Extracto

Rhizoma Paridis saponinas (RPS), un compuesto natural purificada a partir de Rhizoma Paridis, se ha encontrado que inhibe el crecimiento del cáncer in vitro y en modelos animales de cáncer. Sin embargo, sus efectos sobre el cáncer de esófago permanecen sin explorar. El propósito de este estudio fue investigar los efectos de RPS en el crecimiento del tumor en un modelo de rata de cáncer de esófago y el mecanismo molecular subyacente a los efectos. Un modelo de rata de cáncer de esófago fue establecida por la inyección subcutánea de
N
-nitrosomethylbenzylamine (NMBA, 1 mg /kg) durante 10 semanas. RPS (350 mg /kg o 100 mg /kg) se administró por sonda oral una vez al día durante 24 semanas a partir de la primera inyección NMBA. RPS redujo significativamente el tamaño y el número de tumores en el esófago de ratas expuestas a NMBA e inhibió la viabilidad, la migración y la invasión de células de cáncer de esófago y EC9706 KYSE150 de una manera dependiente de la dosis (todo
P
& lt; 0,01 ). La citometría de flujo reveló que la apoptosis inducida por RPS y el ciclo celular G2 /M detención en las células de cáncer de esófago. La expresión de las ciclooxigenasas-2 (COX-2) y ciclina D1 en los tejidos de esófago de rata y las células de cáncer de esófago también se redujeron significativamente por RPS (todo
P
& lt; 0,01). Consistentemente, RPS también se redujo significativamente la liberación de prostaglandina E2, una molécula de aguas abajo de la COX-2, de una manera dependiente de la dosis (
P
& lt; 0,01). Nuestro estudio sugiere que RPS inhiben el desarrollo del cáncer de esófago mediante la promoción de la apoptosis y la detención del ciclo celular y la inhibición de la vía de la COX-2. RPS podría ser un agente terapéutico prometedor para el cáncer de esófago

Visto:. Yan S, S Tian, ​​Kang Q, Y Xia, Li C, Q Chen, et al. (2015) Rhizoma Paridis saponinas Suprime el crecimiento tumoral en un modelo de rata de
N
-Nitrosomethylbenzylamine inducida por el cáncer de esófago por inhibición de las ciclooxigenasas-2 Camino. PLoS ONE 10 (7): e0131560. doi: 10.1371 /journal.pone.0131560

Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos |
Recibido: 8 de Enero, 2015; Aceptado: 27-may de 2015; Publicado: 6 Julio 2015

Derechos de Autor © 2015 Yan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. SY fue apoyada por 2.010 Tianjin Ciencia y Tecnología del Proyecto del plan de China (10JCYBJC15100) ZL fue apoyada por y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30973383 http://www.nsfc.gov.cn/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer de esófago es la sexta causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo y el cuarto en china [1, 2]. En 2009, la tasa de incidencia de la enfermedad en China fue de 22,14 /100.000 y llegó incluso superior a 100 /100.000 en algunas áreas, tales como Cixian en la provincia de Hebei [2, 3]. Aunque la tasa de mortalidad de cáncer de esófago ha disminuido durante los últimos 30 años, debido a la mejora de la economía y los cambios de estilo de vida, el cáncer de esófago sigue siendo frecuente en zona rural de China y en los hombres chinos [2, 3]. La intervención quirúrgica es el tratamiento primario para el cáncer de esófago. El tratamiento multimodal con quimioterapia neoadyuvante o quimioterapia combinada seguida de cirugía también se ha recomendado para el cáncer de esófago localmente avanzado [4]. Sin embargo, los resultados del paciente siguen siendo pobres y la tasa de supervivencia global a los 5 años es todavía inferior al 25% [1, 4]. Por lo tanto, las terapias eficaces para el cáncer de esófago están en necesidad urgente.

Los beneficios terapéuticos de la medicina tradicional china para tratar el cáncer han sido cada vez más reconocido recientemente [5]. Rhizoma Paridis saponinas (RPS), un producto natural purificado a partir de la hierba medicinal china tradicional utilizado comúnmente Rhizoma Paridis, se ha demostrado que no sólo inhibir la fibrosis y cirrosis hepática, sino también suprimir el crecimiento de múltiples tipos de cáncer en modelos animales y células de cáncer, incluidos los de pulmón, ovario, hígado y cáncer de cuello uterino [6-19]. Además de inhibir el crecimiento del cáncer, RPS también reduce de manera significativa la migración y la invasión de células de cáncer de pulmón y células de melanoma B16 [8, 11, 19]. Además, Hombre et al. encontrado recientemente que la administración de la combinación de RPS con ciclofosfamida, un agente quimioterapéutico utilizado, puede reducir la toxicidad de la ciclofosfamida en un modelo de ratón de cáncer de hígado [14]. Xiao et al. informó recientemente de que RPS inhibe la angiogénesis en un modelo de ratón con xenoinjerto de cáncer de ovario [11].

El mecanismo molecular subyacente a efectos contra el cáncer RPS mediada también se han explorado ampliamente. Los resultados de estudios en diferentes tipos de células cancerosas humanas muestran consistentemente que RPS induce la apoptosis en células de cáncer mediante la activación de tanto dependiente de caspasa y la caspasa-independiente vías de apoptosis e inhibe la migración y la invasión por la supresión de la actividad enzimática y expresión de proteínas de las metaloproteinasas de matriz (MMP ), tales como MMP-2 y MMP-9 [6-19]. Hombre et al. utilizado un método de cromatografía de gases /espectrometría de masas para comparar el perfil metabólico de ratones portadores de hepatocarcinoma frente a ratones sanos, y encontraron que la administración RPS aumentó de lípidos y glicerato pero disminuyeron los niveles de glucosa en la sangre de ratones con hepatocarcinoma mientras ejercida efectos opuestos sobre los sustratos metabólicos en ratones sanos, lo que sugiere que RPS podría suprimir el desarrollo del cáncer mediante el bloqueo de suministro de energía a las células del cáncer [15].

Aunque RPS se ha probado en varios tipos de cáncer, sus efectos sobre el cáncer de esófago siguen siendo desconocidos. Este estudio tuvo como objetivo llenar este vacío de conocimientos. A continuación, se examinaron los efectos de RPS en el desarrollo del cáncer en un modelo de rata de
N-
-nitrosomethylbenzylamine inducida por el cáncer de esófago y de investigar más a fondo el mecanismo molecular que subyace a los efectos usando líneas celulares de cáncer de esófago humanos EC9706 y KYSE150.

Materiales y Métodos

Ética Declaración

Todos los procedimientos relacionados con el mantenimiento y los experimentos con animales se encuentran en estricta conformidad con la política del Comité para el Cuidado y uso de animales Institucional (IACUC) del hospital de Nankai . El IACUC ha aprobado este estudio. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de rata.

Productos químicos

N-nitrosomethylbenzylamine (BNM) se sintetizó en Tianjin Instituto de Investigación Farmacéutica (Tianjian, China). Dimetil sulfóxido (DMSO) se adquirió de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). NMBA (150 mg) se disolvió en 10 l de DMSO y después se diluyó con solución salina esterilizada (0,9% NaCl) a una concentración de 0,5 mg /ml para inyección. Rhizoma Paridis saponinas (RPS), que también se denomina como polyphyllin y saponina Chonglou, se extrajo de Rhizoma Paridis (número de protocolo: 1007017) y se disolvieron en agua destilada esterilizada a la concentración de 20 mg /mL. En resumen, 50 g de polvo de Chonglou se mezcló con 400 ml de etanol 75% en un matraz de fondo redondo de un litro. La mezcla se incubó en 90 ° C baño de agua durante 2 horas para extraer RPS. Se recogió la solución. El procedimiento de extracción se repitió 2 veces más con nuevas etanol al 75% cada vez. La solución de cada extracción fue la piscina junto, se filtró, y se concentró por eliminar completamente el etanol usando un vacío de velocidad para la evaporación. La solución RPS libre de etanol concentrado se transfirió a un plato de evaporación y se secó completamente en energía mediante la incubación de la placa de evaporación en un baño de agua C 100 °. Se utilizó el polvo seco RPS en el estudio.

Animales

ratas F344 macho (5 semanas de edad) fueron adquiridos de Centro Experimental Animal de la Academia de Ciencias Médicas Militares (Pekín, China) . Las ratas (5 por jaula) fueron alojados en una habitación limpia con acceso ilimitado al alimento estándar para roedores y agua. Las ratas se mantuvieron en un 12 h luz /12 h oscuridad ciclo durante 2 semanas antes de ser utilizados en experimentos. Todas las ratas se pesaron dos veces por semana durante el experimento.

modelo de rata de cáncer de esófago inducida por ABNM y administración RPS

ratas F344 macho fueron divididos aleatoriamente en los siguientes 3 grupos (n = 10 por grupo): grupo de control sano en el que las ratas se inyectaron por vía subcutánea con solución salina que contiene la misma cantidad de DMSO que la utilizada para las ratas expuestas a NMBA; grupo NMBA en el que las ratas se inyectaron por vía subcutánea con NMBA a 1 mg /kg; grupo NMBA + RPS en el que las ratas se inyectaron por vía subcutánea con NMBA a 1 mg /kg y se administran por vía oral con RPS. El diseño experimental para el establecimiento del modelo de rata y administración RPS se ilustran en la figura 1. Brevemente, las ratas en grupos de NMBA y NMBA + RPS se inyectaron por vía subcutánea con 1 mg /kg NMBA 5 veces por semana durante 5 semanas y luego con un reducido frecuencia a 1 mg /kg una vez por semana NMBA por otros 5 semanas. peso corporal de la rata se registró dos veces por semana durante 14 semanas. Dos ratas en el grupo NMBA + RPS murieron en semanas-10 y semana-15, respectivamente, debido a administrar erróneamente RPS en la vía aérea. Todos los demás animales sobrevivieron y se sacrificaron al final de 24 semanas mediante la administración de hidrato de cloral (3 ml /kg). Esófago se escindió y se examina bajo un microscopio de luz. Tumores mayores de 1 mm de diámetro fueron contados. El volumen de las lesiones se calculó utilizando la fórmula estándar: volumen = longitud x anchura x altura x 0,52. Parte de los tejidos del esófago se fijaron en solución de formalina al 10% y se incrustó en parafina para H & amp; E de la tinción, el resto de los tejidos se congelaron en nitrógeno líquido para otro experimento, tal como transferencia de Western. RPS a 350 mg /kg o 100 mg /kg se administró por vía oral mediante sonda nasogástrica una vez al día durante 24 semanas a partir de la primera inyección de ABNM.

A. Una representación esquemática del protocolo experimental. Las flechas vacías indican la inyección subcutánea de solución salina. Las flechas continuas indican la inyección subcutánea de NMBA. El área sombreada representa la administración RPS oral. B. La fórmula química de RPS. La letra "R" indica que diferentes grupos funcionales pueden estar en esa posición, lo que resulta en diferentes tipos de RPS con diferentes estructuras moleculares.

El examen histológico del tejido esofágico

Dos patólogos de el Departamento de Anatomía Patológica del hospital de Nankai, que fueron cegados para la asignación al tratamiento, se examinaron los tejidos del esófago y se contó el número de papilomas y carcinomas en cada grupo.

cultivo de células

humano de células de cáncer de esófago EC9706 línea fue un generoso regalo del Instituto de cáncer de pulmón Tianjin, Tianjin hospital de la Universidad de Medicina general. EC9706 células originalmente se compraron de ATCC (Virginia, EE.UU.). La otra línea de células escamosas de esófago humano carcinoma de células KYSE150 fue un regalo del doctor Yutaka Shimada, quien estableció esta línea celular en el Departamento de Cirugía y Cirugía Ciencias Básicas, Facultad de Medicina de la Universidad de Kyoto, Japón [20]. medios Ambas líneas celulares se cultivaron en RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.) suplementado con 10% de FCS (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.), 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (Thermo Scientific , Rockford, IL, EE.UU.) a 37 ° C en 5% de CO
2.

viabilidad de las células de ensayo

la viabilidad celular se midió por el [3- (4,5-dimetiltiazol -2-il) -2,5-difeniltetrazolio] (MTT) ensayo de reducción de colorante (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3 x 10
3 células /100 l /pocillo seguido de 24 h de incubación. Las células se trataron luego con RPS en 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 30, 40, o 60 mg /ml durante 48 horas. Después del tratamiento, se añadieron 20 l de MTT (5 mg /ml) a cada pocillo y se incubó durante 4 horas. Los medios se retiraron entonces y los cristales de formazán de color azul oscuro se disolvieron en 150 l de DMSO. La absorbancia a 550 nm se midió en un lector de microplacas (Corning Costar, Corning, NY, EE.UU.). La absorbancia de fondo a 690 nm se restó de todas las lecturas. Se calculó el porcentaje de viabilidad celular en relación con los controles sin RPS. Cada concentración se ensayó con 6 repeticiones de cada experimento, y el experimento se repitió de forma independiente al menos 3 veces.

cicatrización de heridas ensayo

Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos hasta confluencia. Cinco arañazos (uno por pocillo) para cada concentración de RPS Después se hicieron en la monocapa confluente utilizando una punta de pipeta. Después se lavó dos veces con PBS, las células se mantuvieron en medios libres de suero con RPS en 0, 3,25, 7,5, o 15 mg /ml para EC9706 células, o al 0, 5, 10, o 20 mg /ml para KYSE150 para 24 h . Las heridas fueron fotografiadas bajo un microscopio invertido de contraste de fases, y se midió la anchura de la herida. El experimento se repitió al menos 3 veces.

Transwell ensayo de invasión

ensayos de la invasión de células se realizaron utilizando cultivos polarizados 24 pocillos (8 micras de tamaño de poro, Corning, MA, EE.UU.), recubierta con matrigel ( 1 mg /ml, Ciencias de la BD, CA, EE.UU.). Las células (5 x 10
4 /pocillo) se sembraron en las cámaras superiores de los pozos en 200 medios libres de suero l que contenía RPS a los 0, 5, 10, o 20 mg /ml. Las cámaras inferiores se rellenaron con 750 l de medios RPMI-1640 suplementado con 10% FCS. Después de la incubación durante 24 h, las células que quedan en la superficie superior de la cámara se eliminaron mediante permutas de algodón y las células en el otro lado de la membrana se fijaron con metanol y se tiñeron con solución de Giemsa. Las células penetrado en la superficie inferior del filtro se contaron bajo un microscopio. Un total de 5 campos de cada filtro fueron seleccionados al azar y se utilizó el número de células promedio de los 5 campos. El experimento se repitió al menos 3 veces.

La apoptosis y el ciclo celular análisis

Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 10
5 células /pocillo. Después de la incubación durante la noche, las células se trataron con RPS a los 0, 5, 10, o 20 mg /ml durante 24 h. Los medios fueron luego aspirado y reemplazado con medio fresco que contenía RPS o su control. Las células se incubaron a continuación a 37 ° C en 5% de CO
2 para 24 h. Para evaluar la apoptosis y el ciclo celular, se recogieron los medios de cultivo para cosechar las células flotantes. Las células unidas se lavaron con PBS y se incubaron con tripsina. Las células despegadas y las células en los medios de comunicación se recogieron por centrifugación (1000 x g, 5 minutos). Los sedimentos celulares se lavaron dos veces con PBS y re-suspenden en 250 l de tampón de unión. Cinco l Anexina V-FITC y 10 l PI se añadieron a la suspensión celular. Cada muestra fue entonces mezcló suavemente y se incubó durante 15 min en la oscuridad. Después de la incubación, 200 l de PBS se añadió a cada muestra. Las muestras se filtraron a través de filtros de malla 300 y luego analizados en el flujo de BD FACS Calibur citómetro. La apoptosis y el ciclo celular se analizaron utilizando el software FlowJo. El experimento se repitió al menos 3 veces.

Western Blot

Las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10
5 células /pocillo y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. células EC9706 se trataron a continuación con RPS en 0, 7,5, o 15 mg /ml durante 24 h. KYSE150 células fueron tratadas con RPS a los 0, 10, o 20 mg /ml durante 24 h. Después, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y después se lisaron en tampón RIPA (Wuhan Boster Company, Wuhan, China) que contiene 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo. tejidos del esófago se homogeneizaron en tampón RIPA y luego se centrifuga a 12, 000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C. Las concentraciones de proteína en los sobrenadantes y el lisado celular se midieron usando un kit de ensayo de proteínas BCA (Kang Wei Shi Ji Company, Beijing, China). Cantidades iguales de extracto de proteína (30 mg) se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a las membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente en leche seca desnatada al 5% en TBST (10 mmol /L Tris, pH 8,0, 165 mmol /l de NaCl, 0,05% Tween 20). Las membranas fueron incubadas con anticuerpos monoclonales de conejo contra rata β-actina (Boster Company, China; 1: 200 dilución en 1 × TBST), la COX-2 (Cell Signaling Technology, EE.UU.; 1: 1000 dilución en 1 × TBST), o CyclinD1 (Cell Signaling Technology, EE.UU.; 1: 1000 dilución en 1 × TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas fueron lavadas extensivamente, seguido de incubación con una IgG anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Cell Signaling Technology, EE.UU.) a una dilución de 1: 5000 durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Las proteínas marcadas se visualizaron con un método de quimioluminiscencia (Millipore Corporation, Billerica, EE.UU.). Para la cuantificación, las intensidades de señales de la proteína se evaluaron con el sistema Cantidad uno (Bio-Rad, Hercules, EE.UU.). El experimento se repitió al menos 3 veces.

prostaglandina E2 (PGE2) ELISA

Las células se cultivaron a una densidad de 2 x 10
5 placas /pocillo en 6 pocillos en suero medios -free contienen RPS a los 0, 5, 10, o 20 mg /ml durante 24 h. se recogió sobrenadante del cultivo celular y se centrifugó a 12, 000 rpm durante 10 min y se recogió el sobrenadante. El nivel de PGE2 en el sobrenadante libre de células se determinó por ELISA kit de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante (Cusabio, Wuhan, China). El experimento se repitió al menos 3 veces.

El análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE) y se analizó mediante el uso de la estadística SPSS11.5 software de análisis. Comparación fue analizada por ANOVA de una vía.
Los valores P
eran caras y 2
P Hotel & lt; 0,01 fue considerado estadísticamente significativo.

Resultados

RPS inhibe el crecimiento tumoral de cáncer de esófago en ratas

desarrollo de tumores Las 10 ratas sobrevivieron 10 semanas de exposición ABNM e inyección ABNM inducidos de manera espectacular en el esófago de las ratas. La superficie de esófago en las ratas expuestas a NMBA se cubrió con lesiones tumorales con diversos tamaños (Fig 2A). RPS a 350 mg /kg redujo significativamente el número (3,5 ± 1,58 frente a 1,4 ± 1,11,
P Hotel & lt; 0,01, la figura 2A y 2B) y el tamaño medio de los tumores (17,71 ± 9,16 mm
3 vs 6,47 ± 5,86 mm
3
P Hotel & lt; 0,01, la figura 2A y 2C) en el esófago. El examen histopatológico de los tejidos de esófago reveló que la exposición NMBA condujo a hiperplasia escamosa epitelial (Fig 2A) y el número de papilomas y carcinomas de grupo NMBA fueron considerablemente más altos que los del grupo de NMBA + RPS aunque las diferencias entre los 2 grupos no fueron estadísticamente significativas (Fig 2D). RPS-dosis baja (100 mg /kg) no afectó el tamaño del tumor (grupo de exposición ABNM: 15,0 ± 11,9 mm
3 vs grupo ABNM + RPS: 17.6 ± 9.9 mm
3
P
& gt; 0,05) y el número de tumores (ABNM grupo de exposición: 3,5 ± 1,0 vs. grupo ABNM + RPS: 3,3 ± 1,6,
P Hotel & gt; 0,05) en las ratas expuestas a ABNM

A. Las fotografías y H & amp; E tinción de los tejidos del esófago de ratas de control sano, ABNM, o grupo ABNM + RPS. ratas F344 macho (n = 10 por grupo) fueron inyectados por vía subcutánea con solución salina que contiene DMSO (grupo de control sano), NMBA a 1 mg (grupo NMBA) /kg, o NMBA más la administración oral de RPS en 350 mg kg (grupo /NMBA + RPS ). Esófago fue disecada, fotografiado, y se examina bajo un microscopio de luz. Una parte de los tejidos del esófago se fijó en formalina al 10% y se tiñeron con H & amp; E. B. RPS redujo significativamente el número de tumores en esófago. Tumores mayores de 1 mm de diámetro fueron contados, n = 10. C. RPS disminuyó significativamente el tamaño del tumor. El volumen de las lesiones se calculó utilizando la fórmula estándar: volumen = longitud x anchura x altura x 0,52, n = 10. D. RPS redujo el número de papiloma y carcinoma. Dos patólogos, que fueron cegados para la asignación al tratamiento, examinaron el tipo y número de tumores. Se presenta el número promedio de papiloma y carcinoma, n = 10. * representa una diferencia significativa entre el grupo de NMBA vs grupo control sano,
P
& lt; 0.01.#Representa diferencias significativas entre el grupo ABNM + RPS vs grupo ABNM,
P Hotel & lt; 0.01.

RPS inhibió la viabilidad, la migración y la invasión de células de cáncer de esófago

Para investigar el mecanismo molecular que subyace a la inhibición mediada por RPS del desarrollo del cáncer de esófago, lo primero que examinó los efectos de RPS en el comportamiento de las células de cáncer de esófago. Nuestros resultados muestran que el tratamiento RPS inhibió significativamente la viabilidad, la migración y la invasión de células de cáncer de esófago y EC9706 KYSE150 de una manera dependiente de la dosis (Fig 3,
P
& lt; 0,01).

A. RPS inhibió la viabilidad de las células de cáncer de esófago. Después de la incubación durante la noche, las células en placas de 96 pocillos se trataron con RPS en 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 30, 40, o 60 mg /ml durante 48 horas y después se incubaron con 20 l de MTT ( 5 mg /ml) durante 4 horas. La absorbancia a 550 nm se midió en un lector de microplacas. Se calculó el porcentaje de viabilidad en relación con los controles sin RPS. Cada concentración se ensayó con 6 repeticiones en cada experimento, n = 3. B. RPS reduce la invasión de células de cáncer de esófago. Se cultivaron las células en la cámara transwell (5 x 10
4 /cámara, tamaño de poro 8 micras y recubierta con 1 mg /ml de matrigel) que contiene medio libre de suero con RPS a los 0, 5, 10, o 20 mg /ml en la cámara superior y medio RPMI-1640 + 10% de FCS en las cámaras inferiores de 48 h. Las células penetrado en la superficie inferior del filtro se fijaron y se contaron bajo un microscopio. Un total de 5 campos de cada cámara fueron seleccionados al azar y se utilizó el número de células promedio de los 5 campos, n = 3. * y#representa diferencias significativas a los 5, 10, y 20 mg /ml de RPS en comparación con 0 mg /ml de RPS en las células de células y KYSE150 EC9706, respectivamente,
P Hotel & lt; 0.01. C. Imágenes de cicatrización de la herida de las células EC9706, 20 x. D. Imágenes de la cicatrización de heridas de KYSE150 células, 20 x. E. RPS redujo la migración de las células EC9706. F. RPS reduce la migración de las células KYSE150. Un total de 5 arañazos se utilizaron para cada concentración de RPS. Las células fueron cultivadas en medio libre de suero con RPS en 0, 3,25, 7,5, o 15 mg /ml para las células EC9706, o al 0, 5, 10, o 20 mg /ml para KYSE150 para 24 h. Las heridas fueron fotografiadas bajo un microscopio invertido de contraste de fases, y la reducción de distancias en porcentaje se calculó como (anchura en 0h -width a 24 n) /anchura en 0h * 100%, n = 3. * representa una diferencia significativa entre RPS a una concentración especificada frente a 0 mg /ml,
P Hotel & lt; 0.01.

RPS inducida por la apoptosis y la detención del ciclo celular en células de cáncer de esófago

RPS inhibición mediada de la viabilidad, la migración y la invasión sugirió que RPS podría interferir en la apoptosis y el ciclo celular en las células de cáncer de esófago. De hecho, nuestro citometría de flujo Los resultados demostraron que RPS a la concentración de 10 mg /ml o superior significativamente aumentó la proporción de células apoptóticas en tanto EC9706 y KYSE150 células (Fig 4,
P
& lt; 0,01). Consistentemente, RPS a la misma concentración aumentó notablemente la proporción de células en fase G2 (Fig 5,
P
& lt; 0,01), lo que sugiere que el tratamiento RPS inducir G2 detención del ciclo celular /M en las células de cáncer de esófago. La proporción de células en fase S EC9706 no se vio afectada sustancialmente por RPS, mientras RPS redujo el porcentaje de KYSE150 células en fase S de una manera dependiente de la dosis, lo que indica que el crecimiento celular KYSE 150 fue inhibida por RPS (Fig 5). Además, la expresión de la ciclina D1 en las células de cáncer de esófago se redujo notablemente por tratamiento RPS (Fig 6A). También se examinó la expresión de ciclina D1 en los tejidos del esófago de ratas. En comparación con los controles sanos, la exposición ABNM inducida drásticamente la expresión de ciclina D1 en el tejido esofágico; mientras que la administración RPS redujo significativamente la NMBA inducida por la sobreexpresión de la ciclina D1 (Fig 6B y 6C,
P
& lt; 0,01). Estos resultados apoyan además que RPS interfiere en el ciclo celular en las células de cáncer de esófago.

Las células se trataron con RPS a los 0, 5, 10, o 20 mg /ml durante 24 h. Tanto las células unidas y las células flotantes en los medios de comunicación se recogieron por centrifugación a 1000 g durante 5 min. Las células se incubaron con de 5 l Anexina V-FITC y 10 l PI durante 15 minutos en la oscuridad, se diluyó en 200 l de PBS, y se analizaron en flujo BD FACS Calibur citómetro. La apoptosis se analizó usando el software FlowJo, n = 3.

Las células usadas para el análisis de la apoptosis también se analizaron para ciclo celular utilizando el software FlowJo, n = 3. * y#representa diferencias significativas a los 5, 10, y 20 mg /ml de RPS en comparación con 0 mg /ml de RPS en la celda EC9706 y KYSE150 células, respectivamente,
P
& lt; 0.01.

A. RPS redujo la expresión de COX-2 y ciclina D1 en células de cáncer de esófago. EC9706 células fueron tratadas con RPS en 0, 7,5, o 15 mg /ml durante 24 h. KYSE150 células fueron tratadas con RPS a los 0, 10, o 20 microgramos /ml durante 24 h. Las células después se cosecha y se lisaron. extracto de proteína (30 mg) se separaron por SDS-PAGE y se transfiere a las membranas de nitrocelulosa. Las membranas se sondaron con anticuerpo de conejo anti rata β-actina, COX-2, o la ciclina D1. Se presentaron imágenes representativas. B. RPS redujo la expresión de COX-2 y ciclina D1 en los tejidos de esófago. tejidos del esófago de ratas se homogeneizaron y el extracto de proteína (30 mg) se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a las membranas de nitrocelulosa. La membrana se sondeó con conejo anti rata β-actina, COX-2, o la ciclina D1. Se presentan imágenes representativas. Se presentan análisis de C. Densitometría del western blot en los valores B. media de 5 ratas, n = 5. * representa una diferencia significativa entre el grupo ABNM vs grupo control sano,
P Hotel & lt; 0.01.#Representa diferencias significativas entre el grupo ABNM + RPS vs grupo ABNM,
P Hotel & lt; 0.01. D. RPS disminuye la liberación de PGE2 a partir de células de cáncer de esófago. Las células fueron cultivadas en medio libre de suero que contenía 0, 5, 10, o 20 mg /ml RPS para 24 h. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron y se centrifugaron a 12, 000 rpm durante 10 min para eliminar los restos celulares. El nivel de PGE2 en los sobrenadantes se determinó por ELISA kit de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante, n = 3. * y#representa diferencias significativas a los 5, 10, y 20 mg /ml de RPS en comparación con 0 mg /ml de RPS en células de células y KYSE150 EC9706, respectivamente,
P Hotel & lt; 0.01.

RPS suprimido la expresión de ciclooxigenasa-2 y la liberación de prostaglandina E2 en las células de cáncer de esófago

COX-2 vía trastorno se ha asociado con el cáncer en el sistema digestivo [21]. Por lo tanto, hemos probado si RPS podría afectar a la COX-2 vía en el cáncer de esófago. Nuestros resultados Western Blot demuestran que el tratamiento RPS redujo significativamente COX-2 expresión en las células de cáncer de esófago y EC9706 KYSE150 (Fig 6A). la exposición ABNM aumentó notablemente la expresión de COX-2 en los tejidos del esófago de rata, mientras que la administración RPS redujo significativamente mediada por ABNM la COX-2 sobre-expresión (Figura 6B y 6C,
P Hotel & lt; 0,01). En consonancia, la liberación de PGE2, una molécula de aguas abajo de la COX-2, fue también el regulado por RPS en una forma dependiente de la dosis en las células de cáncer de esófago (Figura 6D,
P Hotel & lt; 0,01). Todos los datos originales se muestran en la Tabla S1.

Discusión

En este estudio, encontramos RPS desarrollo de tumores suprimió de forma significativa en un modelo de rata de ABNM inducida por el cáncer de esófago e inhibieron la viabilidad, la migración y la invasión de células de cáncer de esófago humanos EC9706 y KYSE150. Estos resultados son consistentes con los hallazgos de otros tipos de cáncer, más el apoyo a los efectos anticancerígenos de RPS [6-19]. Nuestro estudio también mostró que RPS apoptosis inducida en las células de cáncer de esófago. RPS se ha encontrado que un máximo de regular la expresión de proteínas pro-apoptóticos, tales como la caspasa-3 activa, caspasa-9 activa, y Bax en las células de pulmón de células no pequeñas de cáncer, xenoinjertos de hepatoma, células de cáncer de ovario, y células Hela, lo que indica que RPS inducir apoptosis por vía mitocondrial de apoptosis [7, 12, 13, 17, 18].

Además de inducir la apoptosis, también encontramos RPS causó G2 del ciclo celular detención /M en células de cáncer de esófago. Consistentemente, Xiao et al. informó de que RPS promovido dramático arresto G2 /M fase en células de cáncer de ovario humano SKOV3 [13], y Jiang et al. demostrado que RPS inducida G2 /M detención en células de cáncer de pulmón de células no pequeñas [7]. En este estudio, se examinaron además la expresión de la ciclina D1, una proteína que juega un papel crítico en el ciclo celular, y se encontró que la exposición NMBA notablemente estimulado la expresión de ciclina D1 en el tejido de esófago de rata y RPS redujo significativamente la expresión de un exceso de de la ciclina D1 en tanto en el tejido esofágico y las células de cáncer de esófago. Estos resultados confirman además que RPS inhibe el desarrollo de tumores mediante la inducción de apoptosis y la promoción del ciclo celular G2 /M detención en células de cáncer
.
El papel de la COX-2 vía en el desarrollo y progresión del cáncer es bien conocido. La sobreexpresión de la COX-2 y las prostaglandinas están asociadas con el desarrollo de diversos tipos de cáncer, y sus niveles de expresión representan la agresividad de la progresión del cáncer [21]. En el cáncer de esófago humano, marcada sobre-expresión de COX-2 se ha observado en epitelio escamoso esofágico, pero no en tejidos normales [22]. El papel de la COX-2 en el cáncer de esófago vía también es apoyado por estudios epidemiológicos y preclínicos demuestran que los inhibidores de COX-2 reducen el riesgo de cáncer de esófago [23]. En este estudio, se encontró que NMBA estimuló drásticamente la COX-2 expresión en el tejido del esófago de ratas y RPS disminuyó significativamente la mediada por NMBA COX-2 sobre-expresión. RPS también se redujo notablemente la COX-2 de expresión y liberación de PGE2 a partir de células de cáncer de esófago y EC9706 KYSE150. Por lo tanto, nuestros resultados indican que RPS podría ser un inhibidor de la COX-2.

Aunque creciente número de estudios sobre líneas de células y modelo animal de varios tipos de cáncer demuestran claramente la anti-cáncer y otros efectos beneficiosos de RPS tales como la reducción de la toxicidad de los agentes quimioterapéuticos, la toxicidad y los secundarios efectos de neurofarmacológico RPS no deben pasarse por alto. Liu et al. informó que una sola administración oral de RPS ejerce efectos adversos sobre el comportamiento general y la mortalidad en ratones con un
LD


50
valor de 2.182,4 mg /kg en ratones [24]. Además, también mostró que RPS a las concentraciones de 100, 250, y 500 mg /kg suprimió significativamente el vaciado gástrico, pero no afectaron el tránsito intestinal en ratones [24]. El
LD

50 valor de RPS para las ratas es todavía desconocida. La dosis de 350 mg /kg RPS en este estudio, que es el 16% de la
LD

50 valor para los ratones, parece ser seguro para las ratas. Excepto que el 2 ratas en el grupo NMBA + RPS murieron debido a administrar erróneamente RPS en la vía aérea, el resto de las ratas del grupo sobrevivieron. No se observaron efectos de toxicidad evidente en nuestro estudio. Vamos a probar dosis más baja de RPS, por ejemplo, 200 mg /kg, en el modelo de rata de cáncer de esófago y examinar la toxicidad de RPS en ratas en estudios futuros.