad HDAC. acetilación B. total de H3 y H4 como evaluadas por ChIP mostró una disminución en H3 y H4 acetilación en el
hENT1
promotor, un leve aumento de la acetilación de H3 y no cambiar en H4 a
dCK
promotor.
Para obtener una mayor comprensión de los mecanismos epigenéticos de
hENT1
y
dCK
silenciamiento en este modelo de resistencia a la gemcitabina, se ensayó la metilación de histonas. La metilación de H3K9 es una marca represivo conocido mientras que la metilación en H3K4 está activando, por lo tanto, la metilación en estas lisinas se evaluó por análisis de chip en el estado basal, en las células resistentes y después del tratamiento hidralazina. Figura 5 muestra que para la
hENT1
gen, no se observaron cambios en la metilación H3K4me3 pero H3K9me2 ligeramente aumentados en las células resistentes y disminuyeron después del tratamiento hidralazina. En cuanto a la
dCK
gen se observó una ligera reducción en H3K4me3 en las células resistentes que no fue modificada por la hidralazina. Sin embargo, la metilación en H3K9me2 aumentó ligeramente en las células resistentes y se reduce después de hidralazina. Los cambios en la intensidad de las bandas se normalizaron en contra de su intensidad de entrada respectiva. A medida que el agente de desmetilación del ADN 5-aza-CDR ha demostrado que disminuye H3K9me2, se utilizó el programa MetaDrug ™ para descubrir si la hidralazina puede estar implicada en la regulación de metilación H3K9. Como se muestra en la Figura 6, la hidralazina puede afectar no sólo a la metilación del ADN en citosina, pero también pueden estar implicados en la regulación negativa de la metilación de H3K9. Para confirmar estas predicciones la expresión de ARNm de
G9A
se evaluó en Calo células por qPCR. Los resultados muestran que la expresión de este gen en el aumento de las células resistentes mientras que hidralazina disminuye su nivel (figura 7A). Se obtuvieron resultados similares por transferencia de western, la proteína G9A aumentó en las células resistentes y se redujo después del tratamiento hidralazina (Figura 7B). Para investigar más a fondo la capacidad inhibitoria G9A de la hidralazina, una metiltransferasa H3K9
in vitro
ensayo de inhibición en se realizó utilizando el
EpiQuik
™ histona metiltransferasa Actividad /Ensayo de inhibición Kit (H3-K9). Hidralazina a los 2 M y 10 M redujo fuertemente la metilación H3K9 (figura 7C). Para confirmar la importancia biológica de este hallazgo in vitro, knockout del gen G9A por medio de un ensayo de RNAi mostró que las células Calo transfectadas recuperaron la sensibilidad a la hidralazina que no se modificó adicionalmente cuando estas células fueron también tratados con hidralazina (Fig. 8).
en
hENT1
gen, no se observaron cambios en la metilación H3K4m3 pero H3K9me2 ligeramente aumentado en las células resistentes y la disminución después del tratamiento hidralazina. En
dCK
gen hubo una ligera reducción en H3K4me3 en las células resistentes que no fue modificada por la hidralazina. La metilación en H3K9me2 aumentó ligeramente en las células resistentes y se reduce después de hidralazina. Los cambios en la intensidad de las bandas se normalizaron en contra de sus respectivas entradas.
MetaDrug ™ programa predijo que la hidralazina puede afectar no sólo a la metilación del ADN en citosina, pero también pueden estar implicados en la regulación negativa de la metilación de H3K9.
A. RT-PCR cuantitativa de
G9A
muestra que las células CaLoGR resistentes tuvieron un aumento en comparación con el basal y que hidralazina reduce su expresión (basal vs resistente, p & lt; 0,05). B. A nivel de proteínas, se produjo un aumento en G9A en las células resistentes que disminuyeron después del tratamiento hidralazina. C. H3K9 metiltransferasa vitro
ensayo de inhibición de
In. Hidralazina a 2 mM y 10 mM fuerte reducción de metilación H3K9 (sin tratamiento vs hidralazina, p & lt; 0,05) guía empresas
a.. concentración inhibidora de gemcitabina en Calo células no alcanzó. B. El agotamiento de G9A restaura la sensibilidad gemcitabina (IC
50 10,3 M). C. No hay más cambios en IC
50 fueron vistos cuando la hidralazina se añadió a las células G9A agotado. D. qPCR de G9A confirmar el agotamiento parcial de
G9A Inicio Messenger.
Discusión
Los resultados de este estudio de la resistencia a la gemcitabina en células de cáncer de cuello uterino y su reversión con el agente de desmetilación del ADN débil hidralazina muestran que el desarrollo de la resistencia va acompañada de la baja regulación de los genes clave para la captación de gemcitabina intracelular y el metabolismo,
hENT1
y
dCK
. Curiosamente, esta regulación no fue debido a la hipermetilación del gen promotor como se demuestra por MSP y la secuenciación de bisulfito; sin embargo, hidralazina fue capaz de reactivar su expresión y para revertir la resistencia a gemcitabina. Estos datos sugieren que otros mecanismos epigenéticos operan para silenciar genes de resistencia a la quimioterapia y que la hidralazina ADN tiene efectos metilación independiente, probablemente a través de afectar negativamente a la regulación de metilación H3K9 según lo predicho por el programa METADRUG ™.
Estos resultados son importante obtener un mayor conocimiento sobre los mecanismos de resistencia a los medicamentos de quimioterapia. Gen inactivación por metilación del ADN fue el primer mecanismo epigenético demostrado estar involucrados directamente en la adquisición de resistencia a la quimioterapia en
in vitro
modelos [31], [32] Sin embargo, como el conocimiento de los procesos epigenéticos ha evolucionado, la participación de otros jugadores epigenéticos tales como histona desacetilasas ambos zinc-y dependiente de NAD, así como methyltransferases histonas, desmetilasas histonas y microRNAs en el proceso de inactivación de los genes implicados en la sensibilidad a la quimioterapia y la resistencia se ha descubierto [33] - [38]. Nuestros resultados sugieren fuertemente que en este modelo de resistencia a la gemcitabina en el cáncer de cuello uterino, la metilación en H3K9 podría ser el principal mecanismo para silenciar la expresión de
hENT1
y
dCK
genes que allana el camino para una mayor pruebas de la participación de esta modificación de las histonas en otros modelos de resistencia a la quimioterapia. La relevancia de este hallazgo aumenta a medida que los inhibidores de histona metiltransferasas G9A están siendo disponibles para el estudio [39].
Los primeros estudios han demostrado que los inhibidores de la metilación del ADN inducidas
dCK
re-expresión en el CEM /células dCK- [19] y que la falta de expresión de este gen clave para la activación de varios análogos de nucleósidos incluyendo gemcitabina se produce por la metilación del promotor [40] - [43]. Hasta ahora ningún otro mecanismo epigenético para silenciar este gen se ha descrito en los modelos de resistencia a la quimioterapia. Del mismo modo, la falta de expresión o los bajos niveles de hENT1 se correlaciona fuertemente con la resistencia a la gemcitabina y otros análogos de nucleósidos [6], [9], [10], [44]. Aunque varios codificación de genes transportador de membrana tales como hOAT3 (SLC22A8), la familia de portador de soluto 5 iodidetransporter (SLC5A8), el transportador de folato reducido (RFC), el celular proteína de unión a retinol-1, y la humana Na + /I-symporter son conocidos a ser reguladas por la metilación del ADN y reactivado por los inhibidores de la ADN metiltransferasa [45] - [49], aquí no fueron capaces de demostrar que la metilación del promotor a
hENT1
da cuenta de su regulación a la baja observado, sin embargo, se logró su reactivación por hidralazina a través de un mecanismo de metilación del ADN independiente de lo que sugiere que, efectivamente,
hENT1
se redujo regulado por un efecto epigenético más probable es que a través G9A histona metiltransferasa mediada por metilación H3K9.
a pesar de que ambos genes contienen las islas CpG a sus promotores [50], [51] y que al menos por el
dCK
gen hay que recordar con demostrado que su promotor está metilado en las células resistentes [19], en nuestro modelo no existe una correlación entre la promotor de la metilación en estos promotores y expresión. Sin embargo, el efecto de desmetilación en otros genes (
DAPK
) fue probada, descartando que la hidralazina no tiene ningún efecto de desmetilación. Estos datos nos llevan a buscar otros mecanismos epigenéticos que podrían explicar el silenciamiento de genes. No hay cambios consistentes en la histona desacetilasa ni en la acetilación de histonas en estos promotores de genes se observaron descartan esta modificación de las histonas como un mecanismo de silenciamiento de estos genes en este modelo. A medida que el inhibidor de la ADN metiltransferasa 5-aza-CDR decitabina puede exhibir mecanismos alternativos de acción para la metilación del ADN en relación con la reactivación de la transcripción tales como desmetilación de histonas H3K9 en las regiones reguladoras de los genes silenciados [52] Se realizó una búsqueda en el programa METADRUG ™ para obtener pistas sobre otros posibles efectos de hidralazina. Nuestros resultados muestran que, efectivamente, la hidralazina se predice estar involucrado en la regulación negativa de la metilación H3K9. Este resultado nos llevó a analizar por Chip análisis de los cambios en la H3K9me2 tanto a
dCK
y
hENT1
promotores en las células CaLoGR. Ambos promotores contenían H3K9me2 en las células no tratadas, un ligero aumento en el estado de resistencia, y esta marca silenciamiento fue relevado parcialmente por la hidralazina. Sin embargo tenemos que, el estrés que estos cambios aunque en H3K9m2 aunque consistentes en tres ensayos separados, fueron leves que puede explicarse sobre la base de que al menos ocho histonas methyltransferases incluyendo G9A también tienen H3K9 como su objetivo la metilación [52].
para confirmar aún más el hallazgo, una RT-PCR cuantitativa mostró que la expresión de G9A se incrementó en las células resistentes en comparación con las células sensibles y niveles no disminuyó después del tratamiento con hidralazina. Sin embargo, se observó una reducción dramática en el nivel de proteína de esta histona metiltransferasa por transferencia de Western en las células resistentes después del tratamiento hidralazina. Notable, estos resultados son muy similares a los encontrados con 5-aza-CDR en un modelo de cáncer de mama de maspin re-expresión donde las reducciones en los niveles de proteína metiltransferasa G9A histonas no son debido a los efectos sobre la expresión génica G9A [53]. El apoyo adicional para este efecto de la hidralazina se obtuvo mediante un ensayo in vitro de H3K9 metilación que muestra que la hidralazina inhibe la actividad de esta histona metiltransferasa. El significado biológico de estas observaciones fue probada por lo que demuestra que el ozono G9A en las células Calo resistentes llevó a recuperar la sensibilidad a la gemcitabina por estas células y que el aumento de la sensibilidad a la gemcitabina no se logró mediante la adición de hidralazina a las células G9a empobrecido argumentando en contra de un
fuera del objetivo
efecto de la hidralazina.
Es de destacar que el programa METADRUG ™ también indicó que la hidralazina podría actuar positivamente en la regulación de metilación H3K4 que no se observó en nuestro estudio, sin embargo, datos recientes de nuestro grupo indican que en varios celda de tratamiento líneas de cáncer con hidralazina y el ácido valproico llevó a la sobre expresión de MIC a y MIC B ligandos que fue acompañado por un aumento en la metilación H3K4 a estos promotores de genes que sugieren que la hidralazina podría tener este efecto sobre esta marca de histona [54].
Cualquiera de resistencia intrínseca o adquirida de drogas es un fenómeno complejo y pleiotrópicos y otros potenciales jugadores que participan en la resistencia a la gemcitabina en este modelo no fueron investigados en este estudio. Para los casos, a pesar de
RRM1
y
RRM2
más de expresión se ha relacionado con la resistencia a fármacos se observaron [55] no hay grandes cambios en estos genes en este estudio. Paradójicamente, el gen CD fue regulado en las células resistentes a pesar de su sobre-expresión tiene consistentemente ha demostrado relacionados con la resistencia a la gemcitabina y otros análogos de nucleósidos [56]. Este hallazgo subraya aún más la complejidad de la resistencia a los medicamentos, que parece ser el gen y el modelo de células específicas.
Los resultados de este estudio son de potencial relevancia clínica al menos para este modelo de resistencia a los medicamentos. La gemcitabina se utiliza con frecuencia para el cáncer cervical bien paralelamente a la radiación o en combinación con cisplatino para etapas avanzadas [3]. Adquirido resistencia a este fármaco puede ser responsable de fracaso del tratamiento; por lo tanto, hidralazina puede prevenir la resistencia y aumentar potencialmente la eficacia de la gemcitabina. Además, el descubrimiento de que la metilación H3K9 puede conducir a la resistencia a la quimioterapia merece sus pruebas en otros modelos experimentales.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
Las líneas celulares de cáncer cervical HeLa , SiHa y C33A se obtuvieron de la ATCC. La línea celular Calo fue un cedida gentilmente por el Dr. Monroy-García [57]. Las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C en atmósfera húmeda que contiene 5% de C0
2 en DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal (Gibco, Grand Island, NY).
Ensayos de citotoxicidad
Las células se sembraron en placas de microtitulación Falcon de 6 pocillos (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) a 2 × 10
3 células /pocillo en 0,2 ml de medio completo y después se trató durante 24 horas con gemcitabina en concentraciones que van de 1 × 10
-8 M a 1 × 10
-4 M. Después, la gemcitabina contiene medio se retiró y se añadió medio fresco. Después de 72 h medio se aspiró y se reemplazó por 10 minutos con 50 l de 0,75% de cristal violeta en 50% de etanol, 0,25% de NaCl y solución de formaldehído al 1,75%. Después, las células se lavaron con agua, se secó al aire, y el colorante se eluyó con una solución de PBS + 1% de sulfato de duodecyl de sodio (SDS). La viabilidad celular se evaluó mediante la absorbancia de colorante medido a 570 nm en un lector de ELISA automatizado. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. El efecto citotóxico de cada tratamiento se expresó como un porcentaje de la viabilidad celular con relación a células de control no tratados (porcentaje de control) y se define como [
570 células tratadas nm /
570 células nm A A no tratados] × 100.
inducción de resistencia a la gemcitabina y el tratamiento de hidralazina
Calo línea celular se cultivó a 37 ° C en atmósfera húmeda que contiene 5% de C0
2 en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (Gibco, Grand Island, NY). El aumento de las dosis de gemcitabina (IC
30, CI
50, CI
80 y, finalmente, dos pasos a IC
se añaden a la semana 90 para inducir resistencia a gemcitabina. Después de añadir IC
90 dos veces, la ensayo citotóxico se repitió para confirmar la resistencia gemcitabina.
Calo células resistentes a gemcitabina inducida (CaLoGR), se cultivaron a 37 ° C en atmósfera húmeda que contiene 5% de C0
2 en DMEM complementado con un 10% de ternera fetal suero (Gibco, Grand Island, NY). a partir de entonces, la hidralazina se añadió a los 10 M y 30 M durante 5 días y 2 M durante 10 días. el medio que contiene el fármaco se repone diariamente.
RT-PCR
se aisló ARN de las líneas celulares por métodos estándar. a partir de entonces 5 g de ARN se trataron con DNasa. transcripción inversa se realizó utilizando el kit RNA PCR Core gene Amp
R (Applied Biosystems Roche) siguiendo las recomendaciones del proveedor .
GAPDH
,
hENT1
,
dCK
,
RRM1
,
RRM2
,
CDA
genes eran amplificado utilizando los cebadores de oligonucleótidos siguientes:
GAPDH
: S: 5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3 ', AS: 5'-ATGGGTGGAATCATATTGGAAC-3'
hENT1
: S: 5'GCAAAGGAGAGGAGCCAAGA-3 ' , AS: 5'CCCAACCAGTCAAAGATATTG-3 '
dCK
: S: 5'-CGATCTGTGTATAGTGACAG-3', AS: 5'GTTGGTTTTCAGTGTCCTATG-3 ',
RRM1
: S: 5'-GCAGCTGAGAGAGGTGCTTT -3 ', AS: 5'-CAGGATCCACACATCAGACA-3', RRM2: S: 5'-GAGTTCCTCACTGAGGCC-3 ', AS: 5'-TTAGAAGTCAGCATCCAAG-3',
CDA
: S: 5 'GTTGCCTTGTTCCCT TGTAA -3 ', AS: 5'-TCTTGCTGCACTTCGGTATG-3'. PCR se realizó en un volumen total de 25 l que contenía ADNc, 20 pmol de cebadores, 200 mM dNTPs, 0,25 U de Taq polimerasa, y 1 x tampón suministrado por el fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCRs fueron iniciados por un paso de desnaturalización a 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos a 94 ° C durante 35 seg, 59 ° C durante 35 seg, y 72 ° C durante 45 seg; una extensión final se realizó a 72 ° C durante 7 min. Los productos se sometieron a electroforesis en 2% geles de agarosa.
G9A
expresión génica se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa (iCycler iQ, Bio-Rad, Hercules, CA), utilizando SYBR Green I colorante (Bio-Rad, Hercules, CA), usando los siguientes cebadores:
G9A
; Sense 5'-CTCCGCTGATTTTCGAGTGTAA-3 'y antisentido 5' GTCGAAGAGGTAAGAATCATCC-3 '.
GUSB gratis (beta glucuronidasa humana) primers específicos se utilizaron como control endógeno; sentido 5'-CCTGTGACCTTCTGAGCAA-3 'y antisentido 5' AAACCCTGCAATGGTTTCTG-3 '. La PCR se inició mediante incubación a 95 ° C durante 1 min, seguido de ciclos de PCR de 35 seg, a 94 ° C, 35 seg, a 59 ° C, 50 seg, a 72 ° C, con una extensión final a 72 ° C durante 7 min. se determinó experimentalmente El número de ciclos de PCR. Los datos se analizaron utilizando el método 2-ΔΔCT y reportados como el factor de cambio en la expresión génica normalizada con el gen control endógeno (
GUSB
) y respecto a las células sin tratamiento.
ensayo de transfección ARNi
gemcitabina adquirió células resistentes se sembraron en 24 microtitier Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) a 1,5 × 10
5 células /pocillo en 0,2 ml de OptiMEM y después de 24 horas se transfectaron con lipofectamina y
G9A
siRNA (Ambrion cat#439242). El control negativo se realizó con lipofectamina RANiMAX contiene siRNA Scramble (Ambrion, cat#4390844). Se cultivaron las células fueron cultivadas a 37 ° C en atmósfera húmeda que contiene 5% de C0
2. Después de 72 h medio se aspiró y se extrajo el ARN, se llevó a cabo, así como un ensayo de citotoxicidad.
análisis de transferencia de Western
Extractos de células enteras se prepararon en tampón de lisis que contiene 50 mM Tris-HCl pH