Extracto
Nuestros resultados de investigaciones previas mostraron que tanto Ras miembro de la familia homólogo C (RhoC) y el CI-dominio de la proteína activadora de GTPasa 1 ( IQGAP1) se sobre-expresa en tejidos de cáncer gástrico y las células, pero su papel en tumorigenensis no se ha abordado con claridad. En este documento reportamos la proliferación efecto de RhoC y IQGAP1 en células de cáncer gástrico y de la interacción entre dos proteínas en la regulación de la proliferación de células de cáncer gástrico estimulante. Plásmidos y construcciones virales que codifican objetivo siRNA y el ADN se utilizaron para alterar la expresión de RhoC y IQGAP1. método del MTT y el ensayo de incorporación de BrdU se utilizaron para analizar el efecto de RhoC y estructuras diferentes de IQGAP1 sobre la proliferación. Los niveles de proteína de IQGAP1 y RhoC en líneas celulares fueron detectados por Western Blot. ensayos de inmunofluorescencia y co-inmunoprecipitación se aplicaron a investigar la localización y la unión entre RhoC y IQGAP1. Los resultados mostraron que RhoC, IQGAP1 y el fragmento C-terminal de IQGAP1 estimuló significativamente la proliferación de células de cáncer gástrico, y aumentó la expresión de la ciclina E y la ciclina D1. Por el contrario, la reducción de IQGAP1 endógeno o RhoC de siRNA atenúa la proliferación celular. El agotamiento de expresión de siRNA IQGAP1 bloqueado de manera significativa la actividad proliferativa de RhoC constitutivamente activa, mientras que RhoC silenciamiento de siRNA no tuvo efecto sobre la proliferación inducida por IQGAP1 en células de cáncer gástrico. Co-inmunoprecipitación y ensayos de inmunofluorescencia mostraron que RhoC y IQGAP1 unidos entre sí. En conclusión, nuestros resultados sugieren que RhoC estimula la proliferación de células de cáncer gástrico a través IQGAP1 de reclutamiento como un efector
Visto:. Wu Y, Tao Y, Chen Y, W Xu (2012) RhoC Regula la proliferación de las gástrico Las células cancerosas mediante la interacción con IQGAP1. PLoS ONE 7 (11): e48917. doi: 10.1371 /journal.pone.0048917
Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 26 de Junio, 2012; Aceptado: 2 Octubre de 2012; Publicado: 7 Noviembre 2012
Copyright: © 2012 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Fondo de Investigación Especializada para Personal del Programa senior de la Universidad de Jiangsu (. Sin 11JDG114) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (. No 31040002). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
GTPasas Rho puede inducir cierta transducción de señales intracelulares y el impacto de diversas actividades celulares, incluyendo la reorganización del citoesqueleto de actina, la transcripción de genes, la supervivencia y la proliferación [1], [2]. Aunque tres isoformas Rho, RhoA, RhoB y RhoC, exhiben más del 85% de identidad de aminoácidos, que confiere diferencias en la función en las células [3]. proteínas RhoA y RhoC han demostrado tener un papel positivo en la proliferación y la transformación maligna [4], [5], [6], mientras que el papel de RhoB en estos procesos parece ser más divergentes [7], [8]. La mayoría de los estudios mostraron que RhoC tenía múltiples funciones en la metástasis tumoral, la orquestación de la acción de múltiples efectores corriente abajo, la degradación y la reconstrucción de la matriz extracelular (ECM). Sin embargo, sigue habiendo cierta controversia sobre el papel de RhoC en la regulación de la proliferación celular [9], [10], [11], [12]. Los resultados de laboratorio Pila indicaron que RhoA y RhoC siRNA representan herramientas poderosas para la inhibición de la proliferación de cáncer de células, la invasividad y la angiogénesis tanto
in vitro
y
in vivo
[9]. Sun
et al
encontró que la inyección intratumoral de RhoA o RhoC siRNA a ratones desnudos puede inhibir el crecimiento del tumor [13]. Por el contrario, Faried
et al
informó que RhoA promueve el crecimiento tumoral más de RhoC, mientras que RhoC induce metástasis a distancia en comparación con RhoA [11], de acuerdo con esas observaciones por Clark y colegas [14]. Un estudio de Ikoma y sus colegas mostraron que RhoC no afectó el crecimiento del tumor, pero mejora la naturaleza metastásica de cáncer de pulmón mediante la estimulación de la motilidad celular [10]. Por lo tanto, se necesitan más estudios para identificar el papel de RhoC en la regulación de las actividades biológicas de las células tumorales.
IQ-dominio GTPasa de la activación proteínas (IQGAPs) son importantes reguladores de los procesos celulares que incluyen reordenamientos del citoesqueleto en la migración celular , la proliferación y la citocinesis [15], [16], [17]. IQGAP1 es uno de los miembros de las tres IQGAPs de mamíferos relacionados y el cambio en la expresión intracelular o IQGAP1 función ha informado para alterar las actividades de células [17], [18], [19], [20]. Como una proteína de andamiaje, IQGAP1 une múltiples proteínas, tales como oncogenes β-catenina y Src, tumor supresor de E-cadherina y la Rho GTPasas Cdc42 y Rac1, y causa la alteración de comportamientos celulares, especialmente para las células cancerosas. Nuestro estudio anterior mostró que las expresiones más altas de RhoC y IQGAP1 en tejido de cáncer gástrico fueron significativamente inversamente correlacionados con la diferenciación de las células de cáncer gástrico [21]. Por otra parte, los niveles de proteína fueron también relevantes para la proliferación y migración de las células cancerosas. Por lo tanto, la hipótesis de que tanto RhoC y IQGAP1 pueden jugar un papel importante en la transformación celular y la proliferación del cáncer y hay una posible asociación entre ellos. En la presente investigación, se estudió la influencia de RhoC y estructuras diferentes de IQGAP1 sobre la proliferación de células de cáncer y el ciclo celular proteínas relacionadas. También se investigó la relación entre las dos moléculas mediante la aplicación conjunta de siRNA de interferencia y la técnica de la infección viral.
(A) Análisis de transferencia Western de la expresión en células RhoC BGC-823 infectadas con Ad-RhoC-V14. La actividad de proliferación relativa de BGC-823 células infectadas con Ad-RhoC-V14 (B) se examinó por el ensayo de MTT. (* P & lt; 0,05, comparado con el grupo Ad-LacZ). (C) La expresión de la proteína en las células de RhoC BGC-823 transfectadas con siRNA RhoC. (D) El derribo de RhoC inhibió la proliferación de las células BGC-823 (ensayo MTT, * P & lt; 0,05, comparado con el grupo control siRNA). Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes realizados por duplicado cada uno.
Materiales y Métodos
Reactivos
La líneas celulares de cáncer gástrico BGC-823 [ ,,,0],22] y de riñón de mono africanos fibroblastos de líneas celulares COS-7 verdes fueron proporcionados por el Instituto de Biología celular (Shanghai, china). La proteína verde fluorescente (GFP) de plásmido y reactivo de transfección de células Lipofectamina ™ 2000 eran de Invitrogen (Carlsbad, CA); Los plásmidos que codifican la bandera etiquetados IQGAP1 (PFLAG-IQGAP1), Bandera etiquetada fragmento IQGAP1 C-terminal (PFLAG-IQGAP1-C), y la bandera de etiquetado fragmento IQGAP1 N-terminal (PFLAG-IQGAP1-N), y los vectores adenovirales que codifica β-galactosidasa (pAD-LacZ), una forma constitutivamente activa de RhoC (pAD RhoC-V14), la longitud total IQGAP1 (pAD-IQGAP1), y el fragmento C-terminal de IQGAP1 (pAD-IQGAP1-C) fueron regalos de tipo Dr. Gerry Boss y el Dr. Renate Pilz en la Universidad de California, San Diego, EE.UU.. Human-EGF, BrdU, el ratón de anticuerpo anti-BrdU, DNasa I, MTT, Hoechst 33342, anticuerpos secundarios FITC y Cy3 conjugados fueron de Sigma (St. Louis, MO). El anticuerpo anti-IQGAP1 (contra N-terminal del fragmento, 314-422 aa), anti-RhoA anticuerpo, anti-IgG de anticuerpos, anti-CDK1 anticuerpo /CDK2, ARN-interferencia corto (ARNsi) para RhoC y control negativo eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). La Rho C siRNA es un grupo de 3-diana específica 20-25 nt siRNAs diseñado para reducir la expresión de genes con las secuencias de la siguiente manera: secuencia1, el sentido antisentido 5'-3 'y 5' CUACUGUCUUUGAGAACUAtt-UAGUUCUCAA--AGACAGUAGtt-3 '; Secuencia2, el sentido 5'-GCAGGAAGACUAUGAUCGAtt-3 'y antisentido 5'-UCGAUCAUAGUCUUCCUGCtt-3'; Secuencia3, el sentido 5'-CAC-ACCAGCACUUUAUACAtt-3 'y antisentido 5'-UGUAUAAAGUGCUGGUGUG- TT-3'. El anticuerpo anti-IQGAP1 (contra el fragmento C-terminal correspondiente a los aminoácidos 863-1657 de IQGAP1 humano) era de Millipore (Billerica, MA). El anticuerpo anti-RhoC fue de Abcam (Cambridge, MA). El anticuerpo anti-ciclina B fue de Bioworld Tecnología (St. Louis Park, MN). El anticuerpo anti-ciclina D1 y el anticuerpo anti-ciclina E eran de Boster (Wuhan, China). El siRNA para IQGAP1 fue sintetizado por Qiagen (Valencia, CA), la secuencia diana era IQGAP1 5'-AAGTTCTACGGGAAGTAATTG-3 '(5058 a 5078 pb). peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo secundario fue de Rockland Immunochemicals (Gilbertsville, PA). Proteína G Plus /proteína A-agarosa era de Calbiochem (San Diego, CA). Electroquimioluminiscencia (ECL) reactivos eran de Millipore (Billerica, MA). Todos los reactivos utilizados en este estudio fueron de grado analítico.
(A) análisis de transferencia de Western de la expresión IQGAP1 en células de cáncer gástrico BGC-823 líneas infectadas con Ad-LacZ, Ad-IQGAP1-C, Ad-IQGAP1- N o Ad-IQGAP1. (B) En el ensayo de MTT, IQGAP1-C y IQGAP1 sobre las células de expresión de ambos tienen más actividad de proliferación que el grupo control (* P & lt; 0,05, comparado con el grupo Ad-LacZ). (C) El nivel de expresión de la proteína de IQGAP1 en la línea celular de cáncer gástrico BGC-823 transfectadas con siRNA IQGAP1. (D) La proliferación de BGC-823 células transfectadas con siRNA IQGAP1 se examinó por el ensayo de MTT. (* P & lt; 0,05, comparado con el grupo de control siRNA). (E) BGC-823 células fueron transfectadas transitoriamente con plásmidos Bandera-IQGAP1, Bandera-IQGAP1-C, o bandera-IQGAP1-N durante 48 h. Western Blot mostró la expresión de IQGAP1, IQGAP1-N y C-IQGAP1 construye en líneas celulares de BGC-823. Cantidades iguales de lisado de células de cada grupo se cargaron y se transfirieron con anticuerpos anti-IQGAP1 (contra el fragmento C-terminal o N- fragmento terminal). (F) Ensayo de BrdU se utilizó para la proliferación celular análisis. Imágenes representativas de BGC-823 células que expresan los constructos IQGAP1 indicados se tiñeron con anticuerpos contra BrdU (segundo paneles rojos) y Hoechst 33342 para los núcleos (primer panel, azul). Se calculó el porcentaje de células con incorporación de BrdU. se presenta la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (* P & lt; 0,05).
Cultivo celular, transfección e infección
BGC-823 y las células COS-7 se cultivaron en 1 medio de Eagle modificado de Dulbecco × (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C en 5% de CO
2 atmósfera. El medio se cambió cada segundo día y las células se sub-cultivaron a confluencia. Para la transfección, las células fueron sub-cultivadas el día antes de que el proceso y la transfección de células de cáncer gástrico con plásmidos o siRNA se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para la infección, las células 293A fueron transfectadas con vectores adenovirales pAd-LacZ, Pad RhoC-V14, Pad-IQGAP1 y Bloc-IQGAP1-C, y las partículas virales producidas por las células fueron cosechadas y se amplifica. Los virus fueron nombrados Ad-LacZ, Ad-RhoC-14, Ad-IQGAP1 y Ad-IQGAP1-C, respectivamente, y se utilizaron para infectar células BGC-823. En el día antes de la infección, BGC-823 células se sembraron a recién 70-80% de confluencia y se realizó el proceso de infección de acuerdo con las instrucciones del fabricante en el segundo día.
(A) Los niveles de expresión de proteínas de IQGAP1 , IQGAP1-C y RhoC en las células BGC-823. células BGC-823 fueron transfectadas transitoriamente con IQGAP1 siRNA o RhoC siRNA durante 24 h. Las células transfectadas se infectaron posteriormente con Ad-RhoC-V14, Ad-IQGAP1-C o Ad-IQGAP1 durante 48 horas adicionales seguidas de transferencia Western. (B) RhoC agotamiento no afectó significativamente IQGAP1 o IQGAP1-C proliferación inducida de células BGC-823. (C) El silenciamiento de IQGAP1 de siRNA marcadamente inhibida la proliferación celular inducida por RhoC en las células BGC-823. (Ensayo de MTT, * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01). Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes realizados por duplicado cada uno.
Western Blot
Las células cultivadas se lavaron tres veces en PBS y se lisaron con tampón RIPA (Tris 50 mM -HCl, pH 7,4, 1% (v /v) de Triton X-100, EDTA 1 mM, leupeptina 1 mM, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, mM NaF 10, 1 mM Na
3Vo
4). Cantidades iguales de proteína fueron separadas por 8% o 12% de SDS-PAGE de acuerdo con el peso molecular de la proteína. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 ° C, y los anticuerpos secundarios correspondientes se incubaron durante 1 h a TA. Se realizaron tres lavados con TBS /T después de cada incubación de anticuerpo. reactivos ECL se usan para mostrar las bandas positivas sobre la membrana.
células (A) BGC-823 fueron infectadas con Ad-IQGAP1, Ad-IQGAP1-C o Ad-RhoC-V14 durante 48 h, y Western blot se utilizó para analizar la expresión de ciclina e, ciclina D1 y ciclina B CDK. (B) células BGC-823 fueron transfectadas con siRNA IQGAP1 o RhoC siRNA durante 72 h, y las expresiones de ciclina E, ciclina D1, ciclina B y CDK se analizaron por transferencia Western. (C) Las expresiones proteína de ciclina E, ciclina D1, ciclina B y CDK en las células BGC-823 que fueron transfectadas transitoriamente con IQGAP1 siRNA o RhoC siRNA durante 24 h y después infectadas con Ad-RhoC-V14, Ad-IQGAP1-C o Ad-IQGAP1 durante 48 h adicionales (Resultados de Western Blot).
Ensayo MTT
0,5-1 x 10
3cells en 150 l de medio se sembraron en el pocillo de placas de 96 pocillos. Después de la unión, las células se infectaron con adenovirus correspondiente durante 48 h, o transfectadas con siRNA durante 72 h, respectivamente. En grupos de combinación, las células fueron transfectadas con siRNA dirigidos RhoC o IQGAP1 durante 24 horas y después se infectaron con Ad-IQGAP1-C /Ad-IQGAP1 o Ad-RhoC-V14 para un adicional de 48 horas a 37 ° C en 5% de CO
2. Las células cultivadas se lavaron con PBS, se trataron con 20 l de MTT (0,5 mg /ml), y después se incubaron a 37 ° C durante 1 h. Se retiró el medio y se añadieron 100 l de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada pocillo. La absorbancia se determinó a 490 nm usando un lector de microplacas. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
BGC-823 células (A) que crecen en placas de 100 mm fueron transitoriamente co-infectadas con Ad-IQGAP1 y Ad-RhoC-V14, o Ad-IQGAP1-C y Ad- RhoC-V14 para 48 h. Las células se lisaron y cantidades iguales de proteína de lisado se inmunoprecipitaron (IP) con anti-RhoC, los anticuerpos anti-IgG o IQGAP1 isotipo. lisado de células enteras se usó como un control de entrada de la proteína. (B) células BGC-823 fueron transfectadas con adenovirus anteriormente para 24 a 48 h, y la co-localización de RhoC y IQGAP1 en las células se determinó por microscopía de inmunofluorescencia usando anticuerpos anti-anti-IQGAP1 RhoC y. Los núcleos se tiñeron por Hoechst 33342 (azul). (C) células COS-7 fueron transitoriamente co-infectadas con Ad-IQGAP1-C /Ad-IQGAP1 y Ad-RhoC-V14 durante 48 h. Las células fueron sometidas al mismo procedimiento Co-IP ha descrito anteriormente. (D) células COS-7 se transfectaron con vectores adenovirales anteriores para 24 a 48 h, y la co-localización de RhoC y IQGAP1 en las células se demostró por inmunofluorescencia. Los datos son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares.
Ensayo de incorporación de BrdU
La tasa de síntesis de ADN se midió con la incorporación de BrdU por inmunofluorescencia. La cantidad de siembra de las células se ajustó para alcanzar una densidad de 70 a 80% de confluencia en el día de la transfección. El plásmido PFLAG-IQGAP1, PFLAG-IQGAP1-C o PFLAG-IQGAP1-N se co-transfectadas con el plásmido de GFP en células BGC-823 usando Lipofectamina ™ 2000 como se describió anteriormente. 24 h después de la transfección, las células se privaron de suero durante la noche, se trató con 200
μ
M BrdU y se incubaron durante aproximadamente 16 h. Después, las células se lavaron con PBS, se fijaron en recién preparada 4% (v /v) de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 10 min, y se permeabilizaron con 0,5% (v /v) de Triton X-100, seguido de incubación con DNasa I (0,5 U /l) durante 30 minutos a 37 ° C. Las células se incubaron con el anticuerpo primario contra BrdU durante la noche a 4 ° C seguido de anticuerpo secundario conjugado con Cy3 para 1 h a TA. Por último, los núcleos fueron contra-teñidas con Hoechst 33342 durante 15 minutos, se enjuagaron con PBS tres veces y visualizados bajo microscopía de fluorescencia. Cada ensayo se realizó por cuadruplicado y se repite tres veces.
Cuando RhoC es estimulado por señales intracelular extracelular o, se une con la proteína andamio IQGAP1, influye en la expresión de proteínas relacionadas con el ciclo celular, tales como la ciclina D1 y ciclina B, afecta a las transiciones G1-S en el ciclo celular, y luego hace que el cambio en la proliferación celular. El evento de transducción de señales a través del cual IQGAP1 afecta a la expresión de la ciclina todavía tiene que ser dilucidado.
Co-inmunoprecipitación
Para investigar la interacción entre RhoC y IQGAP1, COS-7 y BGC -823 células fueron co-infectadas con Ad-IQGAP1 o Ad-IQGAP1-C, y Ad-RhoC-V14 durante 48 horas y luego se lisaron con tampón RIPA como se ha descrito. Se utilizó el anticuerpo contra RhoC, IQGAP1 o isotipo IgG para la inmunoprecipitación, respectivamente. Los inmunoprecipitados se analizaron por transferencia Western como anteriormente, usando anti-RhoC o anticuerpo anti-IQGAP1.
inmunofluorescencia Microscopía
Las células cultivadas en cubreobjetos se fijaron con 4% recién preparada (v /v ) de paraformaldehído en PBS durante 15 min, permeabilizaron con 0,3% Triton X-100 en PBS durante 10 min, y se bloqueó con 3% (w /v) de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. Por inmunofluorescencia, las células en cubreobjetos se incubaron secuencialmente con anticuerpo policlonal de conejo contra IQGAP1 a 4 ° C durante la noche, FITC-conjugado IgG de cabra anti-conejo durante 1 h a TA, el anticuerpo monoclonal de ratón contra RhoC durante 2 h a RT, y finalmente IgG de cabra anti-ratón conjugado con Cy3 para 1 h a TA. Se realizaron tres lavados después de cada incubación de anticuerpo. Los núcleos fueron contra el teñidas con Hoechst 33342. El resultado se observó bajo un microscopio de fluorescencia montado con una cámara CCD (Leica).
Análisis estadístico
Los datos fueron analizados utilizando una de dos colas ANOVA o estudiante de
t-test
con el software estadístico SPSS, y se expresan como media ± desviación estándar (SD).
P
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
RhoC promovió la proliferación de las células BGC-823
El efecto de RhoC sobre la proliferación celular se también investigado. células BGC-823 fueron infectadas con adenovirus que codifica RhoC constitutivamente activa y la proliferación celular se detectó mediante el ensayo de MTT. Los resultados mostraron que RhoC también promovió la proliferación de células de cáncer gástrico BGC-823. La sobreexpresión de la RhoC-V14 en las células BGC-823 causado aumento 48,7% en la proliferación celular (Fig. 1A y B). Mientras tanto, el agotamiento de RhoC de siRNA redujo la proliferación de células BGC-823 un 43,1% (fig. 1C y D).
IQGAP1 Enhanced la proliferación de las células BGC-823
(1) los resultados del ensayo de MTT.
para evaluar la contribución de IQGAP1 a la proliferación, se utilizó el ensayo de MTT para detectar la viabilidad de la línea celular de cáncer gástrico BGC-823. Los resultados mostraron que en comparación con las células de control (grupo Ad-lacZ), la alta expresión del fragmento C-terminal de IQGAP1 (grupo Ad-IQGAP1-C) o IQGAP1 longitud completa (grupo Ad-IQGAP1) una mayor proliferación de las células por 116% y 39%, respectivamente (
*
P & lt; 0,05,
*
P. & lt; 0,05, figura 2A y B). En contraste, el fragmento N-terminal de IQGAP1 no tiene efecto evidente sobre la proliferación celular. Por otro lado, la interferencia de la expresión IQGAP1 con ARNsi reduce la proliferación celular en un 43%, en comparación con el control negativo (
*
P & lt;. 0.05, Fig 2C y D). Estos resultados indicaron que IQGAP1 fue capaz de acelerar la proliferación celular; el dominio activo se encuentra en el fragmento C-terminal de la proteína.
(2) Resultados de ensayo de incorporación de BrdU.
El ensayo de incorporación de BrdU se obtuvo un patrón de respuesta similar a la observada en ensayo de MTT. Expresión de Flag-IQGAP1 y Flag-IQGAP1-C marcadamente promueve la síntesis de ADN a los niveles casi 1-flod y 2 veces que la observada con Flag-D1 (* P & lt; 0,05, * P & lt;. 0.05, Fig 2E y F) , mientras que IQGAP1-N no muestra ningún efecto sobre la síntesis de ADN, lo que sugiere que IQGAP1 regula de manera diferente la síntesis de ADN a través de diferentes dominios.
Asociación entre RhoC y IQGAP1 en estimular la proliferación de células BGC-823
(1) RhoC y IQGAP1 no afectó la expresión entre sí.
los resultados anteriores sugieren fuertemente que tanto RhoC y IQGAP1 contribuyeron a la proliferación de las células BGC-823. Con el fin de dilucidar la posible asociación entre RhoC y IQGAP1 en la regulación de la proliferación celular, que en primer lugar investigó si IQGAP1 y RhoC afectan su expresión entre sí. BGC-823 células fueron transfectadas con siRNA para derribar la expresión de RhoC o IQGAP1, y luego se infectaron con adenovirus que codifica IQGAP1, IQGAP1-C o RhoC constitutivamente activa respectivamente. Western Blot se aplica para detectar si el cambio de la expresión y actividad de una proteína puede afectar a la expresión de la otra proteína o no. Los resultados mostraron que el aumento exógeno o desmontables de IQGAP1 endógeno o IQGAP1-C, no afectaron a la expresión RhoC. Del mismo modo, el aumento de RhoC constitutivamente activa o interferencia de endógeno RhoC no afectó la expresión de IQGAP1 o IQGAP1-C (Fig. 3A).
(2) IQGAP1 era un efector de RhoC en la estimulación de la proliferación de las células.
MTT ensayo se utilizó para dilucidar la relación entre RhoC y IQGAP1 en la estimulación de la proliferación. Los resultados mostraron que RhoC-siRNA tenía efecto no es evidente en la proliferación causada por IQGAP1 (** P & lt; 0,01, Fig 3B.). Sin embargo, el agotamiento de expresión de siRNA IQGAP1 bloqueó la proliferación causada por la expresión de RhoC constitutivamente activa (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, Fig 3C.). Esto indica que durante el proceso de estimulación de la proliferación de las células BGC-823, RhoC requiere la participación de IQGAP1. Además, puesto que el efecto de RhoC requiere IQGAP1 mientras que el efecto de IQGAP1 no requería RhoC, RhoC podría ser el de aguas arriba de IQGAP1 y tomó IQGAP1 como un efector.
Efecto de RhoC y IQGAP1 en la expresión de proteínas del ciclo celular relacionadas
para confirmar aún más el efecto de la proliferación estimulante de RhoC y IQGAP1 e investigar el posible mecanismo a través del cual estas proteínas regulan la proliferación de las células, se aplicó transferencia Western para detectar la expresión de proteínas relacionadas con el ciclo celular en las células tratadas con los métodos de aumentando o disminuyendo RhoC y IQGAP1. Los resultados mostraron que el aumento de RhoC y IQGAP1 estimulado la expresión de la ciclina E y la ciclina D1, mientras que no tuvo efecto de la expresión de la ciclina B y CDK1 /2. Por otro lado, la disminución de RhoC y IQGAP1 inhibió la expresión de la ciclina E y la ciclina D1. Mientras tanto, en el caso de RhoC silenciamiento de siRNA, aumentando IQGAP1 o IQGAP1-C todavía mejorar la expresión de la ciclina E y la ciclina D1 (Fig. 4). Dichos resultados indican que RhoC y IQGAP1 podrían regular la proliferación mediante el cambio de la expresión de la proteína relacionada con el ciclo celular y causando más células para entrar en la fase S.
RhoC y IQGAP1 co-localizados y Bound entre sí en las células
la inmunofluorescencia y método de co-inmunoprecipitación se aplicaron a examinar más a fondo la posible unión entre RhoC y IQGAP1. Tanto BGC-823 y COS-7 células fueron co-infectadas con Ad-IQGAP1 y Ad-RhoC-V14 o Ad-IQGAP1-C y Ad-RhoC-V14 durante 48 h, y el lisado celular total se inmunoprecipitó con anticuerpos anti-RhoC anticuerpo y se sondaron con anticuerpo contra IQGAP1, o inmunoprecipitó con anticuerpo anti-IQGAP1 y se sondaron con anticuerpo contra RhoC, respectivamente. Los resultados mostraron RhoC y IQGAP1 unidos entre sí, con el fragmento C-terminal de IQGAP1 como el sitio de unión con RhoC (Fig. 5A y C). Por otra parte, el ensayo de inmunofluorescencia reveló que IQGAP1 se distribuye principalmente en el citoplasma, donde co-localizada con RhoC (Fig. 5B y D).
Discusión
incontrolada proliferación de células cancerosas requiere la coordinación y función estrictamente regulados de muchas proteínas [23], [24], [25], [26]. Es, por lo tanto, crucial para estudiar el mecanismo de cómo esas proteínas interactúan en la regulación de la proliferación de células cancerosas. Nuestros resultados anteriores han documentado que la expresión de IQGAP1 y RhoC se incrementaron en los tejidos de cáncer gástrico y líneas celulares de cáncer [21]. El nivel de sus expresiones tuvo una correlación significativa con la pobre diferenciación del cáncer gástrico. Sin embargo, no es muy claro acerca de si IQGAP1 y RhoC están asociados con la proliferación celular en tumorigenensis. En este estudio, el nivel de expresión de IQGAP1 y RhoC y sus actividades biológicas en la línea celular de cáncer gástrico BGC-823 se ajusta a través de la infección con constructos adenovirales o la transfección con ADN de plásmido o siRNA. A continuación, la proliferación de la célula se investigó mediante ensayo de incorporación de BrdU y el método MTT. Los resultados mostraron que constitutivamente activa RhoC promovió significativamente la actividad de proliferación de la línea celular de cáncer gástrico BGC-823, y el agotamiento de RhoC por siRNA inhibe los rasgos. Datos de la investigación han demostrado que RhoC tuvo un papel importante en la migración celular y la metástasis [27], [28], [29], [30], [31], pero había algunas contradicciones sobre si RhoC regular el proceso de transformación y proliferación en células tumorales [27], [29], [32]. Nuestros resultados proporcionan evidencia de que RhoC tienen efecto sobre la proliferación de estimular células de cáncer gástrico. Esto será útil en la elucidación de la función de RhoC en la regulación de la proliferación de células cancerosas.
Nuestros resultados mostraron que similar a RhoC, la sobre expresión de IQGAP1 exógeno y IQGAP1-C proliferación también promovido de células BGC-823, mientras que desmontables de endógeno IQGAP1 atenuó la capacidad de proliferación de la célula, lo que indica que IQGAP1 también contribuye a la regulación de la proliferación celular. Teniendo en cuenta que tanto RhoC y IQGAP1 tienen papel en la regulación de la proliferación de células de cáncer y sus expresiones están altamente correlacionados, hemos explorado aún más la asociación funcional entre RhoC y IQGAP1. Los resultados mostraron que en BGC-823 células con knock-down de expresión IQGAP1, la infección con adenovirus codificación RhoC constitutivamente activa no podría estimular la actividad de proliferación más; mientras que en BGC-823 células con knock-down de expresión RhoC, la sobreexpresión o IQGAP1 IQGAP1-C a través de la infección de las células con adenovirus que codifican el ADN correspondiente todavía causaron una mayor actividad de proliferación. Esto indicó que RhoC condujo la proliferación del tumor a través de IQGAP1, específicamente a través del fragmento C-terminal de IQGAP1. Esta asociación funcional entre RhoC y IQGAP1 fue apoyado además por el Co-inmunoprecipitación e inmunofluorescencia. Estos resultados sugieren que RhoC tomó IQGAP1 como un efector en la regulación de la proliferación celular del cáncer, arrojando nueva pista sobre la relación de estas proteínas.
Para explorar principalmente el mecanismo de aguas abajo a través del cual RhoC /IQGAP1 a regular la proliferación de células de cáncer gástrico , se investigó el efecto de RhoC /IQGAP1 en la expresión de proteínas relacionadas con el ciclo celular, incluyendo la ciclina e, ciclina D1, ciclina B y quinasa dependiente de ciclina (CDK). Los resultados mostraron que tanto RhoC y IQGAP1 estimulado la expresión de la ciclina E y la ciclina D1, pero no tuvo ningún efecto sobre la expresión de la ciclina B y CDK. La proliferación de las células eucariotas es controlado en puntos específicos en el ciclo celular, particularmente en la primera fase de separación (G1) a la fase de ADN sintético (S) y la segunda fase de separación (G2) a la mitosis transiciones (M). De los cuales, las transiciones G1-S es el principal punto de la regulación del ciclo celular. Ciclina D1 y ciclina E controlan la progresión celular a través de la promoción de G1 a la fase S del ciclo celular. Nuestros resultados sugieren que cuando RhoC fue activado por la señal extracelular o intracelular, es obligado a IQGAP1 y luego influyeron en la expresión de proteínas relacionadas con el ciclo celular directa o indirectamente a través de algunos pasos de transducción de señales poco claras, lo que eventualmente podría conducir a la modificación de la progresión celular y la proliferación (Fig. 6).
en conclusión, estos datos del estudio actual, en conjunción con los datos publicados previamente [21], apoyan la hipótesis de que RhoC participa tanto en la migración y proliferación de células de cáncer gástrico. IQGAP1 participan también la regulación de la proliferación de células cancerosas como un efector aguas abajo de RhoC. Estos datos pueden brillar luces en el desarrollo de enfoques terapéuticos para el cáncer gástrico.
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Gerry Boss y el Dr. Renate Pilz en la Universidad de California, San Diego, CA, EE.UU., para los regalos buenos de construcciones adenovirales.