Extracto
En este estudio se investigó la correlación entre la expresión RhoC y las células madre del cáncer (CSC) de formación en la cabeza y el carcinoma de células escamosas del cuello (CECC). La inhibición de la función RhoC se logró utilizando shRNA. La expresión de marcadores de superficie de células madre, ALDH y CD44 fueron significativamente más bajos en dos líneas celulares de carcinoma de células HNSCC empobrecido RhoC. Por otra parte, se logró una reducción notable en la formación de líneas tumorsphere desmontables RhoC. La expresión de mRNA RhoC en RhoC caída adherente y tumorspheres están drásticamente regulados en comparación con el control mezclado. La expresión de mRNA de factores de transcripción de células madre; nanog, oct3 /4 (Pouf1), y Sox2 se agotaron de manera significativa en RhoC clones desmontables. Además, la fosforilación de STAT3
ser727, y STAT3
tyr705 se regula de manera significativa en los clones RhoC desmontables. La sobreexpresión de STAT3 en RhoC caída no mostró ningún cambio en los patrones de expresión de cualquiera-STAT3
tyr705 o factores de transcripción de células madre, lo que significa el papel de RhoC en la activación de STAT3 y por lo tanto la expresión de Nanog, Oct3 /4 y Sox2 en CECC. La expresión de Inter interleucina-6 (IL-6) en líneas celulares de HNSCC desmontables RhoC fue dramáticamente baja en comparación con el control mezclado. Además, hemos demostrado un rescate de la fosforilación de STAT3 por IL-6 en la estimulación líneas desmontables RhoC. Este estudio es el primero de su clase para establecer la participación de RhoC en la fosforilación de STAT3 y por lo tanto en la promoción de la activación de las células madre del cáncer núcleo (CSC) factores de transcripción. Estos hallazgos sugieren que RhoC puede ser una nueva diana para el tratamiento HNSCC
Visto:. Islam M, S Sharma, Teknos TN (2014) RhoC Regula células madre del cáncer de cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas mediante la sobreexpresión de IL-6 y la fosforilación de STAT3. PLoS ONE 9 (2): e88527. doi: 10.1371 /journal.pone.0088527
Editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Octubre, 2013; Aceptó 7 de enero de 2014; Publicado: 12 de febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Islam et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Centro Integral del cáncer de la Universidad Estatal de Ohio y la Fundación de la Familia Slomin (Florida, EE.UU.) a Ted Teknos. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) se encuentra entre las diez primeras muertes por cáncer en todo el mundo [1], [2]. Por otra parte, según lo informado por la Sociedad Americana del Cáncer, aproximadamente 41.380 nuevos casos serán diagnosticados en el año 2013, de los cuales alrededor del 19% de los pacientes son propensos a morir debido a la enfermedad en el mismo año [3]. Los supervivientes se enfrentan a manifestaciones secundarias de la enfermedad que resulta en un tratamiento prolongado y extenso. Esto se ve agravado por el hecho de que la enfermedad muestra una alta frecuencia de reaparición. Como resultado, los pacientes HNSCC se enfrentan a una larga batalla contra la enfermedad causando gran carga económica y emocional [4]. En consecuencia, un informe por Brown
et al
(2002) cita CECC entre los ocho tipos de cáncer más caros en el programa de Medicare [5].
La inusualmente alta morbilidad y mortalidad se debe a la la naturaleza maligna del CECC y su presencia generalizada en la mayoría de los cánceres de cabeza y cuello. Por lo tanto, no es raro encontrar metástasis a los ganglios linfáticos de la región del cuello que lleva al fracaso loco-regional (más frecuente), seguido de la metástasis pulmonar y ósea [6], [7]. Como resultado, los pacientes con HNSCC muestran mal pronóstico y una tasa de supervivencia de cinco años de sólo 50 a 60% [3]. Por lo tanto, hay una gran necesidad de comprender los mecanismos genéticos que regulan la malignidad del CECC y utilizarlos para diseñar mejores estrategias de tratamiento que pueden prevenir la metástasis y la reaparición.
RhoC es un miembro de la familia Rho bien caracterizado GTPasas que están involucrados en una amplia gama de actividades celulares incluyendo la señalización intracelular, la organización del citoesqueleto, la proliferación celular y la regulación de la expresión génica [8]. Curiosamente, los genes Rho pertenecen a los superfamilia Ras, muchos de los cuales han sido identificados como oncogenes [9], [10]. Aunque muy pocas mutaciones genéticas se observan en el gen RhoC, se informa de que se sobre-expresado en muchas formas de carcinomas invasivos incluyendo HNSCC [11], [12]. Específicamente, los estudios en todos los tipos de cáncer en el que se analizó la expresión RhoC revelaron una correlación muy fuerte entre en gran medida el aumento de expresión y la metástasis. Por otra parte, cuando se inhibe la función RhoC
in vitro
, da lugar a una fuerte reducción de la invasión de células y la motilidad [13]. Curiosamente,
in vivo
estudios de tumorigénesis en ratones knockout muestran RhoC tumores con una capacidad muy reducida para producir metástasis en los pulmones [10]. En conjunto, estos estudios sugieren fuertemente RhoC es un oncogén a favor de la metástasis que juega un papel importante en la transformación de las células tumorales no invasivas en un fenotipo invasivo.
El estudio de la función RhoC se centra principalmente en su papel en la reorganización de citoesqueleto mediante la inducción de la formación de fibras de estrés y de adhesión focal, que son pasos críticos hacia el cambio de las células en las formas móviles e invasoras [14]. Sin embargo, el proceso de la metástasis por células de cáncer es un proceso complejo y de múltiples etapas que se acompaña con el aumento de la expresión de genes que aumentan la motilidad y la invasión y una baja regulación selectiva de genes que inhiben este proceso. La prevalencia de RhoC en una amplia gama de carcinomas invasivos y su función como una GTPasa de señalización sugiere que puede regular otras vías que están involucrados en la transformación de células tumorales en un fenotipo metastásico.
células madre del cáncer (CSC) son una subpoblación de células tumorales no diferenciadas dentro de una masa tumoral que son capaces de auto-renovación. También exhiben una fuerte resistencia a la quimio-radioterapia. Por otra parte, los CSC puede persistir en tumores como una subpoblación discreta que puede recaer y metástasis mediante la formación de nuevos tumores [15], [16]. Estas propiedades únicas juegan un papel significativo en la supervivencia de células de cáncer que conduce a la recurrencia. Es importante destacar que, también pueden ser una fuente de células con un fenotipo invasivo, jugando así un papel clave en la metástasis
.
Un número considerable de estudios se han llevado a cabo en la presencia y la función de células madre cancerosas en el cáncer de cabeza y cuello que ha sido revisado exhaustivamente por Minnelli y Gallo (2012) [17]. Un estudio de los tumores primarios en los cánceres de cabeza y cuello utilizando el CD44 marcadores y ALDH identificó un subgrupo de células tumorales que CSC únicas propiedades, incluyendo la auto-renovación, la capacidad para formar nuevos tumores en ratones y exhibió alto potencial metastásico (Prince
y col
2007, Davis
et al
de 2010, Clay
et al
2010) [16], [18], [19]. Curiosamente, las células tumorales positivas ALDH exhibieron potencial más tumorigénico en comparación con las células positivas CD44 [19]. Por otra parte, Chen
y col gratis (2010) [20] informó de tumores primarios con una mayor expresión de CD44 y ALDH, que atribuye bien con el mal pronóstico en pacientes HNSCC. Sobre la base de estos estudios, se puede concluir que las CSC pueden jugar un papel importante en la metástasis de HNSCC; lo que sugiere la necesidad de comprender los mecanismos moleculares que los regulan.
Los CCC también se han identificado y caracterizado en líneas celulares de CECC en los que se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la transición epitelio-mesenquimal (EMT) [ ,,,0],21]. En nuestro estudio, hemos analizado el efecto de la inhibición RhoC de las características funcionales de las células cancerosas que exhiben características de CSC-como en líneas celulares HNSCC. Se demuestra que la inhibición de la actividad RhoC en líneas celulares de HNSCC resultado en una reducción significativa de la población de células que expresan CD44 y ALDH, los marcadores de células madre cancerosas en tumores de cabeza y cuello.
Además, también caracteriza el mecanismo molecular por el cual RhoC regula el crecimiento y la autorrenovación de las células madre cancerosas. Nuestros resultados muestran que RhoC puede reducir significativamente los niveles de expresión del núcleo factores de transcripción de células madre, Nanog, Sox2 y oct3 /4. Además, muestran que esto se logra mediante la reducción de los niveles de STAT3 fosforilados a través de la vía de señalización de IL-6 /JAK. Este estudio es el primero de este tipo que intenta diseccionar el papel de la vía de señalización RhoC GTPasa en la regulación y la activación de factores de transcripción celular madre. (Estos factores promueven y mantienen las células tumorales con propiedades de células madre en cáncer de cabeza y cuello).
Por lo tanto, en base a nuestros resultados concluimos que RhoC es un oncogén importante que se necesita para el mantenimiento y la propagación de células madre cancerosas en los CECC.
Materiales y Métodos
cultivo de células
líneas celulares de carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas UM-SCC-1 y -47 (carcinoma de células escamosas Universidad de Michigan ) fueron adquiridos por la Universidad de Michigan. Estos son bien caracterizados líneas derivadas de pacientes con T2N0 de piso de la boca y T3N1 de base de la lengua, respectivamente [22], [23]. Las líneas celulares se cultivaron como se ha descrito anteriormente [13].
transducción de lentivirus, infección y selección de clones positivos RhoC desmontables
Con el fin de obtener clones estables RhoC desmontables de las líneas celulares mencionadas anteriormente hemos utilizado RhoC construcciones de control de secuencia de derribo y revueltos con GFP etiquetados y sitios de resistencia a la puromicina como se describe en nuestros trabajos publicados anteriormente [13]. La selección de RhoC clones estables desmontables se logró utilizando 2,0 y 1,6 mg /ml de puromicina para UM-SCC-1 y -47, respectivamente. Estos clones fueron más ordenados por citometría de flujo para conseguir el máximo número de células positivas para GFP, que también se utilizaron en los estudios posteriores.
transfección transitoria de RhoC-siRNA
Debido a que los espectros de emisión de GFP etiquetadas con RhoC shRNA era el mismo que los espectros de emisión de fluorescencia del anticuerpo utilizado para identificar ALDH células positivas, los /GFP desmontables clones RhoC-shRNA transfectadas generados a partir de UM-SCC-1 líneas celulares y -47 no podían utilizarse para identificar y ordenar la CSC subpoblación. En su lugar, desmontables de RhoC se logró transitoriamente en tanto UM-SCC-1 y -47 utilizando RhoC-siRNA (Ambion tecnologías /Life, EE.UU.) y lipofactAMIN 2000 como el portador. La transfección exitosa y la inhibición de RhoC se demostró por la ausencia de su expresión con el análisis de transferencia de Western usando anticuerpo anti RhoC.
cuantitativos reacciones en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa (QRT-PCR)
El ARN total fue aislado por el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). reacciones en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (QRT-PCR) se llevaron a cabo por el sistema de sonda Taqman de Applied Biosystems (Foster City, CA) mediante el uso de los siguientes productos RhoC: Hs00733980_m1, Sox2: Hs01053049_s1, Nanog: Hs02387400_g1 y Oct3 /4 (POUF1 ) Hs01895061_u1. OZ1 y G3PDH se usaron como los normalizadores de datos. cambios relativos en la expresión de los genes se calcularon utilizando el 2
- (- Δ). C
T método [24]
Western blot
Se realizaron análisis de transferencia Western según el protocolo estándar. Los anticuerpos primarios utilizados fueron policlonal RhoC, y p-STAT3
Ser 727, p-STAT3
tyr705 (1:1000 diluciones) y αβ tubulina (como control de carga) (1:2000 diluciones). Estos anticuerpos fueron el producto de Señalización Celular (Tecnologías de Señalización Celular, Inc., Boston, EE.UU.). Después de la incubación con anticuerpos primarios fueron borrados de las membranas durante una hora con anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-conejo (1:2500) (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, EE.UU.). Se utilizó el sistema de señal de ECL-super (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.) para la visualización de proteínas.
Determinación de RhoC activo o [RhoC-GTP]
[RhoC- GTP] en la UM -SCC-1 y -47 revueltos control y RhoC clones desmontables se determinaron por G-LISA como se describe anteriormente [25], utilizando el kit G-LISA (citoesqueleto Inc., Denver, CO, EE.UU.) y siguiendo el protocolo del fabricante usando RhoC anticuerpo primario de Señalización celular Inc.
ligado a enzimas (ELISA)
sobrenadantes libres de suero de control revueltos y líneas celulares knockdown RhoC obtenido después de 48 horas de incubación fueron enviados a la ELISA para Laboratorio de la Universidad de Maryland Core citoquinas, Baltimore, MD. Los valores promedio de IL-6 (después de la normalización con el número de células de donde se recogieron los sobrenadantes) en términos de pg /ml se representan en un gráfico de barras.
La citometría de flujo análisis
Flujo el análisis de citometría de clasificar a cabo las buenas prácticas agrarias, las células ALDH y CD44 positivos se realizó mediante el flujo BD FACS Aria IIU citómetro equipado con un 488 nm, 15 mW, refrigerado por aire láser de argón. Un kit de ALDEFLOUR (Tecnologías celulares, Vancouver, BC, Canadá Stem) se utilizó para la tinción de ALDH. El análisis FACS se realizó en las instalaciones de laboratorio central de flujo en la Universidad Estatal de Ohio Comprehensive Cancer Center.
Tumorspheres formación
Para tumorsphere ensayos de formación que solucionaron las células GFP positivas y los utilizaron para todos los experimentos posteriores . Tumorspheres desde el control mezclado y líneas desmontables RhoC se obtuvieron por el crecimiento de un número igual de células (1 × 10
6) sobre placas de fijación ultra bajo en suero de queratinocitos suplemento de medio libre con EGF 20 ng /ml, bFGF 20 ng /ml , insulina 100 ng /ml, y hidrocortisona 400 ng /ml. Para la propagación de las esferas a la siguiente generación, las esferas se separaron por filtración sobre un filtro de células de 40 M y tripsinizaron brevemente en un baño de agua a 37 ° C. Después de girar a 300 × g paletas de células se volvieron a suspender en tumorsphere medios de comunicación y se sembraron en placas frescas bajas de fijación. Para determinar la eficiencia de la formación de tumorsphere, 500 células de la control mezclado y desmontables RhoC se sembraron en placas de bien bajas de fijación 96. El número de esferas se contaron después de dos semanas de la siembra. Las placas de fijación ultra-bajas fueron el producto de Corning Incorporated, Corning, Nueva York, EE.UU.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos (prueba t de Student) se realizaron utilizando el gráfico Sigma Pad Prism software. 4 . La media se informó con una desviación estándar (± SD). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando
valores de p
eran menos de 0,05.
Resultados
RhoC expresión se reduce significativamente en líneas celulares HNSCC desmontables RhoC
la inhibición de la expresión RhoC se llevó a cabo usando pequeños ARN de horquilla (shRNA) y la metodología de transducción y la infección lentiviral como se describe en la sección de métodos. Después de la infección lentiviral, se seleccionaron clones RhoC desmontables usando puromicina (1,6 mg /ml) a los antibióticos. El número de células que fueron infectadas con éxito se analizó por citometría de flujo. Esto reveló un número muy bajo de células no infectadas (1A-C panel superior Fig.). Además, la microscopía de fluorescencia de los clones estables muestra una fuerte fluorescencia verde en la mayoría de las células, lo que significa una alta eficiencia de la transducción de lentivirus y la infección (panel inferior Fig. 1A-C). Estas células GFP positivas fueron más ordenados y se volverán a crecer durante los experimentos posteriores. La figura 1C es el control negativo que muestra la línea parental sin la infección por lentivirus. Esto representa la diferencia entre expresan GFP (infectados) y las células que expresan GFP no.
células infectadas por lentivirus que muestran la expresión de GFP en UM-SCC-47. (A) Histogramas del control mezclado (control sr) y (B) RhoC desmontables (kd RhoC) obtenido por citometría de flujo. (C) Control negativo. Representación de la expresión de GFP en la fluorescencia y luz brillante se muestran en los paneles inferiores. Alrededor del 90% de las células fueron positivas para GFP significa la transducción exitosa de shRNA utilizando lentivirus recombinante.
A continuación, probamos la eficacia de shRNA expresión en ozono RhoC ARNm mediante PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) en nuestras líneas celulares seleccionadas. Como se muestra en la Figura 2, los niveles de expresión de ARNm del gen RhoC en los clones desmontables fueron significativamente baja (Fig 2A & amp;. D), mientras que la expresión de la proteína no era detectable en la transferencia Western (Fig 2B & amp;. E). En contraste, se observó una expresión suficiente RhoC en los clones con la secuencia de control revueltos-shRNA. La expresión relativa de ARNm RhoC en el control mezclado-shRNA y los clones RhoC desmontables se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa y de la C
valores de T obtenidos se normalizaron utilizando dos genes de limpieza como se describe en la sección de materiales y métodos. Se observó una disminución de aproximadamente el 80% de la expresión de ARNm en RhoC UM-SCC-1 y- 47 clones desmontables en comparación con el control mezclado (Fig 2A & amp;. D). En nuestro estudio anterior, se confirmó que sólo la expresión de ARNm RhoC se inhibió cuando utilizamos construcciones shRNA RhoC hechos con secuencias específicas del ARNm RhoC; Por otra parte, los niveles de expresión de otras proteínas Rho no se vieron afectados en las líneas de células UM-SCC [13]. Por lo tanto, se utilizó la misma RhoC shRNA construye para nuestro estudio actual
(A y D) La expresión de mRNA RhoC obtenido por el tiempo real de RT-PCR.; (B y E). El análisis de transferencia Western que muestra la expresión RhoC en el control mezclado y clones RhoC desmontables (C y F). gráfico de barras que muestra la expresión de RhoC activa [RhoC-GTP] en el control mezclado y RhoC desmontables UM-SCC-1 y 47, respectivamente. Una disminución significativa en RhoC ARNm, proteínas y [RhoC-GTP] Los niveles se obtuvieron en las líneas celulares knockdown RhoC.
A continuación, analizamos la expresión de la proteína RhoC mediante Western blot y observó una disminución dramática de la proteína RhoC en RhoC clones desmontables (figura 2B & amp;. E). Además, se detectó la expresión de RhoC activa [RhoC-GTP] se determinó por G-LISA y un igualmente bajo la expresión de RhoC activo en los clones RhoC desmontables de UM-SCC-1 y 47 (Fig 2C & amp;. F). Estos estudios proporcionan una visión clara acerca de la "desconexión" de la actividad de señalización RhoC por la disminución de los niveles totales de expresión de ARNm RhoC. Otros estudios detallados sobre sus roles funcionales en la metástasis del cáncer podrían llevarse a cabo en futuras investigaciones. Una de las preguntas clínicas más básicos que abordamos en este momento es cómo la función de derribar RhoC afecta a las células tumorales con propiedades de células madre en cáncer de cabeza y cuello. Para abordar esta cuestión, se investigó varias características biológicas de células madre cancerosas, que incluyen el análisis de biomarcadores celular y la capacidad de formar tumorspheres madre. A continuación, se analizaron las moléculas de señalización que mantienen las propiedades de auto-renovación de células madre cancerosas.
La inhibición de la expresión RhoC conduce a la reducción de la población de células ALDH y CD44 positivos en líneas celulares HNSCC
Con el fin de identificar la población CSC en líneas de células UM-SCC, se utilizó el CD44 marcadores de células madre y ALDH junto con células activador de fluorescencia (FACS) para separar y contar el número de células que los expresan. Además, es importante señalar que se utilizaron clones RhoC-siRNA de UM-SCC-1 y -47 para el análisis de FACS para determinar las poblaciones de células positivas ALDH en lugar de lentivirus infectados clones GFP-RhoC-shRNA. Esto fue para evitar la superposición de la fluorescencia de GFP sobre el anticuerpo marcado fluorescente ALDH, ya que su solapamiento espectros de emisión.
Se comparó el número de células positivas ALDH en el control mezclado y las correspondientes líneas desmontables RhoC. En las líneas celulares de control, se observó un 18% y un 10% ALDH células positivas en la población total de UM-SCC-1 y UM-SCC-47, respectivamente. Por el contrario, se detectaron células positivas sólo el 13% (UM-SCC-1) y 4% (UM-SCC-47) ALDH en las correspondientes líneas desmontables RhoC (Fig. 3A). Se observó un patrón similar utilizando CD44, pero el porcentaje de células CD44 positivas era muy alto. Curiosamente, los clones con el control de la secuencia codificada de UM-SCC-1 y -47 mostraron cerca de 98% de células CD44 positivas. En los correspondientes clones desmontables RhoC, hubo un 60% y un 41% de células CD44 positivas, respectivamente (Figura S1). Vale la pena señalar que se trataba de un número anormalmente alto de células CD44 positivas en ambas líneas UM-SCC-1 y 47 células (& gt; 95%) y por lo tanto CD44 no podría ser utilizado como un marcador de células madre para estas líneas celulares. Además, nuestros resultados son similares a los estudios reportados anterior que se ha encontrado CD44 que se expresa abundantemente en las células tumorales de CECC [26].
Análisis FACS que muestra la expresión de (A) ALDH en el control mezclado y la RhoC clones desmontables. (B) La formación tumorspheres en el control mezclado y la caída RhoC líneas -47cell UM-SCC-1 y. (C) La representación de la eficiencia en la formación tumorspheres de control mezclado y RhoC caída UM-SCC-1 obtenido en placas de 96 pocillos. Se observó una disminución significativa en la expresión de ALDH. formación Tumorsphere fue dramáticamente baja en RhoC desmontables UM-SCC-1 y -47, respectivamente. (D) Una disminución significativa en la expresión de ARNm RhoC se obtuvo en la célula adherente RhoC desmontables y en las tumorspheres. (E) Tallo factores de transcripción celular, Sox2, Oct3 /4 y Nanog que muestran significativa regulación a la baja en su ARNm según lo revelado por el tiempo real de RT-PCR en el control mezclado y las esferas de derribo RhoC obtenidos de UM-SCC-1.
líneas HNSCC RhoC desmontables se reducen en gran medida en su capacidad para formar tumorspheres
Las células tumorales con propiedades similares a las células madre son capaces de formar esferas flotantes cuando crece en medios libres de suero no adherente. Por lo tanto, para establecer la función de RhoC en el crecimiento y el mantenimiento de CSC, se investigó la capacidad de formación de tumorsphere en estas líneas celulares. En primer lugar, un número igual de células (1 × 10
6) de las líneas celulares desmontables RhoC control y revueltos fueron sembradas en placas de fijación ultra-bajas para observación. Se seleccionaron cinco campos diferentes de visualizar el número de tumorspheres que se habían formado. En el control mezclado, hubo un alto número de tumorspheres con un menor número de agregados de células. En contraste, se detectó una clara disminución de la formación en tumorsphere RhoC clones desmontables generados a partir de ambas líneas celulares UM-SCC-1 y-47. Por otra parte, hay que señalar que bien límites, un rasgo característico de tumorspheres definida, están presentes sólo en las derivadas de las células de control revueltos, aunque están ausentes cuando se derivan de las células RhoC desmontables (Fig. 3B). En lugar de ello, lo que se ve son pequeños grupos de células o agregados que están desprovistas de cualquier límite exterior bien definido. Por otra parte, estos grupos de células no se propagan o forman esferas después de que se tripsinizaron y re-chapada. Por el contrario, las esferas se generaron fácilmente de las líneas de células de control (secuencia codificados) incluso después de volver a chapado en ellos hasta la quinta generación. También se analizaron tumorsphere eficiencia en la formación de una placa de 96 pocillos usando 500 células por pocillo y se observó que la placa de esferas después de dos semanas. Se observó una notable disminución en el número de esferas (85%) para las células RhoC desmontables en comparación con las células de control (Fig. 3C). Al igual que en el ensayo tumorsphere anterior, se observaron agregados de células a partir de células derivadas de las líneas celulares desmontables RhoC que eran bastante a diferencia de las esferas bien definidas derivadas de los clones de control. Se obtuvo un patrón similar de tumorsphere eficacia de formación cuando el UM-SCC-47 revueltos control y se pusieron a prueba sus correspondientes líneas de derribo RhoC (datos no mostrados). Estos datos sugieren que RhoC es importante para el crecimiento y mantenimiento de las células cancerosas con características similares a células madre en el cáncer de cabeza y cuello.
Análisis de RhoC y células madre factores de transcripción expresión en adherente y tumorspheres en HNSCC
expresión diferencial de RhoC mRNA en células adherentes y tumorspheres
: a continuación, analizamos la expresión de ARNm en las RhoC tumorspheres generados a partir de la línea de células UM-SCC-1 y la comparó con su correspondiente células adherentes usando el tiempo real de RT-PCR. Cabe señalar que las células adherentes utilizados para los experimentos se refieren a la monocapa de células desmontables RhoC control mezclado o que se cultivan en sustrato de cultivo celular estándar. Nuestro resultado muestra que hay una elevada expresión de ARNm en el RhoC UM-SCC-1 revueltos de control cuando se compara con los homólogos desmontables RhoC (Fig. 3D). Curiosamente, la expresión RhoC es mucho mayor en los tumorspheres de control revueltos en comparación con sus homólogos de células adherentes. Esto podría ser debido a la presencia de una mayor concentración de RhoC en tumorspheres donde los números más altos de células madre cancerosas se localizan en comparación con la población de células adherentes control, que presentan una mezcla de células tanto con tallo y de células no madre como características. Esto apoya aún más nuestra hipótesis de que se requiere RhoC para el mantenimiento de CSC como características. Nuestros resultados están de acuerdo con un estudio similar sobre la expresión RhoC en líneas celulares de cáncer de mama, donde las células ALDH positivos mostraron una expresión RhoC mayor en comparación con los no-ALDH células que expresan [27].
Stem factores de transcripción celular son abajo regulado en RhoC tumorspheres desmontables.
el crecimiento y la auto-renovación de las células madre, incluyendo la propagación dependen de la expresión adecuada de la transcripción de células madre núcleo factores nanog, oct3 /4 y Sox2. Por lo tanto, se analizaron los niveles de expresión de estos factores transcripciones de células madre en la caída RhoC y revueltos tumorspheres control generadas a partir de la línea de células UM-SCC-1 por tiempo real RT-PCR. Curiosamente, los niveles de expresión de los tres factores de transcripción núcleo se redujeron dramáticamente en los desmontables células RhoC en comparación con los de control tumorspheres revueltos (Fig. 3E). Sox2 se expresó con mayor fuerza en los tumorspheres de control revueltos, mientras nanog y oct3 /4 fueron ambos expresaron con menos fuerza, pero tenían niveles de expresión similares. Sin embargo, en el homólogos RhoC desmontables, Sox2 y Nanog mostraron los niveles más reducida seguido de oct3 /4. Por otra parte, también hemos buscado en sus niveles de expresión en las células adherentes líneas CECC (codificado control y RhoC caída) a partir del cual se derivaron los tumorspheres. En el UM-SCC-1 revueltos líneas celulares de control y RhoC desmontables, los tres factores de transcripción mostraron niveles similares de expresión como se observa en las tumorspheres que fueron derivados de ellos (Fig. 4A). En el UM-SCC-47 revueltos control, oct3 /4 tenía la expresión más alta seguida de Sox2 y Nanog. Similar a la línea desmontables UM-SCC-1 RhoC, nanog mostró la mayor reducción cuando la expresión RhoC se inhibió seguido de Sox2 (Fig. 4B). En ambas líneas UM-SCC-1 y -47 RhoC desmontables, oct3 /4 mostró la menor cantidad de reducción de la expresión. En conjunto, nuestros resultados demuestran que RhoC media la propagación y la autorrenovación de las células madre cancerosas mediante la regulación del nivel de expresión de los factores de transcripción núcleo de células madre.
en tiempo real de RT-PCR que muestra la expresión de ARNm de Sox2, oct3 /4 y Nanog en células adherentes de UM-SCC-1 (a) y-UM-SCC-47 (B). Una disminución significativa en la expresión de mRNA se observó en los factores de transcripción de células madre en las líneas celulares knockdown CECC RhoC.
La inhibición de la expresión RhoC induce la regulación a la baja de la vía de señalización de STAT3
A continuación, se investigó el posible mecanismo por el cual RhoC regula la expresión de los factores de transcripción celular del núcleo madre. La activación de factores de transcripción de células madre, Nanog, Sox2, y oct3 /4 mediadas a través de transductores de señal y activadores de Transcription3 (STAT3) vía de señalización está bien establecida [28], [29]. Sin embargo, la participación de RhoC en la activación de estos factores de transcripción no se conoce. Por lo tanto, analizamos la expresión de STAT3 total y fosforilada (p-STAT3) en el control mezclado y RhoC desmontables líneas celulares HNSCC. Sorprendentemente, se observó que mientras que los niveles totales de STAT3 se mantuvo sobre la misma en el control mezclado y líneas celulares RhoC desmontables, los niveles de p-STAT3 se reduce en gran medida sólo en los clones RhoC caída. Específicamente, el análisis de transferencia Western reveló reducida fosforilación de la proteína STAT3 en Ser-727 y Tyr-705 residuos (Fig. 5A y B). Es de interés señalar que se necesita que la fosforilación en el último residuo de STAT3 se difunda en el núcleo para unirse a elementos promotores de genes de respuesta STAT3 [30], [31]. Estos resultados apoyan firmemente la idea de que se requiere la vía de señalización RhoC para la activación de STAT3 en líneas HNSCC.
(A y B) análisis de transferencia de Western que muestra la fosforilación de STAT3
ser727 y STAT3
tyr705 en los controles revueltos y el RhoC desmontables UM-SCC-1 y -47, respectivamente. valor normalizado con respecto al total de STAT3 se da como los valores numéricos. disminuciones notables en la fosforilación de STAT3 fueron vistos en el RhoC knock-down UM-SCC-1 y -47 líneas celulares, respectivamente. análisis (C) muestra la proteína p-STAT3
tyr705 en el ectópica sobreexpresado (OE) codificado control y la RhoC desmontables UM-SCC-1. forma fosforilada se detectó sólo en el control mezclado cuando STAT3 se sobreexpresa. Una banda gruesa de STAT3 total puede verse en el panel inferior, confirmando la transfección exitosa de STAT3 en estos clones. (D) en tiempo real RT-PCR que muestra la expresión de STAT3, Sox2, Oct3 /4 y Nanog antes y después de la STAT3 sobre la expresión en el clon knockdown RhoC. La expresión del ARNm de STAT3 fue dramáticamente alta después de que sea más de expresión, mientras que no se observó ningún cambio significativo en la expresión de Sox2, oct3 /4 y Nanog en el clon caída RhoC.
Para confirmar que la fosforilación de STAT3 se produce a través de la vía de señalización RhoC, que ectópica sobre-expresó STAT3 en una línea de caída RhoC (UM-SCC-1). Los niveles totales de STAT3 en el control mezclado y RhoC desmontables clones cuando STAT3 fue sobreexpresados bandas sólidas expuestas, lo que significa una transfección exitosa de STAT3. Apreciablemente, el p-STAT3
tyr705 sólo puede verse claramente en la sobre-expresión de STAT3 revueltos línea celular de control. Más específicamente, en la caída RhoC sobre-expresó clon STAT3, había una fosforilación sin complicaciones de STAT3 en Tyr-705 que se pudo observar, y era muy similar a los niveles de expresión observados en los originales clones RhoC desmontables (Fig. 5C).
Además, se analizaron los niveles de expresión de ARNm de Nanog, Sox2, y oct3 /4 en la STAT3 sobreexpresado RhoC clon desmontables (UM-SCC-1). Como se muestra en la figura 5D, se observó un notable aumento de la expresión STAT3 mRNA en esta línea celular, pero la expresión de los factores de transcripción de células madre núcleo, Nanog, Sox2, y oct3 /4 son-sin cambios y similar a la observada en el RhoC líneas de caída.