Extracto
Recientemente hemos informado de que Riccardin D (RD) fue capaz de inducir la apoptosis de la orientación Topo II. Aquí, se encontró que RD inducida por la detención del ciclo celular en fase G2 /M en células PC-3, y causó notable daño en el ADN como se evidencia por la inducción de γH2AX focos, micronúcleos, y la fragmentación del ADN en el ensayo de cometa. Los estudios de tiempos cinética y dosis-dependiente mostró que ATM /ATR Chk2 y /Chk1 vías de señalización activadas secuencialmente fueron en respuesta a la RD. El bloqueo de la señalización de ATM /ATR condujo a la atenuación de γH2AX inducida por RD, y para la recuperación parcial de la proliferación celular. Además, la exposición RD dio lugar a la inactivación de los genes BRCA1, la supresión de los recursos humanos y la actividad de reparación NHEJ, y la regulación a la baja de las expresiones y actividades de unión a ADN de fin de Ku70 /86. En consonancia con las observaciones, los datos de microarrays muestran que RD dispara los cambios en los genes responsables de la proliferación celular, el ciclo celular, daño y reparación del ADN, y la apoptosis. La administración de RD a xenoinjerto de ratones redujo el crecimiento del tumor, y las alteraciones causadas coordinadamente en la expresión de genes implicados en el daño y reparación del ADN, junto con la apoptosis celular. Por lo tanto, este hallazgo identificó un nuevo mecanismo por el que RD afecta la reparación del ADN y actúa como un agente de daño del ADN en el cáncer de próstata
Visto:. Hu Z, Kong F, Si M, Tian K, Yu LX, Young CYF , et al. (2013) Riccardin D ejerce su actividad antitumoral mediante la inducción de daño del ADN en células PC-3 del cáncer de próstata
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 8 (9): e74387. doi: 10.1371 /journal.pone.0074387
Editor: Stephanie Filleur, Universidad Tecnológica de Texas Health Sciences Center, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de mayo de 2013; Aceptado: 31 de julio de 2013; Publicado: 17 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Hu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30772594, 30973551, 30925038) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong (2009ZRB01346). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es uno de los tumores malignos más comunes en los hombres y la terapia hormonal sigue siendo retirada efectiva para el CaP avanzado. Sin embargo, el desarrollo de cáncer de próstata refractario a las hormonas (CPRH), inevitablemente se produce después de la terapia de deprivación hormonal [1,2]. Hay pocas opciones para el manejo exitoso de CPRH. Recientemente, el docetaxel, un derivado de alcaloide de la planta, ha ido surgiendo como un agente activo para mejorar la calidad de las condiciones de vida y la supervivencia en pacientes con CPRH metastásico [3,4]. El éxito de docetaxel ha llevado a muchos esfuerzos que se realizan para aislar diversos productos químicos que ocurren naturalmente y para investigar los mecanismos de acción de los compuestos bioactivos para el desarrollo de quimiopreventivo y /o agentes terapéuticos para el tratamiento de cánceres, incluyendo CaPHR [5].
Uno de los reactivos químicos más eficaces usados en la quimioterapia del cáncer son inductores de daño de ADN, que pueden causar una variedad de lesiones del ADN a través de múltiples mecanismos. Por ejemplo, camptotecina y etopósido pueden desencadenar un solo capítulo rompe (SSB) o roturas en el ADN de doble cadena (DSBs) atrapando complejos covalentes topoisomerasa de ADN, que posteriormente conducen a la muerte celular [6,7]. Por lo tanto, topo ADN I y II, especialmente Topo II, se cree que son objetivos bien establecidos en la terapia del cáncer.
En función del tipo de las lesiones del ADN, puestos de control específicos del ciclo celular y cascadas celulares se activan por ADN agentes dañinos. A medida ampliamente aceptada, la ataxia telangiectasia mutada (ATM) y ataxia telangiectasia y relacionado Rad3 (ATR) vías de señalización desempeñan un papel importante en la respuesta al daño del ADN. ATM responde principalmente a DSBs, e inicia la fosforilación de abajo objetivos tales como Chk2, BRCA1, y las proteínas NBS1 en el sitio de daño en el ADN [8]. Estos factores actúan en conjunto para inducir G1, S, y las detenciones G2 del ciclo celular, reparación del ADN, y /o la activación de las vías de muerte celular [9]. Mientras ATR se activa en respuesta a la replicación de estrés, se dispara la activación de Chk1, que a su vez conduce a la fosforilación de Cdc25 y previene la activación de CDK1 /ciclina B y la entrada mitótica [10]. Al DSBs, el proceso de DSBs final unirse implica numerosas proteínas y enzimas a través de recombinación no homóloga (NHEJ) y homólogos mecanismos de reparación de recombinación (HR) [11,12]. Por ejemplo, el heterodímero Ku70 /86 es crítica en NHEJ, ya que se une a los extremos de ADN rotas y recluta proteínas relacionadas de reparación-incluyendo la proteína quinasa dependiente de ADN, la XRCC4 y ligasa IV de ADN [13]. Se ha demostrado que el daño del ADN está implicado para provocar tanto ATM y ATR señalización [14]. La activación de estas dos vías con posibles defectos en los puntos de control del ciclo celular y la respuesta de reparación del ADN puede ser relevante en la determinación de la potencia y la eficacia de inductores de daño en el DNA.
Recientemente hemos informado de que Riccardin D (RD), un macrocíclico bisbibenzyl compuesto de la planta china hepática
Dumortiera hirsuta
[15], fue capaz de inducir la apoptosis de las células de leucemia humana por la orientación topoisomerasa II [16]. En este estudio, encontramos que el tratamiento RD dado lugar a la inducción de daño en el ADN y la inhibición de la respuesta de los productos involucrados en la reparación del ADN.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y tratamientos
LNCaP humanas, células DU145 PC-3 y (The American Type Culture Collection (ATCC)) se cultivaron en medio RPMI 1640 (Hyclone) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Hyclone). Las células fueron cultivadas en 5% de CO
2 a 37 ° C hasta alcanzar aproximadamente 50 a 70% de confluencia después se trata con productos químicos. DR fue aislado y purificado en nuestros laboratorios como se describe anteriormente [15]. RD y etopósido (VP-16) se prepararon en dimetilsulfóxido (DMSO) y se almacena como alícuotas pequeñas a -20 ° C.
Immunoblotting
Después del tratamiento como se ha indicado, los lisados celulares se prepararon utilizando tampón RIPA. Las proteínas (80 g) se separaron por SDS-PAGE y se transfirió electroforéticamente a membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore). Las membranas se sondaron durante la noche a 4 ° C con los anticuerpos primarios apropiados: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), ciclina E, poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), Bcl-2, Bax y nucleolina (Santa Cruz) , Ku70 y Ku86 (Active Modif), CDC25B (BD Biosciences), ciclina A (Abou Biotecnología), ciclina B1 (Novus Productos Biológicos), Cdc25C, Ser
1981-fosforilada-ATM, Tyr
15 fosforilada-Cdc2 , Ser
428 fosforilada-ATR, Ser
296 fosforilada-Chk1, Thr
68 fosforilada-Chk2, Ser
1524-fosforilada BRCA1, Ser
139-fosforilados histona H2AX (γH2AX), PP2AA, PP2AB, y PP2Ac (Señalización celular), PPP4C (Bethyl, Montgomery, TX, EE.UU.), IgG-TRITC (Abcam) seguido de bloqueo con 5% de leche en polvo sin grasa. Tras la eliminación de anticuerpos primarios, las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con peroxidasa IgG-rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios, entonces visualizados por un aumento de sistema de detección de quimioluminiscencia (Millipore).
El crecimiento celular y la viabilidad celular de ensayo
Las células se sembraron a 4000 células /pocillo en microplacas (Roche), y se expusieron a RD o vehículo. curvas de crecimiento de células se obtuvieron por el tiempo real de células SP Analizador del instrumento (Roche). valores de Índice de Células (CI) se normalizaron con respecto al valor de CI del punto de tiempo en el que añadió la sustancia química. Para el análisis de la viabilidad celular, células PC-3 fueron pretratados con 10 mmol /L cafeína durante 1 h, y se expusieron a RD o vehículo durante 24 h. La proliferación celular se examinó luego por 3- (4, 5 dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difenil-2H-tetrazolio (MTT, Sigma) ensayo colorimétrico.
ensayo
ciclo celular y la apoptosis
Después del tratamiento con el RD de 24 horas, las células se fija y se trata con yoduro de propidio (PI) (Sigma) durante 30 minutos en la oscuridad. del ciclo celular se analizó mediante un FACS (Becton Dickinson, EE.UU.). La apoptosis fue estudiada usando un Anexina V-FITC Kit /PI apoptosis detección (BD Biosciences) por citometría de flujo.
ensayo de micronúcleos
Las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se trataron con RD, DMSO o VP-16 (10 mmol /L) durante 24 h. Después de la fijación y permeabilización, las células se tiñeron con DAPI (Sigma). Micronúcleos en las células se marcaron con un microscopio de fase fluorescencia (Nikon). Al menos 1000 células por muestra fueron anotados para su análisis.
Neutro ensayo cometa
Las células fueron tratadas con productos químicos como se indicó anteriormente. DSB de ADN fueron detectados utilizando el Trevigen Comet, Ensayo de los organismos unicelulares electroforesis en gel de Ensayo (Trevigen). colas de los cometas se obtuvieron imágenes mediante un microscopio de fluorescencia de fase (Nikon) y se cuantificaron por el software de Casp. Un mínimo de 100 células fueron anotados por tratamiento
inmuno fluorescencia de tinción γH2AX y p-BRCA1
Las células cultivadas en cubreobjetos fueron fijadas con helado de metanol /acetona. (1: 1) y se incubaron con BSA 3% en PBS con 0,1% de Triton X-100. Después de la incubación con anticuerpos primarios y enjuagar con PBS, las células se inmunotiñeron con anticuerpos secundarios y contratinción con DAPI. Las imágenes de fluorescencia fueron capturados utilizando una microscopía confocal (CarlZeiss).
microarrays y PCR en tiempo real análisis
ARN total fue extraído a partir de células que fueron expuestos a los productos químicos que utilizan un RNAiso más kit (Takara Bio ). el análisis de microarrays se realizó a Genetimes Technology, Inc. (China) en el Affymetrix HG-U133 más 2 chips, y los datos originales se presentó a la GEO (Serie GSE37812). Para los ensayos de PCR cuantitativa (qPCR), cDNA se sintetizó usando ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo). qPCR se realizó con SYBR verde mezcla maestra de reacción en un sistema de PCR (Eppendorf Internacional) en tiempo real. los niveles de transcripción de los genes deseados se normalizaron al nivel de GAPDH. Los cambios en la expresión génica se calcularon utilizando el método t ΔΔC
. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 1.
Cebador directo (5 '- & gt; 3'): perfil del cebador inverso (5'->3')
Cdc25BGGCTGAGGAACCTAAAGCCCTCGATCTCATCGTGACACAGTCdc25CAGGAACCCCAAAATGTTGCCTGCAGAAGTGGTAAGCTGAGTGcyclin ETCCAAGAGTTTGCTTACGTCACGCCAGGAGATGATTGTTACAGGcyclin AGATGGTAGTTTTGAGTCACCACACACGAGGATAGCTCTCATACTGTcyclin B1ATAAGGCGAAGATCAACATGGCTTTGTTACCAATGTCCCCAAGAGcdc2ACACAAAACTACAGGTCAAGTGGGGAATCCTGCATAAGCACATCCRPA1CTCGGGAATGGGTTCTACTGTCACTTGGACTGGTAAGGAGTGARPA2TGGTAGCCTTTAAGATCATGCCCCTGGATTGCTGATAGGTGCTCRPA3TGATGGAACCCCTTGATGAAGACATGTTGCACAATCCCTAAAGGAXRCC5GACGTGGGCTTTACCATGAGTTCAGTGCCATCTGTACCAAACXRCC6AGTCATATTACAAAACCGAGGGCCCTTGGAGGCATCAACCAAAAAMSH6AGCTTAAAGGATCACGCCATCAAGCACACAATAGGCTTTGCCGAPDHTGGTCACCAGGGCTGCTTAGCTTCCCGTTCTCAGCCTTTable 1. Q-PCR adelante y atrás primers.
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Co-inmunoprecipitación
Las alícuotas de proteínas (1,2 mg) de control y células tratadas-RD se precleared con proteína A /G Plus -agarosa (Santa Cruz) en presencia de IgG no específico (Santa Cruz), después se incubaron con anticuerpos primarios y perlas de agarosa 20 l con mezcla continua durante la noche a 4 ° C. Las perlas se lavaron y se calentó a 75 ° C durante 5 min en tampón de carga antes de los ensayos de inmunotransferencia.
Análisis de ADN actividad de unión de fin de Ku70 /Ku86
extractos nucleares de control o RD se prepararon células tratadas, y se sometieron a la detección de la actividad de unión a ADN final de Ku70 y Ku86 usando un kit de reparación del ADN Ku70 /Ku86 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Active Motif).
ensayo de unión de extremos de ADN
Para determinar los efectos de la RD en las DSB reparación, se desarrolló un ensayo de unión de los extremos de ADN-libre de células como se describe por Shao C, et al. [17]. El plásmido pUC19 se digirió con HincII, dando lugar a una molécula lineal de extremos romos. El ADN linealizado se incubó con el extracto nuclear (2μg) en 50 mmol /L de Tris-HCl (pH 7,6), 10 mmol /L MgCl
2, 1 mmol /L de ditiotreitol, 1 mmol /L ATP, y 25% (w /v) de polietilenglicol 8000 a 14 ° C durante 6 horas o 24 horas. extracto nuclear de células Raji comprados de Active Motif sirvió como control positivo. La NHEJ se determinó mediante amplificación por PCR de la unión de extremos vuelto a unir con los cebadores M13. productos de PCR de la ampicilina se realizaron como un control interno. Todos los experimentos se repitieron tres veces.
NHEJ y reparación HR ensayo
La capacidad de reparación del ADN en las células tratadas con el RD se evaluó con los reporteros de recursos humanos y NHEJ que se amablemente proporcionados por el Dr. Gorbunova ( Departamento de Biología, Universidad de Rochester) [25,26]. El reportero de cassette para la detección de NHEJ o HR fue digerido con I-SCE para inducir DSBs. El casete reportero linealizado de NHEJ o HR y DsRed se co-transfectaron en células PC-3 después de ser tratado con RD o vehículo durante 24 h. Las células se analizaron en la máquina FACScalibur (Becton Dickinson, EE.UU.) utilizando una parcela verde fluorescente-versus-rojo. Los datos se analizaron con el software Cell Quest (BD Biosciences).
Evaluación del efecto antitumoral de RD
in vivo
Para evaluar el
in vivo
efecto de la RD en el CP, se utilizaron ratones de 6 semanas de edad, macho BALB /c-nu (Vital River Laboratories, Pekín, china). Los ratones se dejaron aclimatar durante 1 semana después de la llegada. xenoinjertos de tumores se establecieron mediante la inyección de 5 x 10
6 células PC-3 en los flancos derecho de ratones. Cuando los tumores fueron detectables, los ratones se asignaron al azar en grupos de tratamiento y de control. La dosificación inicial fue dado en el momento de coincidencia de par (día 1). RD se le dio (30 mg /kg) o placebo (cantidades equivalentes de disolvente) cada dos días por vía intraperitoneal inyección. Los ratones fueron controlados diariamente siguientes tratamientos, y los tumores se midieron cada dos días mediante la determinación de dos dimensiones perpendiculares [longitud (L) y anchura (W)] con pie de rey y se calcula utilizando la fórmula V = L x W
2/2. Después de un tratamiento de 20 días, todos los ratones fueron sacrificados por la anestesia con aire éter y sus tumores resecados para la medición de la masa tumoral. Los tejidos tumorales se fijaron en 4% de paraformaldehído y se utilizaron para el análisis de TUNEL (Calbiochem), inmunotransferencia, e inmunofluorescencia. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Shandong (Permiso Número: 2010038) y llevado a cabo en consecuencia
El análisis estadístico
Los datos se presentan como la media ± pm DE. de al menos tres experimentos independientes. La significación estadística de la diferencia de medias entre el control y los grupos tratados se determinó mediante un ensayo t por parejas donde
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
RD induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en las células PC-3
Desde RD se ha encontrado para inducir la apoptosis en células de leucemia y de pulmón células del cáncer [16,18], se inició nuestro estudio para determinar si RD también ejerció efecto citotóxico en células de CaP por la proliferación celular seguimiento continuo. Como se muestra en la Figura 1A, la exposición de PC 3-células a RD causado marcadamente supresión de la proliferación celular de una manera dosis-y dependiente del tiempo.
A
, la proliferación celular en respuesta a RD fue supervisado por los valores de índice de células (CI) que utilizan el sistema xCELLigence.
B Opiniones, Después de la exposición de las células PC-3 a RD durante 24 h, el ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo.
C
, análisis por inmunotransferencia de los reguladores del ciclo celular en las células tratadas con RD.
D
, los niveles de mRNA de G2 /M reguladores del ciclo relacionada en fase transitoria células tratadas-RD se determinaron mediante PCR en tiempo real. También se incluyeron cambios de expresión de los genes siguientes tratamiento RD (10μmol /L).
E
, el porcentaje de células apoptóticas se analizó mediante citometría de flujo.
F
,
a
, el análisis de las formaciones de micronúcleos en las células PC-3 tratadas con RD.
b
, la frecuencia de las células PC-3 que contienen micronúcleos tratados con RD o VP-16 durante 24 h. bares, Dakota del Sur. *, P & lt; 0,05, diferencia significativa con el grupo no tratado.
Después del tratamiento con el RD 24h, el ciclo celular fue detenido de manera significativa en la fase G2 /M con concentraciones crecientes. En consecuencia, el tratamiento RD dio lugar a disminuciones dependientes de la dosis en la expresión de ciclina E, A, y B, que son los marcadores moleculares correlacionados con la fase G2 /M. La familia de las fosfatasas Cdc25 y el objetivo aguas abajo Cdc2 juegan un papel importante en S y la progresión G2-M. También se observó una disminución en la expresión de CDC25B, Cdc25C y fósforo Cdc2
Tyr15 (forma inactiva) de una manera dependiente de la dosis en las células tratadas (Figura 1C). qPCR ensayos mostraron que la expresión de la Cdc2 en el nivel de transcripción se redujo notablemente en las células RD tratadas (Figura 1D), lo que sugiere que RD suprimió la expresión de Cdc2 en el ARNm, que a su vez dio lugar a una reducción de fósforo-Cdc2. Mientras tanto, los cambios en la expresión del ARNm de la ciclina E, A, B, CDC25B, y Cdc25C por RD (Figura 1D) fueron similares a las observaciones en la Figura 1C, lo que indica que el patrón de respuestas celulares fue consistente con la perturbación RD-inducida de ciclo celular en células PC-3. Además de la interferencia con la progresión del ciclo celular, RD fue capaz de inducir apoptosis notablemente de una manera dependiente de la dosis (Figura 1E)
.
Microarray análisis reveló que los genes relacionados con la unión a ADN dañado, la reparación del ADN, ciclo celular y apoptosis se cambiaron de manera significativa en las células RD tratadas en comparación con el control tal como se resume en la Tabla S1. De estos genes, se observó que la ciclina E, A, B, Cdc2, CDC25B, y Cdc25C se redujeron reguladas de forma espectacular en las células RD tratadas, consistente con los resultados en la Figura 1D.
RD provoca daños en el ADN en células de CaP
a continuación se determina si la exposición a RD en concentraciones que eran suficientes para inducir la detención del ciclo celular y la apoptosis dieron lugar a daños en el ADN, debido a la DR fue capaz de inhibir Topo II en las células de leucemia [16]. Como era de esperar, la formación de micronúcleos fue evidente en las células tratadas con 5 mol /L RD durante 24 h, y exhibió un aumento dependiente de la dosis (panel A en la figura 1F), similar a VP-16, un agente de daño de ADN bien documentada. El número de micronúcleos en las células expuestas a RD se resumió en el panel B de la figura 1F. Por lo tanto, estos resultados sugieren que RD induce daño en el ADN que se asoció con la promoción de la detención del ciclo celular y la apoptosis en células PC-3.
Para confirmar la capacidad de RD en el desencadenamiento de daño del ADN en células de CaP, se examinaron los cambios de los marcadores de daño del ADN por transferencia Western. Como se muestra en la Figura 2A, RD causó un aumento significativo en la fosforilación de la histona H2AX
Ser139 (γH2AX), un indicador de respuesta al daño de ADN bien conocido, en 2 h y se mantiene hasta 24 horas después del tratamiento en tanto dependiente de andrógenos (LNCaP) y independiente de andrógenos CaP (PC-3 y DU145) células. En relación a las proteínas de respuesta al daño del ADN, las expresiones de fósforo por RD BRCA1 fueron pronunciadas en los primeros puntos de tiempo y se dejó caer en las células tras tratamiento prolongado (Figura 2A), lo que sugiere que la respuesta inducida por RD daño del ADN en células de CaP.
Un
, análisis por inmunotransferencia de los niveles de expresión de p-BRCA1 y γH2AX en LNCaP, PC-3 y DU145 células expuestas a RD, respectivamente.
B Opiniones,
a
, se realizó ensayo cometa neutral para determinar fragmento de ADN en las células RD tratadas.
b
, Distribución de longitud del cometa media (100 células por muestra) se calculó mediante diagrama de caja y bigotes. Las medianas se indican mediante cruz; rango intercuartílico (25-75%; IQRs) se indican mediante cajas abiertas. Los bigotes son 1,5 veces la distribución RIC.
Además, ensayo cometa neutra se realizó para probar si RD puede inducir DSB en células de CaP. Los resultados en la Figura 2B mostraron que los momentos de la cola de ADN en respuesta a RD fueron detectables en las células tan pronto como tratamiento 2h, y se hizo más pronunciada con el tratamiento prolongado. Por lo tanto, los datos indicaron que RD causó significativamente las DSB en células de CaP.
RD afecta ATM /ATR-dependiente vías Chk1 /Chk2 en células PC-3
Para determinar si ATM /ATR-Chk1 /2 vías de señalización, que están bien identificados como ser activado después de daño en el ADN, están involucrados en la respuesta al daño del ADN inducido por RD, lo primero que examinó los cambios de factores sabe que son importantes para mediar en vías ATM /ATR. Los estudios cinéticos muestran elevada fosforilación de ATM y Chk2 (Thr
68) fue inducida por RD tan pronto como 30 minutos, pero este nivel de fosforilación fuertemente disminuyeron después. Mientras que se observó la activación de ATR /Chk1 en tratamiento 2 h y persistió hasta las 24 horas como se evidencia por la acumulación de fósforo-ATR y fósforo-Chk1 (Ser
296) en respuesta a RD (Figura 3A). Cabe señalar que ATR /Chk1 se activó significativamente por RD en el tratamiento de 2 h, en el que se deteriora la activación de ATM /Chk2. Desplazamiento de la activación de ATM para ATR sugirió que también se pueden producir otros tipos de lesiones del ADN, incluyendo la interferencia replicación y lesiones voluminosas, además de las DSB. regulación negativa de miembros de la familia Cdc25, aguas abajo de Chk1 /Chk2, es un importante mecanismo responsable del bloqueo de la entrada en mitosis tras el daño del ADN [19]. Como era de esperar, downregulated CDC25B /C y una inducción pronunciada de Cdc25C mitótico en 4h, que persistió después del tratamiento, se observaron en las células RD tratadas en comparación con las células no tratadas (figura 3A). Un aumento en la escisión de PARP también se observó (Figura 3A).
A
, cambios de proteínas daño del ADN en las células RD tratadas se analizaron por Western Blot.
B
, Después del tratamiento con productos químicos durante 4 h o 12 h, los niveles de proteína de las proteínas de daño en el DNA se detectaron por transferencia de Western.
C
, inmuno fluorescencia de tinción γH2AX focos y los focos p-BRCA1 en las células PC-3.
D
,
a
, Neutro ensayo cometa de células PC-3 tratadas con RD durante 4 horas y 12 horas.
b
, la longitud del cometa fue analizado por caja y método de la gráfica de la barba (100 células por muestra).
E
, Asociaciones de γH2AX, PP2Ac, y PPP4C se determinaron mediante el uso de anti-coimmunoprecipitation γH2AX, anti-PP2Ac, anti-PPP4C, o IgG normal.
F
, PC-3 células fueron pretratadas con 10 mmol /L de la cafeína durante 1 h, y se expone a RD durante 4 horas y 12 horas,
a
, la viabilidad celular se mide mediante el ensayo de MTT; bares, Dakota del Sur. *,
#, P & lt; 0,05, una diferencia significativa del control.
b
, los cambios de γH2AX fueron detectados por Western Blot.
daño en el ADN desencadena una cascada de señalización que conduce a la formación de un complejo de reparación en las pausas. El próximo evaluó los cambios de los genes BRCA1 proteína, una molécula fundamental en el reclutamiento inicial de otras proteínas /enzimas de reparación en las pausas [20]. La activación de BRCA1 (fosforilación en Ser
1524) por RD se observó hasta 4 h, y se redujo después del tratamiento, lo que se correlaciona bien con el patrón de activación de Chk2, lo que sugiere Chk2 realidad puede fosforilar BRCA1 en respuesta a los daños (Figura 3A). Sobre la base de las observaciones anteriores, se encontró que los cambios significativos se han producido en los tratamientos 4h y 12h, los cuales podrían ser puntos críticos de tiempo de respuesta al daño del ADN inducido por RD. Otros estudios (Figura 3b) muestran que, el patrón de la respuesta que implica γH2AX, fósforo-Chk1 /2 y fósforo-BRCA1 en 4h y 12h era consistente con las observaciones en la Figura 3A. Estos resultados fueron apoyados por la observación de la figura 3C. Como control, Vp-16 fue capaz de mantener niveles elevados γH2AX fósforo-Chk1 /2, fósforo-BRCA1, y después de una exposición más larga en comparación con aquellos en los tratamientos RD (figura 3B y 3C), lo que sugiere que los diferentes mecanismos contribuyeron a las respuestas de RD y VP-16 tratamientos. De acuerdo con las alteraciones de las proteínas de respuesta al daño del ADN, pronunciadas colas de los cometas, se mostró a presentar en las células expuestas a RD (paneles A y B en la Figura 3D). Es de destacar que γH2AX elevada que puede ser fosforilada por quinasas ATM /ATR [21,22] era evidente en 4h y sostenida hasta 48 horas después del tratamiento RD, donde se abrogó el ATM-activado /ATR por el RD (Figura 3A). También se analizaron los cambios de la proteína fosfatasa 2A (PP2A) y la proteína fosfatasa 4 (PP4), que están implicados en la desfosforilación de γH2AX [23,24]. Después del tratamiento 24h, RD causado un aumento del PP2Ac (subunidad catalítica de PP2A), y PPP4C (subunidad catalítica de PP4) (Figura 3E), lo que indica que se mantuvo H2AX fosforilado en presencia de elevada PP2Ac y PPP4C. Resultados de co-inmunoprecipitación mostraron que γH2AX fue marcadamente notable con una disminución progresiva PP2Ac o PPP4C en complejos inmunoprecipitados por anti-γH2AX, anti-PP2Ac o anticuerpos anti-PPP4C (Figura 3E), lo que sugiere que las asociaciones deteriorados de γH2AX /PP2Ac /PPP4C por RD puede , al menos en parte, contribuir a la acumulación sustancial de γH2AX.
Además, la cafeína, un inhibidor de la señalización de ATM /ATR, casi completamente abrogada la capacidad de RD para promover la fosforilación de H2AX durante el tratamiento, que fue acompañado con la reversión significativa de la muerte celular inducida por RD (Figura 3F). En conjunto, los datos demuestran claramente que las vías cascada mediadas por ATR ATM /desempeñaron un papel crucial en la respuesta a RD inducida por daño en el ADN, lo que lleva a la promoción de las células para entrar en la mitosis letal.
RD inhibe NHEJ y HR en PC-3 células
para determinar los efectos del RD sobre las DSB reparación, se desarrolló un ensayo de unión de los extremos de ADN-libre de células para evaluar la contribución relativa de NHEJ de ADN unión de extremos [17]. ADN pUC19 plásmido linealizado por la enzima HincII se incubó con extractos de proteínas nucleares, y la actividad de unión de los extremos se refleja por la aparición de dímeros lineales y multímeros que fueron amplificados por PCR con los cebadores M13 que flanquean la unión unido final (Figura 4A, 4B). Después del tratamiento con RD durante 6 horas o 24 horas, la actividad NHEJ del extracto nuclear se suprimió notablemente tal como se indica por la aparición de una fuerte banda de monómero y, correspondientemente, la disminución de productos multímeros, mientras dímero, trímero, y bandas de tetrámero eran evidentes en el grupo de control (Figura 4B ). Como control positivo, la actividad NHEJ también se vio afectada por RD durante la incubación del sustrato de ADN con extracto nuclear de células Raji (Active Motif) en las mismas condiciones (Figura 4B). Además, la incubación de ADN lineal con anticuerpos bloqueantes dirigidos contra Ku70 y Ku86 en las proteínas nucleares dirigidos a la disminución de las bandas de multímeros, similar a la observación en el tratamiento RD (Figura 4B), proporcionando pruebas de que Ku heterodímero Ku70 /Ku86 son dos de las proteínas importantes en las DSB reparación RD-mediada.
Un
, diagrama esquemático del principio de ADN unión de extremos de ensayo.
B Opiniones, Después de ser tratado con RD, o con anticuerpos bloqueantes Ku 70/86, se determinó la capacidad relativa de NHEJ.
C
,
a
, diagrama esquemático del principio de ensayos NHEJ.
b
, diagrama esquemático en el principio de los ensayos de recursos humanos.
D
, el número de GFP
+ y DsRed
+ células se determinaron por citometría de flujo, y las huellas típicas de FACS se muestran a la izquierda. La relación de las buenas prácticas agrarias
+ para DsRed
+ células se utilizó como medida de la eficiencia de reparación.
Nos dieron un paso más para evaluar los efectos de RD en NHEJ y HR utilizando
in vivo
ensayos descritos por el Dr. Gorbunova [25,26]. Para la detección de la actividad NHEJ, se producirá la GFP reportero NHEJ cuando está activo para reparar los DSB inducidos por digestión enzimática (Figura 4C, a). Para la detección de recursos humanos, eventos de conversión génica de éxito puede reconstituir el gen GFP activa mediante la reparación de DSB-enzima producida (Figura 4C, b). Después de ser tratado con RD durante 24 h, las células PC-3 fueron co-transfectadas con la enzima I-SceI digerido casete reportero de NHEJ o HR, y el plásmido DsRed para normalizar la eficiencia de transfección. La reparación de roturas inducidas-I-SCE dará lugar a la aparición de GFP
+ células [26]. Después de la transfección, las células se analizaron por citometría de flujo, y la relación entre GFP
+ y DsRed se utilizó
+ células como una medida de HR o eficiencia NHEJ. Como se muestra en la Figura 4D, la señal de GFP se redujo significativamente en ninguno de los sistemas de reparación HR en las células tratadas con RD NHEJ o, lo que indica que DSBs reparación se altera en respuesta a la RD. En conjunto, los datos demostraron que la DR fue capaz de inhibir la NHEJ y HR, y suprimió las DSB reparación en las células PC-3.
RD regula a la baja las proteínas de reparación del ADN en las células PC-3
Sobre la base de la observaciones anteriores, que aclaran el papel de Ku70 /Ku86 en respuesta al daño del ADN inducido por RD. Después de la incubación de las células con RD para diferentes períodos de tiempo, Ku86 aumentó y alcanzó un máximo de 4 horas, luego disminuyó rápidamente hasta 48 horas, mientras que Ku70 se mantuvo sin cambios hasta 12 horas y disminuyó después de eso (Figura 5A). actividad de unión a fin de ADN de Ku70 /Ku86 muestra que, en comparación con las células no tratadas, las actividades de unión de ambos Ku70 /Ku86 en células tratadas se han mejorado de manera constante hasta 4 h y después disminuyó durante el resto del período de exposición (Figura 5B), en consonancia con los resultados de la Figura 5A. Además, se confirmó el efecto inhibidor dependiente de la dosis de RD en la expresión y la actividad de unión de Ku70 /Ku86 en 4h y 12h tratamientos (Figura 5C, 5D). Por otra parte, qPCR ensayos demostraron que la reparación del ADN asociado
RPA1-3
,
XRCC5
,
XRCC6
, y
MSH6
fueron downregulated de RD (Figura 5E ). En conjunto, estas observaciones indican que RD deteriorado la reparación del ADN en respuesta al daño del ADN.
Un
y
C
, Análisis de la expresión de Ku70 y Ku86 en proteínas nucleares por parte ensayo de western blot.
B Opiniones y
D
, Análisis de ADN vinculante actividad de fin de Ku70 o Ku86 en células PC-3 expuestos a la RD. *, P & lt; 0,05, una diferencia significativa del control.
E
, mapa de calor de los niveles de mRNA de los genes de reparación del ADN en las células RD-tratada que se determinaron por tiempo real RT-PCR. Rojo: la sobre-expresión, verde: subexpresión, negro: sin cambiar de expresión, gris: no detección
RD desencadena la apoptosis asociada con la inducción de daño en el ADN en PC-3 xenoinjerto
Para determinar si RD podría inducir la apoptosis de las células tumorales a través de la inducción de daño en el ADN
in vivo
, como se observa en las células cultivadas, humanos xenoinjertos PC-3 se han desarrollado en ratones desnudos masculinos. La administración de RD no tuvo ningún efecto significativo sobre el peso inicial o final fi corporal en ratones portadores de tumores en comparación con el grupo placebo (Figura 6A). Después 20d tratamientos, los tumores derivados de animales de control como resultado muerte de dos animales durante el período experimental, mientras que los tumores de los ratones tratados con RD tuvieron un tamaño significativamente más pequeño (Figura 6B), indicando la inhibición del crecimiento tumoral significativa por RD. Reducción de la masa tumoral en los ratones tratados RD-También se observó (Figura 6C). Los cambios de marcadores moleculares asociados con el daño del ADN en los ratones tratados muestran que RD provocó la respuesta daños en el ADN a través de la señalización mediada por ATR ATM /como se evidencia por la acumulación sustancial de γH2AX, abrogación de fósforo BRCA1, y la abundancia de Ku70 /Ku86 (Figura 6D y 6E ), en consonancia con los resultados en células de cultivo. alteraciones Mientras tanto, mediada por RD en las expresiones de los miembros de la familia PP2A fueron similares a las observaciones que se muestran en células de cultivo. Además, en comparación con el control de placebo, abrogación de Bcl-2, la acumulación de Bax, y la escisión de PARP fueron evidentes en los ratones tratados con RD (Figura 6D). ensayo de TUNEL también apoyó las observaciones que las células apoptóticas se manifiestan en los ratones tratados con RD (Figura 6F a y b). Los datos demostraron que el RD provocó daños en el ADN y las proteínas de reparación deteriorados, lo que lleva a la muerte celular por apoptosis, lo que contribuyó a su efecto antitumoral
Un CD -.
C
, Efecto de RD en el crecimiento del tumor y el peso corporal de ratones desnudos.