Extracto
MKT-077, un tinte rhodacyanine, fue demostrado que producen la muerte celular específica del cáncer. Sin embargo, las complicaciones impedían el uso de este compuesto más allá de ensayos clínicos. Aquí describimos YM-1, un derivado de MKT-077. Se encontró que el YM-1 fue más citotóxico y localizado de manera diferente que MKT-077. YM-1 demostró citotoxicidad a través de múltiples líneas celulares de cáncer. Esta toxicidad se limitó a líneas celulares de cáncer; modelos celulares inmortalizadas no se vieron afectados. Se encontraron Breves aplicaciones de YM-1 para ser no tóxico. Breve tratamiento con YM-1 restablece la sensibilidad tamoxifeno a un modelo de células MCF7 tamoxifeno resistentes refractario. Este efecto es posiblemente debido a la fosforilación de receptores de estrógenos alfa alterada, un resultado precipitada por reducciones selectivas en los niveles de Akt (Akt /PKB). Por lo tanto, potencialmente se podrían hacer modificaciones en el andamio rhodocyanine para mejorar las propiedades de eficacia y farmacocinética. Por otra parte, el impacto sobre la sensibilidad a tamoxifeno podría ser una nueva utilidad para esta familia de compuestos
Visto:. Koren J III, Miyata Y, Kiray J, O'Leary JC III, Nguyen L, Guo J, et al. (2012) Rhodacyanine Derivado dirige selectivamente a las células cancerosas y supera la resistencia tamoxifeno. PLoS ONE 7 (4): e35566. doi: 10.1371 /journal.pone.0035566
Editor: Leonard Petrucelli, Clínica Mayo, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Febrero 2012; Aceptado: March 17, 2012; Publicado: 26 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Koren et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Dra. Dickey fue apoyada por la Asociación de Alzheimer, CurePSP (parálisis supranuclear progresiva), Institutos nacionales de Salud /Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIH /NIA) R00AG031291 y NINDS (Instituto Nacional de Trastornos neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares) R01NS073899. El Dr. Gestwicki fue apoyado por el NIH R01NS059690. El Dr. Cheng fue apoyada por James & amp; Esther Rey de Grant 1KG02-33967. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
inhibición de la toxicidad y de crecimiento específico del cáncer de MKT-077, un rhodacyanine catiónico, ha demostrado
in vitro
y
in vivo
a través de múltiples variedades de cáncer [1]. Se determinó que MKT-077 localizado en la mitocondria [1]. MKT-077 entró en ensayos clínicos para el tratamiento de tumores sólidos avanzados y refractarios de diverso origen celular, incluyendo: riñón, pulmón, próstata, colon, adenocarcinomas, y melanomas [2], [3]. El efecto secundario negativo primario observado en ambos estudios fue la toxicidad renal [2], [3]. La toxicidad observada detuvo el reclutamiento para un ensayo como los estudios en animales mostraron similares toxicidad renal irreversible tras la administración de MKT-077 [2], [3]. Más tarde se descubrió que MKT-077 interactuó con mortalin (MOT-2), miembro de la familia una proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsp70), y que la interacción de MKT-077 con mot-2 induce la liberación del gen supresor tumoral p53 de un complejo con mot-2 [4]. Este complejo mot-2 /p53 inactivada las capacidades de supresión tumoral p53 de secuestrando en el citosol
in vivo
[5].
Los cánceres de mama se encuentran entre los tipos de cáncer más común diagnosticado en las mujeres [ ,,,0],6]. Los datos publicados indica que el tratamiento de las células MCF7, un modelo de células de cáncer de mama, con MKT-077 produce citotoxicidad y altera el crecimiento [1], [2]. Sin embargo, en los resultados de dos ensayos de fase I de ensayos clínicos publicados, ningún paciente con un tumor de mama sólido o tumor de mama refractario se incluyeron en el estudio [2], [3]. Aunque hay numerosos quimioterapias de cáncer de mama, la resistencia a terapias contra el cáncer de mama pueden surgir en aproximadamente el 30% de las mujeres tratadas por cáncer de mama [7]. resistencias conocidas en los cánceres de mama se han observado para las estrategias contra el cáncer no sólo estándar, tales como doxorrubicina, sino también trastuzumab y tamoxifeno (4-OHT) [8], [9], [10].
mama cánceres también tienen una alta prevalencia de mutaciones; mutaciones que pueden promover la tumorigénesis y la supervivencia [11]. Mientras que estas mutaciones producen dianas para tratamientos, otras mutaciones pueden superar señalización de circuitos red cascada para eliminar los blancos aguas arriba [12], [13]. Esto reduce el número de posibles objetivos, reduciendo el grupo de opciones de tratamiento, y aumenta el potencial de resistencia a la génesis. Además, la resistencia puede surgir cuando las proteínas reguladoras se alteran para permitir que las proteínas pro-supervivencia para actuar sin disminuir. Varias quinasas relacionadas con la supervivencia celular se han implicado en la facilitación de resistencia a la quimioterapia [14], [15], [16], [17], [18]. Por ejemplo, la fosforilación de la alfa del receptor de estrógeno (ER) hace que ER se active independientemente de estrógeno de unión, lo que resulta en la resistencia a 4-OHT. Por lo tanto, las estrategias para volver a sensibilizar a las células cancerosas refractarios a las terapias existentes son muy necesarios.
En estos datos, se identifica un derivado funcional de MKT-077 que indicaron un aumento de citotoxicidad a través de múltiples variedades de cáncer al tiempo que conserva la especificidad del cáncer asociado con MKT-077. Esta actividad mejorada se debió a la localización intracelular del compuesto. Además, los tratamientos cortos con YM-1 fueron capaces de resensitize células cancerosas que se habían desarrollado resistencia a la antagonista de ER, el tamoxifeno. Una forma en la que estos compuestos están trabajando es mediante la reducción de los niveles totales de Akt, que pueden contribuir a ER falta de sensibilidad al tamoxifeno. En conjunto, el andamio rhodacyanine tiene un gran potencial como terapéutico contra el cáncer tanto como una estrategia de tratamiento individual, sino también, potencialmente, como una combinatoria o la opción sinérgica para su uso con los regímenes existentes.
Métodos
Líneas Celulares
El tamoxifeno resistentes (TR-MCF7) y células MCF7 parentales fueron generosamente proporcionadas por el Dr. P. Jin Cheng, de Moffitt Cancer Center (Tampa, FL). La línea MCF7 fue generado originalmente por la Fundación de Cáncer de Michigan y se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA) y el TR-resistencia fue producido por tratamiento de dosis baja crónica con tamoxifeno. células HEK-293, M17, H4, MDA-MB-231, Hs578T y NIH-3T3 se adquirieron de ATCC (Manassas, VA). Las células HeLa fueron generosamente proporcionadas por el Dr. Kenneth E. Ugen en la Universidad del Sur de Florida. En un principio los obtuvo de la ATCC (Manassas, VA). Estas células se generan a partir de un tumor de cuello uterino de Henrietta Lacks.
Productos químicos y anticuerpos
El azul de metileno (MB) se adquirió de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). MKT-077 y YM-1 se sintetizaron como se describe [19]. Anti-Akt1, Akt2 y pAktS473 fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA). Anti-ER, y pERα S167 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-actina se adquirió de Sigma Aldrich. Anti-GAPDH fue adquirido de Meridian Life Science (Memphis, TN).
Cultivo celular y tratamientos de la droga
MCF7, MDA-MB-231, se cultivaron células HeLa Hs578T y como se describe anteriormente [ ,,,0],20]. células H4 y HEK-293 se cultivaron en OPTI - medio de Eagle modificado (OPTI-MEM) de Invitrogen suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% PenStrep (Invitrogen). células M17 se cultivaron en OPTI-MEM suplementado con 10% FBS, 1% PenStrep y 100 mg /L piruvato de sodio. células NIH-3T3 se cultivaron en DMEM con bicarbonato de bajo contenido de sodio (1,5 g /L) a partir de ATCC suplementado con FBS 10% y 1% PenStrep. células TR-MCF7 fueron cultivadas en DMEM (que se describe con células MCF7) suplementado con 10 mM 4-OHT. MKT-077 y YM-1 se disolvieron en DMSO. DMSO se usó como vehículo para MKT-077 y YM-1 donde se indica. estrategias de tratamiento exactos acompañan de datos en la sección de resultados. Collection
Protein, la cuantificación, y Western Blotting
Las células se recogieron mediante la aplicación de reactivo de extracción de proteínas de mamíferos (Thermo) como se describe anteriormente [20]. medición de la proteína nivel, el equilibrio, el Western Blot, y la detección se realizaron como se describe anteriormente [20].
lactato deshidrogenasa (LDH) Ensayo
líneas celulares indicadas se sembraron en medio designado. Una vez que las células alcanzaron ~ 95% de confluencia, se aplicó MKT-077 o YM-1 en DMEM sin rojo de fenol. Después de los tiempos indicados por experimento, el medio se recoge de cada tratamiento y se centrifuga para sedimentar las células muertas y los desechos. Protocolo se siguió tal como se suministra desde Cytotox-96 kit (Promega).
Aislamiento mitocondrial y Espectroscopía
MCF7 células fueron tratadas durante 6 horas con vehículo (DMSO), MB, YM-1, o MKT-077. Se recogieron las siguientes celdas de tratamiento y fracciones subcelulares recolectados a través de Pierce mitocondrial kit de aislamiento de Thermo Scientific (Rockford, IL). Análisis de la localización de la droga se realizó mediante espectroscopía de Thermo Scientific Nanodrop espectrofotómetro. Las concentraciones y porcentajes posteriores se aproximan mediante concentración generada:. Curva de absorbancia (no se muestra)
MTT viabilidad celular Ensayo
células TR-MCF7 se sembraron en una placa de 96 pocillos en medio que contiene 10 mM 4- OHT. Cuando las células alcanzaron la confluencia células ~ 90% fueron tratados en OPTI-MEM en una de cuatro condiciones 1: 10 M 4-OHT en OPTI-MEM para el pleno 48 h del experimento. 2: YM-1 (o vehículo) a las concentraciones indicadas para 4 horas, seguido de intercambio de YM-1 medio con medio que contenía 10 mM 4-OHT. 3: YM-1 (o vehículo) a las concentraciones indicadas para 4 horas, seguido de intercambio de YM-1 medio con medio que contiene 95% de EtOH (vehículo para 4-OHT). O, 4: YM-1 (o vehículo) a las concentraciones indicadas para las 48 horas completas de experimento. kit de ensayo de MTT se adquirió de ATCC y ensayo se realizó según el protocolo suministrado.
Aislamiento de proteínas nucleares
células TR-MCF7 fueron cultivadas en medio designado en platos de 10 cm. Las células se trataron durante 4 h con 10 M 4-OHT, 10 M YM-1, tanto o vehículo (s) para ambos compuestos. Después de la incubación, se recogieron las células y las proteínas nucleares aisladas utilizando reactivos suministrados y protocolo del Kit de proteína Qproteome Nuclear (Qiagen).
Resultados
Los perfiles de citotoxicidad de una serie de derivados a MKT-077 en MCF7 se compararon las células en una pantalla pequeña escala. El derivado YM-1 era el único compuesto que se encuentra a tener dosis toxicidad dependiente mayor que MKT-077 después de 24 horas (valores de LDH normalizados para el número de células) (Figura 1A). Una posible razón de esta potencia mejorada era la localización celular. Aprovechando las propiedades espectrales únicas de estos compuestos, las células MCF7 se trataron con MKT-077 o YM-1 y la separación celular de la mitocondria y citosol se realizaron. El azul de metileno, un compuesto conocido para localizar a las mitocondrias, se utilizó como un control [21]. Las fracciones subcelulares fueron analizadas espectrofotométricamente. Estos valores se compararon con una curva estándar generada de Abs: concentración (datos no mostrados) para dar una concentración aproximada de compuesto en cada fracción y por lo tanto un porcentaje de fármaco por ubicación. Curiosamente, YM-1, a diferencia de MKT-077 fue más prevalente en las fracciones citosólicas (Figura 1B).
MCF7 células fueron tratadas durante 24 horas con tres concentraciones de MKT-077 o YM-1. Después de 24 horas, se recogió el medio y se analizó por el ensayo de LDH. Los valores mostrados son un% de tratamiento con vehículo ± SD (A). MCF7 células fueron tratadas con MKT-077, YM-1 o azul de metileno (MB). fracciones mitocondriales se recogieron y la ubicación compuesto se midió mediante un espectrofotómetro (B).
Preocupada porque la falta de interacción mitocondrial reduciría la especificidad citotóxica visto con rhodacyanine de células cancerosas, la selectividad de YM-1 en se probaron varias líneas de cáncer y células inmortalizadas. Estos incluyen: MCF7, Hs578T y MDA-MB-231 (cáncer de mama), M17 (neuroblastoma), H4 (neuroglioma), HeLa (cáncer cervical), y dos líneas celulares inmortalizadas: HEK 293 (riñón embrionario humano) y NIH 3T3 ( fibroblastos murinos). citotoxicidad robusta (1,323% de vehículo), tal como se mide por ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH), no se observó en las células MCF7 tras 24 horas YM-1 tratamiento (Figura 2A). Como era de esperar, estos valores de toxicidad fueron más altos que los observados en la Figura 1A ya que utilizamos una población de células de mayor tamaño (1A≈0.2 × 10
6 células; 2A≈1.2 × 10
6 células) y por lo tanto más LDH fue lanzado por la toxicidad asociada. Las otras líneas celulares de cáncer probadas todas toxicidad mostrada siguiente YM-1 administración; mientras que, las dos líneas celulares inmortalizadas muestran un mínimo o ningún toxicidad mediante un ensayo de LDH (Figura 2B). Esto demostró que la localización citosólica de YM-1 no afectó a su especificidad para las células cancerosas.
MCF7 células (cáncer de mama) fueron tratados durante 24 horas con concentraciones crecientes de YM-1. Después de 24 horas, se recogió el medio y se analizó por el ensayo de LDH citotoxicidad. Los valores mostrados son un% de tratamiento con vehículo ± SD (A). Hs578T y MDA-MB-231 (cáncer de mama), M17 (neuroblastoma), H4 (neuroglioma), y HeLa (cáncer cervical) de células tratadas con concentraciones crecientes de YM-1 y la toxicidad se comparó con NIH-3T3 (ratón fibroblastos de embriones HEK 293) y () células de riñón de embriones humanos para la toxicidad específica del cáncer. Todas las líneas celulares fueron tratadas durante 24 horas. Después de 24 horas, se recogieron los medios y se analizaron por el ensayo de LDH. Los valores mostrados son un% de tratamiento con vehículo ± SD (B).
Entonces
YM-1 eficacia fue probada en un modelo celular de la resistencia a tamoxifeno. La toxicidad de YM-1 en una tamoxifeno refractario (4-OHT) línea celular resistente MCF7 (TR-MCF7) se comparó con la de la línea celular MCF7 parental (no resistente). De hecho, YM-1 mataron de manera efectiva tanto en células estándar y resistentes (TR-MCF7) después de 48 horas de incubación (Figura 3A). Dadas las preocupaciones anteriores con tratamiento crónico MKT-077, especuló que un tratamiento corto con YM-1 podría ser igualmente tóxicos. Para probar esto, las células MCF7 y células TR-MCF7 se trataron con 10 mM YM-1 durante 4 horas. Este fue removido y reemplazado con vehículo durante 44 horas. Además, las células TR-MCF7 se trataron con 4-OHT o el vehículo de 4-OHT (95% EtOH) (Figura 3B). En cada caso, se observó una toxicidad mínima.
TR-MCF7 y células MCF7 parentales fueron tratadas durante 48 horas con 10 M YM-1. Después de 48 horas, se recogieron los medios y se analizaron por el ensayo de LDH. Los valores mostrados son un% de tratamiento con vehículo ± SD (A). células MCF7 se trataron durante 4 horas con 10 M YM-1. A las 4 horas, el medio se reemplazó con medio de crecimiento estándar durante 44 horas. células TR-MCF7 se trataron con 10 mM YM-1 durante 4 horas. A las 4 horas, el medio se retiró y se reemplazó con medio estándar TR-MCF7 que contienen 10 mM 4-OHT o 95% de EtOH, el vehículo de 4-OHT, durante 44 horas. Después de 48 horas de tratamiento inicial, se recogieron los medios y se analizaron por el ensayo de LDH. Los valores mostrados son un% de tratamiento con vehículo ± SD (B).
La viabilidad celular (MTT) ensayos se utilizaron para probar si esta estrategia de tratamiento más corto estaba afectando a la proliferación celular. Las células TR-MCF7 fueron cultivadas en medios que contienen 10 mM 4-OHT. Nuestra estrategia de tratamiento diseñado contenía cuatro condiciones todo termina en 48 horas: 1. 10 M 4-OHT solo durante 48 horas, 2. YM-1 (o vehículo) de tratamiento durante 4 horas, seguido de re-adición de 10 mM 4-OHT para 44 horas, 3. YM-1 (o vehículos) de tratamiento durante 4 horas, seguido de EtOH al 95% (vehículo de 4-OHT), y 4. tratamiento YM-1 (o vehículo) para las 48 horas completas. ensayos de MTT revelaron que el 4-hora 10 M YM-1 seguido por 10 tratamiento mu M 4-OHT reducción de la viabilidad de 60% en relación con el tratamiento 4-OHT solo. El 10 M YM-1 seguido por tratamiento EtOH 95% no alteró la viabilidad (Figura 4A). El 48 horas 10 M YM-1 tratamiento de reducción de la viabilidad en un 40% en comparación con las 48 horas de tratamiento de 4-OHT, similar a la figura 3A.
células TR-MCF7 fueron tratados con 4-OHT durante 48 horas, YM-1 (o vehículo) durante 4 horas seguido de 44 horas de cualquiera de 4-OHT o 95% de EtOH, o YM-1 (o vehículo) durante 48 horas. A las 48 horas de tratamiento inicial, se realizaron ensayos de viabilidad MTT. valores de viabilidad de cada tratamiento como% de las 48 horas de tratamiento 4-OHT ± SD (A). 2-Way ANOVA comparando todos los grupos de tratamiento YM-1 (Gray Cuadraditos 4 horas YM-1Y 4-OHT, abierta 48 horas diamantes- triangles- YM-1, negro de 4 horas YM-1 entonces EtOH al 95%), importancia puesto de manifiesto a través de concentraciones (F (2,30) = 54.22, p & lt; 0,0001), y la estrategia de tratamiento (F (4, 30) = 41.04, p & lt; 0,0001), pero ninguna interacción significativa (F (8,30) = 1,83 , p = 0,1107). * - Indica diferencia significativa (p & lt; 0,05) de 4-horas YM-1 luego 4-OHT de otros dos grupos con excepción de 10 micras tratamientos, significado como se indica (ns = p & gt; 0,05) (B). 1 ANOVA de una vía de la estrategia de YM-1 + 4-OHT revelando significado de 10 concentración mu M (F (4,10) = 16,49, p = 0,0002) (C). Análisis de YM-1 + 95% de EtOH, por 1 ANOVA de una vía, no reveló ninguna importancia a través de las concentraciones ensayadas (F (4,10) = 3,435, p = 0,0516) (D). 48 horas de tratamiento YM-1 mostró diferencias significativas entre todas las concentraciones y la concentración de 10 mM, por 1-way ANOVA (F (4,10) = 12,32, p = 0,0007) (E). 1 sentido el análisis ANOVA (F, (5,12) = 24,33, p & lt; 0,0001) la comparación de todos los YM-1 tratamientos 10 m, 48-horas 4-OHT, y los tratamientos de vehículos no revelaron diferencias significativas entre 48 horas 4-OHT y ambos de 4 horas 10 M YM-1 + 95% de EtOH y 48 horas 10 micras YM-1 tratamientos; mientras que el 48-horas 4-OHT y la 4-hora 10 M YM-1 + 95% de EtOH fueron significativamente diferentes de la YM-1 de tratamiento de 4 horas + 4-OHT (p & lt; 0,05). (F)
Todas las estrategias de tratamiento que contienen YM-1 se analizaron por ANOVA de dos vías (Figura 4B). Este análisis reveló un efecto significativo de la estrategia de tratamiento y la concentración de YM1 (F (4, 30) = 41,04, p & lt; 0,0001), (F (2,30) = 54,22, p & lt; 0,0001). La interacción entre la estrategia de tratamiento y la concentración no fue significativa (F (8,30) = 1,83, p = 0,1107). análisis de Bonferroni post-hoc de este 2-way ANOVA no mostró diferencias significativas entre cualquiera de las concentraciones utilizadas para el tratamiento de 48 horas YM-1 y el 4-hora YM-1 seguido por 95% tratamiento EtOH (todos p & gt; 0,05) ; mientras que, todas las concentraciones utilizadas para el 4-hora YM-1 seguido de tratamiento 4-OHT fueron significativamente diferentes de la 4-hora YM-1 seguido por 95% EtOH tratamiento (todos p & lt; 0,05). Todas las concentraciones de la 4-hora YM-1 seguido de 4-OHT y la 48-horas YM-1 fueron significativamente diferentes (todos p & lt; 0,05) con la excepción de la 10 M YM-1 de concentración (p & gt; 0,05). Atribuimos la falta de significación a la toxicidad general causada por la concentración de M 48-horas 10 de YM-1 (véase la Figura 3A & amp; B). Un ANOVA de una vía de la curva de concentración YM-1 para el YM-1 tratamiento 4 horas seguido de 44 horas de tratamiento 4-OHT reveló que la concentración de 10 mM fue significativamente diferente de todas las demás concentraciones (F (4,10) = 16,49, p = 0,0002) (Figura 4C). La curva de concentración para el YM-1 tratamiento 4 horas seguido por tratamiento EtOH 95% muestra que no fue significativa concentración de cualquier otra concentración por ANOVA de una vía (F (4,10) = 3,435, p = 0,0516) (Figura 4D) . La comparación de todos los YM-1 concentraciones de 48 horas, por ANOVA de una vía, muestra que, de nuevo, la concentración de 10 mM fue significativamente diferente de todas las demás concentraciones en este tratamiento (F (4,10) = 12,32, p = 0,0007 ) (Figura 4E). Continuamos nuestro análisis comparando la concentración de 10 mM YM-1, de todos los grupos de tratamiento, con el tratamiento nulo. valores de viabilidad de todas las condiciones de tratamiento antes mencionados, con la inclusión del tratamiento 4-OHT horas y 48 tratamientos de vehículos como grupos separados, fueron analizados por ANOVA de una vía (F, (5,12) = 24.33, p & lt; 0,0001). prueba post-hoc de Tukey reveló que 4 horas YM-1 seguido de 4-OHT fue significativamente diferente del tratamiento de 4-OHT 48 horas (p & lt; 0,05), mientras que tanto las 48 horas 10 M YM-1 y la 4 hora y 10 mM YM-1 seguido por 95% EtOH tratamientos no fueron significativamente significativo del tratamiento horas 4-OHT 48 (Figura 4F). Este análisis también muestra que 10 M YM1 seguido de 4-OHT es significativamente diferente de 10 M YM1 seguido de 95% de EtOH (p & lt; 0,05).
Estos resultados sugirieron que sólo un tratamiento 4 horas de 10 M YM -1 podría volver a sensibilizar a las células TR-MCF7 al tamoxifeno /4-OHT, detención del crecimiento celular sin causar toxicidad evidente. a continuación, se exploraron los mecanismos posibles para este fenómeno. Un mecanismo plausible era la actividad quinasa aberrante, que es conocido por promover la resistencia a tamoxifeno mediante la fosforilación de ER en un sitio conocido por promover la actividad independiente de estrógenos [14], [15], [16], [17], [18]. Se han tratado las células TR-MCF7 como se describe para los experimentos de la Figura 4A & amp; proteínas B. nucleares se aislaron y probaron para niveles de ER pS167, un sitio que cuando transmite fosforilados tamoxifeno independencia. De hecho, la fosforilación de ER pS167 fue elevada en presencia de 4-OHT; sin embargo, la adición de 10 mM YM-1 abrogó este evento (Figura 5A & amp; B). YM-1 no alteró la localización nuclear de ER en el núcleo (Figura 5C & amp; D).
células TR-MCF7 se trataron con las condiciones indicadas para 4 horas. aislamientos nucleares y fracciones citosólicas se compararon mediante transferencia Western, transferencias representativas muestran (A & amp; C). Densitometría análisis de los niveles de ER y pERα muestra como% del tratamiento con vehículo ± SD (B & amp; D) guía empresas
S167 de ER caídas está contenido en un sitio consenso de Akt (Akt /PKB).. Akt es una quinasa pro-supervivencia con dos isoformas conocidas de interactuar con ER. Se han tratado las células MCF7 con 10 micras YM-1 durante 6 horas para evitar la toxicidad y buscamos los cambios en cualquiera de los niveles de Akt o activación. Los niveles de Akt1 y Akt2 fueron dosis dependiente reducido de YM-1 (Figura 6 A & amp; B). Esto sugiere que YM-1 puede causar toxicidad específica para las células cancerosas, de forma similar al compuesto padre MKT-077, pero que YM-1 lo hace mediante la reducción de quinasas pro-supervivencia como Akt, que puede conducir a alteraciones en los mecanismos de resistencia en tumores refractarios. Esto está de acuerdo con los datos de trabajo de trabajo anteriores que demuestran que los efectos de LY294002, un inhibidor de la vía PI3K /Akt inhibidor de la vía, sobre la apoptosis inducida por tamoxifeno eran específicos para inhibir la actividad de Akt [16].
Fueron tratados
células MCF7 con concentraciones notables de YM-1 durante 6 horas. Células lisados se analizaron mediante transferencia Western (A). Densitometría análisis de los niveles de Akt2 Akt-1 y se muestra como% del tratamiento con vehículo ± SD (B).
Discusión
A continuación se describe el potencial terapéutico de un derivado de MKT-077, YM-1. Este compuesto, similar a MKT-077, fue específicamente tóxico para las células cancerosas. YM-1 también tenía una mayor eficacia y localización citosólica de MKT-077. Breve exposición a YM-1 fue capaz de volver a sensibilizar a las células de cáncer de mama refractarias al tratamiento con tamoxifeno, una terapia común usada en la clínica. Este mecanismo ha demostrado ser dependiente de Akt como YM-1 fue capaz de reducir los niveles de Akt, así como la fosforilación de ER en un sitio de consenso Akt. Estos datos demuestran el potencial de los derivados rhodacyanine en el tratamiento de cánceres refractarios.
Es posible que la presencia citosólica de YM-1, en comparación mitocondrial de MKT-077, impulsa el aumento de la toxicidad y el aclaramiento de Akt observan con YM -1. Aunque los aspectos mitocondriales de MKT-077 están bien caracterizados [1], [2], [3], los datos recientes sugieren que MKT-077 también puede interactuar con miembros de la familia Hsp70 citosólico [22]. Si MKT-077 es capaz de inhibir la Hsp70 citosólico ya que mortalin [4], [5], YM-1 podría también inhiben citosólica Hsp70. inhibidores de Hsp70 han demostrado especificidad cáncer, así como la capacidad de reducir las proteínas cliente de Hsp70 [20], [23], [24], [25]. Tenemos la sospecha de que la inhibición de Hsp70 podría ser el mecanismo de YM-1; Sin embargo se requiere un examen más detenido.
terapias Tamoxifen normalmente fallan debido a la aparición de resistencia. resistencias adquiridas necesitan tiempo para desarrollarse. Nuestros estudios han demostrado que los tratamientos breves con YM-1 pueden volver a sensibilizar cánceres refractarios al tamoxifeno. El beneficio de un tratamiento tan poco tiempo es la falta de oportunidades para una resistencia a la YM-1 en sí, así como una menor probabilidad de efectos tóxicos fuera de objetivo. Por otra parte, la capacidad para negar las resistencias existentes permite la reintroducción de las quimioterapias putativo; la prevención de la necesidad de estrategias terapéuticas secundarias y terciarias más costosos y potencialmente peligrosos. Además, YM-1 tratamiento solo fue capaz de matar selectivamente solamente ciertas células cancerosas, lo que sugiere no sólo tolerabilidad para el enfoque, sino también una necesidad para una caracterización adicional acerca de los tipos de células específicas que podrían ser sensibles a estos compuestos y el agotamiento de Akt. Estos beneficios a los pacientes junto con el elevado número de variedades de cáncer vinculados a la disfunción Akt proporciona una plataforma para el estudio y desarrollo de nuevos compuestos continuación para agotar Akt través de la manipulación del andamio rhodocyanine
.
Mientras que otras quinasas se han identificado a ER fosforilada, Akt es un importante supervivencia quinasa, independientemente del fenotipo de resistencia, y su aclaramiento podría mejorar la eficacia de los agentes quimioterapéuticos. Si nuestra hipótesis de que YM-1 es un inhibidor de Hsp70 es exacta, esta holgura podría ser debido a una mayor ubiquitinación de Akt, como la ubiquitina ligasa para Akt, CHIP (extremo carboxi terminal de la proteína de interacción Hsc70) [26], se sabe que interactúan con Hsp70 [27].
Estos estudios demuestran la necesidad de una visión más mecanicista en el modo de acción de rhodacyanines. Los cambios menores entre MKT-077 y YM-1 conducen a un aumento de la presencia citosólica que fue capaz de mantener la especificidad similar. Esto sugiere que las modificaciones a este andamio podría producir toxicidad específica o reducir la toxicidad renal, como se observa en los ensayos clínicos y de laboratorio [1], [2], [3]. De hecho, nuestros datos que demuestran una muerte casi preferente de las células de cáncer de mama, en comparación con otros tipos de células de cáncer, sugiere que la especificidad para las variedades particulares de los tumores podría ser incorporado en el andamio rhodacyanine.