Extracto
RhoE, un nuevo miembro de la familia de proteínas Rho, es un regulador clave del citoesqueleto celular y la migración. Nuestro grupo ha demostrado previamente que RhoE como objetivo directo de HIF-1α y media epitelial inducida por hipoxia a la transición mesenquimales en células de cáncer gástrico. Por lo tanto, se asumió que RhoE podría desempeñar un papel importante en la metástasis del cáncer gástrico. En el presente estudio, hemos explorado el papel de la expresión RhoE en el cáncer gástrico, la invasión celular y la metástasis, y la influencia de RhoE en la regulación de la expresión de los genes potencial río abajo. expresión RhoE fue elevado en los tejidos de cáncer gástrico en comparación con los tejidos gástricos normales. También se encontró una estrecha correlación entre el grado histológico y el diagnóstico del paciente. Sobre regulación de RhoE mejorado significativamente las capacidades migratorias e invasivas de células de cáncer gástrico tanto
in vitro
y
in vivo
. Por otra parte, la baja regulación de RhoE disminuye el potencial metastásico de las células cancerosas. matriz de PCR y la posterior transwell ensayo mostraron que la regulación de la metástasis del cáncer gástrico por RhoE fue parcialmente mediada por CXCR4. Esta observación sugirió que CXCR4 podría ser un efector aguas abajo de RhoE. En resumen, nuestro estudio identificó RhoE como un nuevo biomarcador pronóstico y metastásico gen promotoras de cáncer gástrico
Visto:. Feng B, Li K, Zhong H, Ren G, H Wang, Shang Y, et al. (2013) RhoE promueve la metástasis en el cáncer gástrico a través de un mecanismo dependiente del mayor expresión de CXCR4. PLoS ONE 8 (11): e81709. doi: 10.1371 /journal.pone.0081709
Editor: Sharmila Shankar, Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Enero, 2013; Aceptado: 24 Octubre 2013; Publicado: 29 Noviembre 2013
Copyright: © 2013 Feng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación básica de China (n: 2009CB521700), el Programa de alta Tecnología Nacional de Investigación y Desarrollo de China (n: 2006AA02A253) y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología Programa de Soporte durante el XI Programa quinquenal Período del plan (n: 2006BAI02A14). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es la segunda causa principal de muerte por cáncer en el mundo y la metástasis del tumor es el mayor obstáculo para su éxito del tratamiento y la principal causa de mortalidad de los pacientes [1,2]. Durante décadas, numerosos estudios han tratado de entender los procesos y mecanismos de la metástasis en el cáncer gástrico. En los últimos años, se ha encontrado que epitelial mesenquimal (EMT) es de importancia crucial en este proceso y contribuye en gran medida a la invasión de células de cáncer y la metástasis. Una posible razón es que durante la EMT, el citoesqueleto es modulada fundamentalmente, lo que lleva a la dispersión de células tumorales [3].
RhoE pertenece a un subgrupo de las proteínas Rho, que desempeñan un papel clave en la formación del citoesqueleto , la motilidad celular, el ciclo celular y la apoptosis [4,5]. A diferencia de las proteínas típicas Rho, que el ciclo entre un estado activa unida a GTP y un estado de reposo unida a GDP, RhoE carece de actividad GTPasa intrínseca y siempre se presenta como la forma activa unida a GTP [6]. Esta característica única indica que la función de RhoE está regulada esencialmente a través de su expresión en lugar de por su actividad.
Recientemente, varios estudios encontraron que la expresión anormal de RhoE se asoció con la carcinogénesis y que RhoE podría actuar como un gen supresor de tumor o un oncogen, dependiendo del origen del cáncer [7-9]. Del mismo modo, RhoE tiene diferentes influencias sobre la metástasis en diferentes tipos de cáncer. En el melanoma, RhoE apoya la migración y la invasividad de las células tumorales mediante la regulación del citoesqueleto de actina [10]. Sin embargo, en el carcinoma hepatocelular, RhoE representa a sí misma como una proteína supresora de la metástasis tumoral [11,12].
Antes, nuestro grupo ha encontrado que RhoE fue mayor en células de cáncer gástrico mediante la inducción de la expresión de HIF-1α en virtud condiciones de hipoxia y EMT promovido de células de cáncer gástrico [13]. Por lo tanto, la hipótesis de que RhoE puede tener una contribución positiva en la metástasis del cáncer gástrico. En el presente estudio, se investigó el efecto de RhoE en la metástasis de las células de cáncer gástrico y los mecanismos subyacentes.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
El adenocarcinoma gástrico humano líneas celulares SGC7901, MKN-45, MKN-28, KATO-III y las mucosas gástricas normales GES línea celular se conservaron en nuestro instituto [14-16]. Además, la línea de cáncer gástrico por células SGC7901-M, que tiene un alto potencial metastásico, y SGC7901-NM, que tiene una capacidad metastásica pobres, se establecen y se mantienen en nuestro instituto [17]. Todas las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal 10% (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera totalmente humidificada de 5% de CO2.
Array de tejidos
Para aplicaciones de inmunotinción, dos arrays de tejido de cáncer gástrico humano se adquirieron comercialmente de aventajan Biotech Co. Ltd (Shanghai, China). Una matriz de tejido contenía 90 puntos de tejido tumoral e igualó manchas de tejidos no tumorales adyacentes que se obtuvieron de 90 pacientes (con 5.3-6.1 años de seguimiento). El fabricante proporcionó el género, la edad, y los parámetros clínico-patológicas de los pacientes. La otra matriz contenía 120 puntos con 40 puntos primarios de tejido tumoral, 40 manchas de tejidos no tumorales adyacentes emparejados, y 40 emparejados metástasis de ganglios linfáticos manchas.
Inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se realizó usando Histostain ™ Plus kits (Zhongshan Goldenbridge Biotech, China) según las instrucciones del fabricante. El anticuerpo de ratón anti-RhoE (diluido 1: 100; Upstate, MA, EE.UU.) o anticuerpo-CXCR4 contra (diluido 1: 200; Sigma-Aldrich, MO, EE.UU.) se utilizaron en el ensayo de IHC como primer anticuerpo. IgG de ratón se utilizó en lugar de la primera anticuerpo como control negativo en estos estudios. El resultado obtenido se evaluó semi-cuantitativamente mediante la asignación de las puntuaciones para la intensidad de la inmunorreactividad y de la proporción de células teñidas positivamente tal como se describe por otros. La intensidad de la inmunoreactividad se divide en cuatro categorías y obtuvo como ausente (-; puntuación: 0), débil (+; puntaje: 1), moderada (++; puntuación: 2), o fuerte (+++; puntuación: 3 ) de acuerdo con la intensidad de la tinción que se observó en la mayoría de las células epiteliales gástricas. La proporción de células positivas se clasifican en cuatro grupos: (1), 0-25% de las células tumorales que presentan inmunorreactividad; (2), 25-50% de las células; (3), 50-75 puntos porcentuales de las células; y (4), 75 a 100% de las células. La puntuación global fue el producto de los dos [18].
Análisis Western Blot
Las muestras de proteínas se extrajeron a partir de células o tejidos por sonicación en un tampón de lisis (NaCl 150 mM, Tris 50 mM -HCl (pH 8,8), 0,1% SDS, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, 1% de NP40, 5 mg /ml de aprotinina, 1 mg /ml de leupeptina) en hielo, luego se centrifugaron a 12.000 rpm durante 10 min. Las proteínas fueron resueltas por SDS-PAGE y electrotransferred a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, CA, EE.UU.). La unión no específica fue bloqueada con 5% de leche descremada durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, la membrana se incubó por separado con el anticuerpo anti-RhoE (diluido 1: 400; Upstate, MA, EE.UU.), anticuerpo anti-CXCR4 (diluido 1: 1000; Sigma-Aldrich, MO, EE.UU.), anticuerpo anti-VEGFA (diluido 1 : 500; Abcam, MA, EE.UU.), anticuerpo anti-CD82 (diluido 1: 1000; Abcam, MA, EE.UU.), anticuerpo anti-CTSK (diluido 1: 1000; Santa Cruz, Texas, EE.UU.) o anticuerpo β-actina ( diluido 1: 10000; Sigma-Aldrich, MO, EE.UU.) durante la noche a 4 ° C. Después de cuatro lavados con tampón TBS-T, las membranas se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (diluido 1: 2000; Santa Cruz, Texas, EE.UU.) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de 4 lavados con tampón TBS-T, las bandas fueron desarrolladas con SuperSignal Substrato quimioluminiscente (Thermo Scientific, MA, EE.UU.) para visualizar las proteínas. Las transferencias fueron luego analizados por Cantidad One® software (versión 4.2. Bio-Rad, CA, EE.UU.) siguiendo la Guía del usuario. Western blot para la expresión β-actina se utilizó como control interno.
expresión ectópica y siRNA mediada por silenciamiento
Para la expresión ectópica de los genes diana, células de cáncer gástrico fueron transducidas con el vector de lentivirus que expresan RhoE o CXCR4 (proporcionado por GeneChem, Shanghai, china). Brevemente, se sembraron las células y se cultivaron a 75 a 80% de confluencia sin antibióticos, después de lo cual se añadieron los vectores lentivirales a las células en medio de crecimiento que contiene polibreno (2 mg /ml) a una MOI de 50. A continuación, las células se cultivaron durante otra 72 h y la eficacia de la infección se comprobó mediante microscopía de fluorescencia y análisis de transferencia Western. Interferencia de expresión RhoE o CXCR4 humana se consiguió usando una técnica de interferencia de ARN. dúplex de siRNA se sintetizaron por Takara Biotecnología (Liaoning, China) y las secuencias específicas de RhoE o CXCR4 se definen así:
RhoE, 5'-GAACGUGAAAUGCAAGAUAUU-3 ';
CXCR4, 5'-UAAAAUCUUCCUGCCCACC-3 '.
dúplex Control de siRNA fueron diseñados después de interrogar a la base de datos BLAST con secuencias de direccionamiento no específicos. Las células fueron transfectadas con dúplex de oligonucleótidos utilizando LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, Nueva York, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante, a raíz de la que fueron sometidos a análisis más de 48 horas después de la transfección.
Ensayo de cicatrización de heridas
Para detectar la motilidad celular, las células en fase exponencial fueron sembradas en placas de 6 pocillos. Después de que las células alcanzaron la confluencia como una monocapa de células sobre el sustrato de placa, una punta de pipeta de plástico se dibuja a través del centro de la placa para producir un 1 mm de área de la herida amplia limpio y el medio fue reemplazado con RPMI1640 fresco que contiene 1% de suero bovino fetal . Después de 48 h, el movimiento celular en el área de la herida se evaluó utilizando un microscopio de contraste de fases como se describe anteriormente [19,20].
Invasión Ensayo
ensayos de invasión celular se realizaron con una placa transwell (Corning, NY, EE.UU.), recubierta con Matrigel (Becton Dickinson, NJ, EE.UU.). Brevemente, Matrigel se diluyó a una concentración de 2 mg /ml, y 50 l de esta solución se colocó en un filtro de policarbonato y se secaron al aire. Después de enjuagar con PBS, los filtros se colocaron en los pocillos y se añadió FBS 700 l de medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con 10% en la cámara inferior. Las células se resuspendieron en medio RPMI-1640 que contiene 1% de FBS y 1 x 105 células en 0,2 ml de medio definido se sembraron en la cámara superior. Las células en las cámaras de invasión se incubaron en un incubador humidificado durante 12 a 48 h. Después de una incubación adicional, las células que penetraron los poros de la membrana y se dispersa a la superficie inferior de los filtros se tiñeron con solución de cristal violeta 5% para la visualización. A continuación, las células invadidas en cada pocillo se contaron bajo un microscopio de luz (Olympus, Tokio, Japón) y se cuantificaron a partir de la visualización de cinco campos aleatorios con un aumento de x 200 y se promediaron como se describe por Albini [21]. El ensayo de invasión se repitió 3 veces. El valor de la gráfica de barras que representa el número medio de células invadidas de 3 experimentos separados.
vena de la cola metastásico Ensayo
La vena de la cola se determinó ensayo metastásico como se informó anteriormente [22]. Treinta ratones desnudos masculinos fueron manejados utilizando las mejores prácticas humanas y se cuidaron de acuerdo con las directrices del NIH Cuidado de Animales y el empleo. Las células se recogieron usando tripsina y se lavaron tres veces con PBS. Los ratones fueron inyectados con 1 x 106 células en 0,1 ml de PBS a través de la inyección en vena de cola. Los ratones fueron controlados a continuación para la salud general y el peso corporal total. En el día 28o después de la inyección, se sacrificaron los ratones. tejidos de pulmón e hígado se observaron a simple vista y el número de tumores visibles en la superficie del pulmón y el hígado se cuantificaron. tejidos de pulmón e hígado se cortaron en secciones en serie, se tiñeron con hematoxilina y eosina, a continuación, se observaron con un microscopio de luz. Los grupos experimentales y de control contenían cada 6 ratones. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar Animal Experimental, la Cuarta Universidad Médica Militar. Los experimentos con animales se realizaron con la aprobación del Comité Institucional para la Investigación Animal, de conformidad con las directrices nacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
Tumor Metástasis matriz PCR
La expresión de metastasis- genes asociados se determinaron por el tumor humano Metástasis PCR array (HAP-028A; SuperArray Biosciences, Maryland, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. En primer lugar, el ARN total fue extraído de RhoE-lentviral infectados SGC7901 células y células de control utilizando protocolos estándar, que luego se convirtió a cDNA de primera cadena. El molde de ADNc se combinó con una SuperArray PCR master mix 2 ×, a los pocillos de una placa de matriz de PCR (384 pocillos) que contiene los conjuntos de cebadores específicos de gen, y se sometió a PCR en tiempo real. Las condiciones de los ciclos de PCR fueron las siguientes: 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 min, y 72 ° C durante 30 s. Cinco genes de limpieza se utilizaron como controles internos. El factor de cambio en la expresión de genes relacionados con la metástasis se determinó por el método ΔΔCt.
Análisis estadístico
El análisis de datos se realizó utilizando el software de análisis estadístico SPSS 17.0 (Chicago, IL, ESTADOS UNIDOS). Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para evaluar la significación de las diferencias en la frecuencia de expresión de RhoE entre los tejidos de cáncer gástrico y metástasis en los ganglios linfáticos. La prueba de Kruskal-Wallis H para múltiples grupos, y la prueba de Mann-Whitney para las dos comparaciones de grupos se emplearon para analizar la relación entre ambos niveles de expresión Rhoe y diversos factores clínico-patológicos de especímenes de cáncer gástrico. el tiempo de supervivencia acumulada se calculó utilizando el método de Kaplan-Meier y se analizó mediante la prueba de log-rank. Los análisis univariados y multivariados se basaron en el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox. Las comparaciones de los datos cuantitativos se analizaron mediante test t de Student entre los dos grupos. El análisis de correlación entre la expresión de RhoE y CXCR4 se estimó por el método de correlación de Spearman. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando P & lt; 0,05.
Resultados
La sobreexpresión de la RhoE se correlaciona con el grado de diferenciación y la estadificación del tumor en los tejidos de cáncer gástrico e indica un mal pronóstico para los pacientes
La expresión de RhoE en gástrica cáncer de los tejidos, los tejidos no tumorales adyacentes y tejidos relacionados de ganglios linfáticos metastásicos se examinó mediante técnicas de inmunohistoquímica (Figura 1A). Se encontró expresión RhoE expresó débilmente o incluso ausente en los tejidos no tumorales adyacentes (a), mientras que su expresión fue significativamente mayor en los tejidos de cáncer gástrico y metástasis de ganglios linfáticos (b-e). A continuación, analizamos la relación entre la tinción RhoE y los parámetros clínico de los pacientes con cáncer gástrico (Tabla 1). Los resultados mostraron que ni el género ni la edad se correlacionó con la expresión de RhoE. Sin embargo, el aumento de expresión RhoE se correlacionó estadísticamente con el grado de diferenciación (p = 0,005) y la estadificación del tumor, que consistía en el tamaño del tumor (T, P & lt; 0,001), la invasión de los ganglios linfáticos (N, P = 0,001), y la metástasis distante (M, P = 0,003). Por otra parte, el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró que los pacientes con altos niveles de expresión de RhoE, que se presentan con una menor supervivencia global en comparación con aquellos pacientes expresión negativa de RhoE (Figura 1B). Multivariante de Cox de riesgos proporcionales modelo evaluaciones indicaron que los niveles de expresión RhoE eran un factor independiente y significativo para la supervivencia en pacientes con cáncer gástrico (Tabla S1).
(A), el análisis inmunohistoquímico de RhoE en los tejidos; (A), el epitelio gástrica normal; y (b) bien diferenciado, (c) moderadamente diferenciado o (d) pobremente diferenciados tejido cáncer gástrico; (E) lugar de la metástasis en el ganglio linfático. coloración marrón representa tinción positiva RhoE. (B), de Kaplan-Meier curva de supervivencia postoperatoria en función de la expresión RhoE. (C), análisis de transferencia de Western de la expresión RhoE en diferentes líneas de células gástricas. β-actina se utilizó como control interno. Los niveles relativos de expresión de RhoE en el cáncer de líneas celulares gástrico se presentan como gráficos de barras. * P & lt;. 0,05
nivel de expresión de RhoE
Categoría
n -
+
++ +
++ P
value
Total9014283216Age0.421≤6041610187>6049818149Gender0.742Male679232213Female2355103Differentiation0.005
aWell52120Moderately471215146Poorly380121610TNM stageT <0.001
aT194320T2175840T347414209T4171367N0.001
bN031111073N1-N3593182513M0.003
bM08014272811M1100145Table 1. Análisis estadístico de inmunohistoquímica Ensayo
a, Kruskal-Wallis H prueba.;
b, Mann-Whitney Prueba CSV Descargar CSV
A continuación, se estudiaron los niveles de expresión de RhoE en tejidos de cáncer gástrico primarios y sus tejidos de ganglios linfáticos metastásicos emparejados. Los niveles de expresión de RhoE estaban ausentes en 7 tejidos de cáncer gástrico, débilmente expresado en 16 pacientes con cáncer gástrico, moderadamente expresado en 11, y altamente expresado en tejidos de cáncer de 6, respectivamente. Por el contrario, en los ganglios linfáticos de metástasis el número correspondiente fue de 3, 12, 14 y 11. Además, la expresión de RhoE fue significativamente mayor en los tejidos de ganglios linfáticos metastásicos que la encontrada en tejidos de cáncer primarios. Estas observaciones indican que la expresión RhoE se correlacionó con la metástasis en el cáncer gástrico (Tabla 2, P & lt; 0,05).
Nivel de expresión de RhoE
tipo histológico
n
-
+
++ +++
Valor P
cáncer primario tissues407161160.048
* ganglios linfáticos metastases403121411Table 2. expresión de RhoE en el cáncer de tejidos primarios y metástasis de ganglios linfáticos coincidentes .
* U de Mann-Whitney U. CSV Descargar CSV
La expresión de RhoE en líneas celulares se analizó por Western blot (Figura 1C). Hemos encontrado que, en comparación a la de la línea celular de GES, la expresión de RhoE fue significativamente mayor en diversas líneas celulares de cáncer gástrico. Por otra parte, el nivel de expresión de la proteína RhoE fue significativamente mayor en la célula SGC7901-M sub-línea altamente invasiva que en la célula sub-línea SGC7901-NM menos invasiva. Por lo tanto, más estudios sobre la metástasis del tumor se realiza con base en el modelado celular con las líneas celulares SGC7901-M y SGC7901-NM.
RhoE promueve las capacidades migratorias e invasivas de células de cáncer gástrico in vitro e in vivo
Para explorar el papel de RhoE en la metástasis del cáncer gástrico, que hasta reguladas su expresión de proteínas en células SGC7901-NM después de la transducción con el vector de lentivirus RhoE o vector de control (llamado SGC7901-NM-RhoE o-NM-control de SGC7901 ). Por el contrario, amortiguación de expresión en las células RhoE SGC7901-M se logró después de la transfección con siRNA dirigidos contra RhoE ARNm o con el control de siRNA (llamado SGC7901-M-siRhoE o SGC7901-M-Control, respectivamente). los niveles de expresión de proteínas fueron confirmados por análisis de transferencia Western después de la transfección (Figura 2A).
(A), RhoE se había reducido regulado en las células SGC7901-M después del tratamiento con siRNA mientras que la expresión RhoE fue hasta reguladas en SGC7901- células nm después de tratamiento con lentivirus. los niveles de proteína Rhoe se confirmaron por análisis de transferencia Western. (B), la capacidad migratoria de las células se evaluó mediante un ensayo de cicatrización de heridas. Las anchuras de la herida de cada muestra se midieron en diferentes puntos de tiempo por contraste de fase microscopía (Olympus, Tokio, Japón), y la relación de cierre se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: cierre de la herida (%) = (anchura 0 h) - anchura de 24 h) /anchura 0 h. * P & lt; 0,05. Estos resultados se compararon con los de las células de control. (C), las actividades de invasión de células tumorales se midieron por transwell ensayo. se muestran campos de imágenes representativas de las células invasoras en la membrana. Los datos se representan como la invasión celular normalizada (índice de invasión) en relación con las células control. * P & lt; 0,05. Las imágenes que se muestran son representativos de tres experimentos.
A continuación,
in vitro
la migración y la invasión de ensayo se llevaron a cabo (Figura 2B y 2C). Encontramos una mayor expresión de RhoE podría regular hasta-significativamente las capacidades migratorias e invasivas del cáncer de células de línea gástrica SGC7901-NM, en la cicatrización de heridas y transwell ensayos de invasión. Por el contrario, las células SGC7901-M, que exhiben expresión humedecido de RhoE mostraron una notable inhibición de capacidades migratorias e invasivas en comparación con las células de control. Para entender si las funciones de RhoE eran acontecimientos comunes en diversas células cancerosas o eventos específicos SGC7091-gástrico, el cáncer gástrico líneas celulares MKN45 y MKN28 se utilizaron para completar los mismos experimentos. Los resultados tanto de la cicatrización de heridas y transwell ensayos de invasión revelaron que RhoE promovió las capacidades migratorias e invasivas de ambas células MKN45 y MKN28 (Figura S1), lo que sugiere que las funciones de RhoE que fueron detectados
in vitro
fueron integral para todo el cáncer de líneas de células gástricas. Mientras tanto, también se realizó el ensayo de MTT para probar la alteración de la expresión wether RhoE podría afectar el crecimiento de células de cáncer gástrico en nuestro estudio. Como muestra la Figura S3 A, ni la regulación ascendente de RhoE en las células SGC7901-NM ni la baja regulación de RhoE en las células SGC7901-M podrían causar un marcado cambio de la proliferación celular (p & gt; 0,05), por lo tanto excluido el efecto de RhoE sobre la proliferación celular que traería confusión a nuestros resultados y, además confirmado que RhoE puede promover la motilidad celular de células de cáncer gástrico.
a fin de investigar si el aumento de RhoE podría alterar el
in vivo
capacidad metastásica de las células de cáncer gástrico , se realizó un
in vivo
vena de la cola ensayos de metástasis en ratones desnudos usando SGC7901-NM-Rhoe y NM-SGC7901 de control de líneas celulares. En los ratones sacrificados, se encontró que las células que muestran mayores niveles de expresión RhoE llevaron a significativamente Livermore y pulmón de superficie tumores más visibles en comparación con células de control (P & lt; 0,05, Figura 3). H y E tinción mostraron que las células SGC7901-NM-Rhoe metástasis en ambos pulmones y el hígado, aparentemente producidas, mientras que las células de control sólo aparecen metástasis parciales. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que RhoE jugó un papel importante en la promoción de la metástasis de las células de cáncer gástrico tanto
in vitro en
y
in vivo
.
Tinción
H y E de ambos los pulmones y los hígados se evaluaron a partir de ratones que habían recibido inyecciones intravenosas de cola SGC7901-NM-RhoE y células de control, respectivamente. Se identificaron loci metastásicos y marcados por flechas. El número de loci metastásico en el hígado y pulmón también se contaron (medio). * P & lt;. 0,05
CXCR4 podría ser un gen aguas abajo de RhoE en el cáncer gástrico
Para determinar las posibles genes aguas abajo a través del cual RhoE puede mediar su función en la metástasis de células de cáncer gástrico, se realizó matriz de PCR para explorar la expresión diferencial de genes relacionados con metástasis compartidos entre SGC7901-NM-RhoE y de control de NM SGC7901 líneas celulares. Genes que aumento o disminución de ≥ 2 veces fueron considerados como genes abajo RhoE-dependientes posibles. En resumen, hemos detectado 84 genes y, finalmente, encontramos 6, que se han cambiado notablemente después de la expresión de RhoE se mejoró (Tabla 3). Entre los 6 genes, 3 (CXCR4, VEGFA, CTSK) fueron reguladas, y otros tres (MMP7, CD82, CTSL1) se redujeron regulado en las células SGC7901-NM-Rhoe.
nivel de expresión de ARNm nombre
génica
Descripción
SGC7901-NM-control de
SGC7901-NM-RhoE
CXCR4Chemokine (CXC motivo) del receptor 41.003.30VEGFAVascular el factor de crecimiento endotelial A1.002.78CTSKCathepsin K1.002.68CTSL1Cathepsin L11.00-2.12CD82CD82 molecule1.00-2.29MMP7Matrix metalopeptidasa 71.00-2.47Table 3. genes expresados diferencialmente relacionados con metástasis después Aumentada RhoE Expresión.
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en este estudio, la expresión de CXCR4, VEGFA, CTSK y CD82 fueron verificados mediante análisis de transferencia Western y de manera interesante, se observa que sólo la expresión de CXCR4 fue consistente con los resultados obtenidos por el análisis conjunto de PCR. El nivel de proteína de CXCR4 fue suprimida por la interferencia de RhoE y por el contrario, se incrementó cuando RhoE se expresó ectópica (Figura 4A). Por lo tanto, la correlación entre RhoE y expresión CXCR4 se analizó mediante inmunohistoquímica en 60 cáncer gástrico tejidos Los resultados mostraron que CXCR4 fue altamente expresado en los tejidos donde RhoE fue positivamente manchado, mientras que se expresó mal en aquellos tejidos donde RhoE se expresa a un nivel bajo (Figura 4B). Además, tanto RhoE y expresión CXCR4 fueron concordantes en el 83,3% (50/60) de las muestras carcinomas gástricos, el coeficiente de correlación de Spearman R era 0,80 (P & lt; 0,001) e indicó una estrecha correlación entre la expresión tanto RhoE y CXCR4 en los cánceres gástricos (Tabla 4). Como se informó, sobre-expresado CXCR4 también juega un papel importante en la metástasis del cáncer y está implicado en el proceso de EMT, que sugirió que CXCR4 podría ser un gen aguas abajo de RhoE con importancia en la metástasis de células de cáncer gástrico [23].
(A) RhoE, CXCR4, VEGFa, CD82 y expresión de CTSK-M-SGC7901 de control, SGC7901-M- siRhoE, NM-SGC7901 de control, y SGC7901-NM-Rhoe líneas celulares. La expresión de la β-actina se utilizó como control interno. Los niveles relativos de expresión de CXCR4 se muestran como gráficos de barras. * P & lt; 0,05. Los valores representan la media aritmética y el error estándar de la media (SEM) tal como se determina a partir de al menos tres experimentos. (B) tinción inmunohistoquímica de RhoE y CXCR4 en 60 pares de tejidos de cáncer gástrico. Tres casos representativos mostraron que la expresión de CXCR4 fue bien correlacionada con la de RhoE.
CXCR4
de Spearman correlation
RhoE
+
++
+++
Negative
n
p
p
R
+1820060<0.001<0.0010.80++11730+++0270Negative2008Table 4. correlación entre la expresión de RhoE y CXCR4 en 60 pares de cáncer gástrico tejidos.
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CXCR4 es esencial en la inducción de la invasión de RhoE en células de cáncer gástrico
Para investigar el efecto de CXCR4 en la capacidad de RhoE para funcionar en la metástasis de cáncer gástrico, hemos mejorado la expresión de CRCR4 en las células SGC7901-M-siRhoE mediante transducción lentiviral y abajo reguladas su expresión en células SGC7901-NM-Rhoe por la interferencia de siRNA. El nivel de proteína se determinó por análisis de transferencia Western (Figura S2). En el siguiente ensayo transwell, se encontró que una mayor expresión de CXCR4 podría restaurar la capacidad invasiva de las células SGC7901-M-siRhoE, mientras que por el contrario silenciar endógena CXCR4 reprimida la invasión de células SGC7901-NM-Rhoe (Figura 5). Estas observaciones indicaron que RhoE induce la invasión de células de cáncer gástrico, el cual fue parcialmente mediada por CXCR4. Estas observaciones también demostraron además que CXCR4 era un objetivo corriente abajo de RhoE.
La influencia de CXCR4 en la metástasis RhoE inducida se midió por un ensayo transwell. En las células SGC7901-M-siRhoE, CXCR4 se mejoró después de la infección por lentivirus. En las células SGC7901-NM-Rhoe, CXCR4 fue eliminado por tratamiento con siRNA de interferencia. Se determinó el número de células invasoras y presentado como gráficos de barras. * P & lt; 0,05, en las comparaciones entre las líneas celulares que presentan diferentes niveles de expresión de RhoE. ** P & lt;. 0.05, en las comparaciones entre líneas celulares que exhiben niveles diferenciales de expresión de CXCR4
Discusión
expresado de forma aberrante-RhoE a menudo se asocia con la progresión tumoral. Sin embargo, el papel o RhoE puede cambiar entre supresor de tumores y oncogenes en función del origen del tumor [7-9]. Como se informó, el cáncer gástrico sigue siendo uno de los cánceres más comunes en todo el mundo, especialmente en Asia oriental. Anteriormente, se ha demostrado que la expresión anormal RhoE está bien correlacionada con la progresión del cáncer gástrico. Como describen Zhou y Li, la expresión de RhoE se incrementa en el cáncer gástrico por la inducción de HIF-1α, y cuya expresión podría ir aumentada aún más cuando las células cancerosas generan resistencia a los fármacos anti-tumorales. Además, una mayor expresión de RhoE promueve la resistencia a los medicamentos mediante la supresión de la expresión de Bax [13,24].
En el presente estudio, se encontró que la expresión RhoE fue elevado en los tejidos de cáncer gástrico mientras que era ausente o débilmente expresado en tejidos no tumorales adyacentes. Además, la evidencia clínica demostró que RhoE sobre-expresión se correlacionó significativamente con el grado de diferenciación de las células del cáncer y de estadificación TNM, que consiste en el tamaño del tumor (T), la invasión de los ganglios linfáticos (N) y metástasis (M). Más importante aún, Rhoe niveles de expresión eran un factor de riesgo independiente y significativo para la supervivencia en el cáncer gástrico. Además, la expresión regulada hasta de RhoE podía predecir un mal pronóstico en pacientes con cáncer gástrico. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren fuertemente que RhoE podría haber servido como un oncogén en el cáncer gástrico y jugaron un papel positivo en la progresión del cáncer gástrico, especialmente en la metástasis del cáncer. Es posible que formalmente RhoE podría ser un factor pronóstico novela en pacientes con cáncer gástrico. Por lo tanto, teniendo en cuenta que la metástasis es una de las principales razones para la mortalidad por cáncer gástrico, nuestros hallazgos podrían proporcionar una nueva pista o nuevo objetivo para inhibir la metástasis tumoral en el cáncer gástrico y, finalmente, pueden ayudar en el desarrollo de estrategias terapéuticas para prolongar la supervivencia de los pacientes.
Sin embargo, el papel de RhoE en la metástasis del cáncer sigue siendo parcialmente indeterminado. En las células de carcinoma y tumorales mesenquimales hepatocelulares, el aumento de expresión RhoE correlaciona con la reducción de la capacidad metastásica, mientras que en células de melanoma, RhoE promueve la migración celular y la invasión [10,12,25]. Para explorar el papel de RhoE en la metástasis del cáncer gástrico, derribaron RhoE en la línea celular SGC7901-M, que tiene un alto potencial metastásico y se indujo su expresión en la línea celular SGC7901-NM, que es pobre en la metástasis . Posteriormente,
in vitro
ensayos demostraron que el aumento de la motilidad celular RhoE promovido y la invasividad, mientras que disminuyó RhoE condujo a un carácter no invasivo de células de cáncer gástrico. Estos resultados fueron confirmados por el
in vivo
ensayo. Es bien sabido que la migración celular y la invasión del cáncer mejorada son pasos necesarios para la formación final de las metástasis. Por lo tanto, en células de cáncer gástrico, RhoE podría ser un gen funcional metástasis de promoción. Sin embargo, también nos dimos cuenta de que la morfología de las células cambió mucho después de la alteración de la expresión RhoE. Otras investigaciones han encontrado que este cambio morfológico puede ser causado por la desaparición de fibras de estrés (Figura S3B), en lugar de cambio de la proliferación celular.
Como se informó, RhoE regula la metástasis del cáncer, y lo hace sobre todo mediante la inhibición de la vía ROCK /MYPT [26]. Esta sección se ha investigado en otro estudio de investigación por nuestro grupo (datos no mostrados).