Extracto
El potencial metastásico de las células es un parámetro importante en el diseño de estrategias óptimas para el tratamiento personalizado del cáncer. Usando microscopía de fuerza atómica (AFM), se muestra, consistente con estudios previos realizados en otros tipos de cáncer epitelial, que las células de cáncer de ovario son generalmente más suave y muestran una menor variabilidad intrínseca de la rigidez celular de las células epiteliales de ovario no malignas. Un examen detallado de las células de cáncer de ovario altamente invasivas (HEY A8) en relación con sus células parentales menos invasivos (HEY), demuestra que la capacidad de deformación es también un biomarcador precisa de potencial metastásico. la expresión génica análisis comparativos indican que la reducción de la rigidez de las células A8 altamente metastásicas HEY se asocia con citoesqueleto de actina remodelación y el examen microscópico de la estructura de las fibras de actina en estas líneas celulares es consistente con esta predicción. Nuestros resultados indican que la rigidez célula puede ser un biomarcador útil para evaluar el potencial metastásico relativa de ovario y quizás otros tipos de células cancerosas
Visto:. Xu W, Mezencev R, Kim B, Wang L, McDonald J, Sulchek T (2012) Cell rigidez es un biomarcador del potencial metastásico de células de cáncer ovárico. PLoS ONE 7 (10): e46609. doi: 10.1371 /journal.pone.0046609
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Abril, 2012; Aceptado: 4 Septiembre 2012; Publicado: 4 de octubre 2012
Copyright: © Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores gracias NSF (número de proyecto CBET-0932510) para el apoyo financiero de este proyecto. Los autores también agradecen el Premio del Presidente de Investigación de Pregrado programa (PURA) y el Programa de Becarios Petit en Georgia Tech para proporcionar financiación a BK. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La integridad mecánica de las células está regulada por una red dinámica de estructural, reticulación, y moléculas de señalización [1]. Por lo tanto, las alteraciones de las propiedades mecánicas de las células individuales pueden revelar información importante acerca de los cambios en estas redes. Los estudios de una variedad de enfermedades que utilizan diferentes técnicas experimentales han demostrado que las anormalidades en las propiedades elásticas de las células están asociadas con la patogénesis de enfermedades y la progresión [2], [3], [4], [5], [6], [7] , [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Por ejemplo, las células tumorales invasoras se ablandan mecánicamente y modificar su adhesión a la matriz extracelular, lo que mejora su capacidad para escapar del tumor primario [5], [17], [18]. Las mediciones de la rigidez de células de cáncer, cuantificada por el módulo de Young, han demostrado una fuerte correlación entre deformabilidad celular y malignidad celular [5]. Del mismo modo, se informó de la rigidez de las células cancerosas metastásicas aisladas de los fluidos pleurales de pacientes con cáncer de mama a ser más de 70% inferior, con una desviación estándar más de cinco veces más estrecho, que las células mesoteliales reactivas benignas [3].
la distribución de la red de actina juega un papel importante en la determinación de las propiedades mecánicas de las células individuales [19], [20], [21]. Como las células se transforman de no maligno a los estados cancerosos, sus cambios de la estructura del citoesqueleto de una organizada a una red irregular, y este cambio reduce posteriormente la rigidez de las células individuales [5], [22]. Los estudios de las propiedades mecánicas de las células cancerosas descritas anteriormente implican que el cambio de la rigidez de las células individuales se puede indicar la presencia de malignidad [15], [16], [23], [24].
La necesidad de efectivo biomarcadores para enfermedades es particularmente importante en el caso de cáncer de ovario, que es el más mortal de los cánceres ginecológicos. El cáncer de ovario se ocupó el quinto lugar entre las principales causas de muerte por cáncer de las mujeres de Estados Unidos en 2007 y su tasa de supervivencia a 5 años fue del 46% para todos los casos diagnosticados en 1999-2005 [25]. Debido a la falta de disponibilidad de detección fiable en la práctica clínica y el curso asintomático a través de etapas tempranas de la enfermedad, la mayoría de los casos de cáncer de ovario (68%) se diagnosticó como enfermedad metastásica con una pobre supervivencia [26].
este estudio de las propiedades mecánicas de las células de varias líneas diferentes de células de cáncer de ovario y las células epiteliales de la superficie del ovario inmortalizadas no malignas (IOSE), se demuestra que la rigidez de células no sólo distingue a las células del cáncer de ovario a partir de células no malignas, pero también se puede distinguir con mayor /células cancerosas invasivas oncogénicas de tipos menos tumorigénicas /invasoras. Nuestros resultados indican que la medición de la rigidez de células de ovario y quizás otros tipos de células cancerosas no sólo puede contribuir a una mejor comprensión de los mecanismos físicos y moleculares que subyacen a la progresión del tumor, pero también puede servir como una herramienta clínica útil en la evaluación de potencial metastásico .
Materiales y Métodos
de ovario línea celular crecimiento y preparación de muestras de
células epiteliales de ovario superficie inmortalizadas (IOSE) fueron generosamente proporcionadas por el Dr. N. Auersperg (Universidad de British Columbia, Vancouver, Canadá) y se cultivaron en medio 199/105 (01:01) suplementado con suero de 15% de bovino fetal (FBS, Atlanta Biológicos, Atalanta, GA) y solución de antibiótico-antimicótico al 1% (Mediatech Cellgro-, Manassas, VA ). El cáncer de ovario HEY HEY y líneas celulares A8 fueron proporcionados por el Dr. G. Mills (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX) y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 10% y solución de antibiótico-antimicótico al 1% (medio R10). El cáncer de ovario líneas celulares OVCAR-4 OVCAR-3 y se adquirieron a partir del Programa de Desarrollo Terapéutico (DTP) del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) (Bethesda, MD). Antes de los experimentos de AFM, las células se sembraron en un Fluorodish (World Precision Instruments, Sarasota, FL) con una densidad inicial de 10.000-20.000 células /cm
2.
Microscopía de Fuerza Atómica
hemos llevado a cabo la microscopía de fuerza atómica (AFM) mediciones mecánicas [27], [28] en las células epiteliales de ovario individuales. La AFM utilizada en nuestros experimentos es el MFP-3D (de asilo Investigación, Santa Barbara, CA) con un combinado Nikon Ti invertida microscopio óptico (Nikon, Melville, NY) que se utiliza para alinear ópticamente la sonda a las células. Las sondas utilizadas en este estudio fueron MCST-AUHW (Bruker, Camarillo, CA) con una constante elástica nominal de 0,03
N
/
m
. Para simplificar la geometría de contacto y minimizar la tensión lateral de la muestra durante la sangría, la punta en voladizo se modifica uniendo una microesfera de sílice llanura de diámetro 4,7 m. Las mediciones se llevaron a cabo en medios de cultivo celular a temperatura ambiente, con células cultivadas en placas en la parte inferior de vidrio de la Fluorodish. Para eliminar los efectos de confusión de las células sobre la disposición de citoesqueleto y la morfología vecino, se midieron las células individuales.
Antes de las mediciones de células, el voladizo se calibró en la parte inferior de vidrio de la Fluorodish utilizando el método de vibración térmica [29] con el espectro térmico resultante equipado con función de Lorentz para determinar la constante de muelle. Las células fueron sangradas aproximadamente sobre la región perinuclear de las células individuales. La profundidad de indentación fue elegido para ser de al menos 1 m con el fin de simular mejor las deformaciones que se producen fisiológicamente. La fuerza frente a las curvas de sangría de cada medición se analizaron mediante un modelo de Hertz de contactos [30], [31] para obtener el módulo de cada célula de la joven. Un bosquejo del montaje experimental se muestra en la Fig. 1
a
. Micrografía electrónica de barrido de la punta de perlas usado en este experimento se muestra en la Fig. 1
b
. Ejemplos de imágenes ópticas obtenidas durante la indentación de células se muestran en las Figs. 1,
c CD -.
g
(A) Bosquejo de las mediciones en las células con AFM,
δ
sangría, (B) es la imagen SEM de la punta de cuentas, las mediciones de rigidez de células individuales con AFM para (C) IOSE, (D) OVCAR-4, (e) HEY, (F) OVCAR-3 y (G) HEY células A8. Se utilizó el mismo en voladizo; el brazo del voladizo tiene una anchura de 20 micras y sirve como una barra de escala.
Fluorescencia de Imagen y Análisis de la F-actina
Imaged la red F-actina marcada de cada línea celular mediante microscopía de fluorescencia. Las células se cultivaron en un cubreobjetos de vidrio a una densidad de 5.000 células /cm
2. La hoja de la cubierta con células cultivadas en placas se colocó en un pocillo de una placa de 6 pocillos con 2 ml medios de cultivo celular. Las células se incubaron a 37 ° C durante la noche y luego se tiñeron con faloidina conjugada con fluorocromo. Las células se tiñeron por primera fijación con 1 ml 4% de formaldehído en PBS (pH 7,4) durante 10 min y permeabilización con 1 ml 0,2% TX-100, el bloqueo con 1% de BSA durante 20 min y la incubación durante una hora con 1:20 Alexa Fluor 546 faloidina (Life Technologies, Grand Island, NY) en 1% de BSA. Todas las etapas durante el proceso de tinción se llevaron a cabo a temperatura ambiente en un cuarto oscuro. Después de la tinción, las células se intercalan entre el cubreobjetos de vidrio y una lámina de vidrio, montado con prolongar oro y sellado con esmalte de uñas. Múltiples imágenes de cada línea celular fueron tomadas usando un microscopio Nikon Ti (Nikon, Melville, NY) con el conjunto de filtros TRITC excitación /emisión. El análisis se limitó a las células individuales que no estaban en contacto con otras células.
Las características estructurales de la red de actina se analizaron mediante la cuantificación de un parámetro de orientación para los filamentos de actina. Una rápida de Fourier bidimensional Transform (FFT) se aplicó a las imágenes originales de fluorescencia utilizando rutinas de Matlab (The MathWorks, Natick, MA). A partir de la imagen transformada, los códigos de encargo de MATLAB calculan la amplitud angular de la FFT sumando los cuadrados de los componentes de FFT, de las que se determinó la distribución de la orientación de los filamentos de actina como una función del ángulo. Los algoritmos matemáticos de cálculo de la función de distribución de la orientación se basan en los reportados previamente en la literatura [32]. El método se ilustra en la Fig. S1 en el material de apoyo a una imagen de fluorescencia representante de una célula con IOSE.
migración y la invasión ensayos
El CytoSelect 24 pocillos migración celular y el kit de ensayo de invasión (Cell Biolabs, San Diego, CA ) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el ensayo de migración, 1,5 × 10
5 células en medio DMEM /F12 libre de suero que contiene 0,5% de BSA, CaCl 2 mM
2 y mM MgCl 2
2 se cargaron en insertos no recubiertas individuales con aproximadamente 8 m tamaño de poro. Los insertos se colocaron en una placa de 24 pocillos que contenía medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS. Después de 3 h de incubación a 37 ° C en el aire humidificado con un 5% de CO
2, las células que migraron a la parte inferior de los insertos se separaron, se lisaron y cuantificadas utilizando colorante fluorescente CyQuant GR en un lector de placas a 480 nm /520 nm (Synergy 4, BioTek, Winooski, VT). ensayos de invasión se llevaron a cabo de una manera idéntica con 32 h de incubación utilizando la membrana basal insertos de matriz recubierto. Todos los ensayos se realizaron por triplicado con un estudio inicial realizado curso de tiempo para llegar a la transmigración significativa.
microarrays y Pathway análisis de enriquecimiento
Se extrajo ARN de dos culturas no confluentes de HEY HEY y A8 las células cultivadas en medio R10 usando Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosciences, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante y la integridad del ARN se verificó mediante un Bioanalyzer RNA Pico Chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). mRNA se marcó utilizando el kit de etiquetado IVT (Affymetrix, Santa Clara, CA) y marcado con biotina ARNm se hibridó en GeneChip sonda Arrays U133 Plus 2.0 (Affymetrix). Affymetrix.CEL archivos fueron procesados con el software de Affymetrix expresión Console versión 5.0 utilizando el flujo de trabajo de RMA 3'-expresión. Los 4.746 funciones con valores más bajos del 10% del logaritmo de la intensidad de señal en todos los 4 chips se retiraron y el 49,929 características restantes se analizaron mediante análisis de la importancia microarrays versión (SAM) 4.0 [33] con los siguientes parámetros: Tipo de respuesta: de dos clases desapareado; estadística de prueba: T-estadística; Número de permutaciones: 500; Los datos en escala log 2; No mediana de centrado. Se informó que los genes expresados diferencialmente entre HEY HEY clases y A8 si cumplían con los criterios siguientes:. (i) Tasa de Falso Descubrimiento = 1.1% y (ii) veces el cambio absoluto (FC) ≥1.5
interpretaciones biológicas del los datos de expresión diferencial de genes se realizaron mediante análisis de vías de enriquecimiento usando MetaCore 5.2 (GeneGo, St Joseph, MI). Significativamente vías y redes perturbadas se identificaron mediante mapeo hasta reguladas y genes regulados (combinado e individualmente) en mapas GeneGo vía canónica (colección de señalización de mano curada y rutas metabólicas) y redes de procesos GeneGo (modelos de redes establecidas de forma manual de los principales procesos celulares ) [34].
GeneGo mapas vía canónica y redes de procesos se clasifican en función de su relevancia para el conjunto de entrada de genes utilizando los valores de p calculados sobre la base de una distribución hipergeométrica. múltiples pruebas de corrección se ha realizado mediante Tasa de Falso Descubrimiento con el umbral adaptativo configurado para permitir no más de 1 vía /red predicho incorrectamente como enriquecida significativamente.
Para ampliar aún más la interpretación biológica de los datos de expresión génica diferencial, el significado topológico análisis (TSA) del perfil de expresión génica se realizó utilizando la herramienta en línea proporcionado por GeneGo Inc (http://topology.genego.com/zcgi/topology_scoring.cgi). Esta herramienta de mapas de genes expresados diferencialmente sobre una base de datos propietaria GeneGo de las interacciones proteína-proteína e identifica las proteínas que ocupan posiciones topológicamente significativas con respecto a los genes expresados diferencialmente [35], [36]. genes topológicamente significativas (p & lt; 0,01) fueron identificados para todos los genes regulados hasta en HEY células A8 en relación con HEY células por medio de los "caminos de la transcripción de activación de todos los nodos" algoritmo y posteriormente asignadas a los mapas GeneGo vía canónica como se describió anteriormente
.
qPCR
Selección de genes (PRKAA2, TWF1 y mYLK), identificados por el análisis de microarrays como significativamente diferencialmente expresados entre HEY HEY A8 y células, fueron validados utilizando prediseñados TaqMan® Gene Expression Assays (Life Technologies, Grand Island , NY). Se extrajo ARN de 3 culturas no confluentes de células HEY HEY y A8 (Arcturus ARN PicoPure kit de aislamiento) y la transcripción inversa y se amplifica usando Aplausos sistema de 3'-Amp (Nugen Technologies, Inc., San Carlos, CA) de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. qPCR ensayos se realizaron para cada gen y cada muestra de 4 repeticiones utilizando ciclos térmicos condiciones recomendadas para la Expresión Génica TaqMan Master Mix y doblar los valores de cambio entre Hey A8 y se determinaron las células Hey usando 2
-ΔΔCt método que usa gen GAPDH como internos el control.
Análisis estadístico
en general, la significación estadística de las diferencias en la rigidez media entre tipos de células se puso a prueba mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Importancia de las diferencias entre todos los pares de células se ensayó usando el test post de Dunn. Importancia de las diferencias en la migración y la invasión entre IOSE, HEY y células HEYA8 se analizaron por ANOVA, seguido por el test de Tukey para comparaciones por pares (* p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01; *** p & lt;. 0.001 test de Kruskal-Wallis, ANOVA y todas las pruebas post se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 5.02 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA). las asociaciones entre rigidez celular y la invasividad celular, rigidez celular y propiedades migratorias de células, y la rigidez de células y el grado de co-alineación de F-actina se sometieron a pruebas de correlación producto-momento de Pearson y de correlación de Spearman y se expresa como coeficientes de correlación (r y ρ, respectivamente). se realizó un análisis de correlación utilizando el software estadístico R libre [37].
resultados y discusión
Cell la rigidez es un biomarcador de metastásico (/) invasividad migratorias potenciales
representativas curvas de fuerza-sangría obtenidos a partir de sondeo mecánica de las células individuales se representan en la Fig. 2
a
. Cada curva representa la fuerza aplicada necesaria para aplicar sangría a una célula de ovario individuo del IOSE y líneas de células HEY. Las sondas de contacto con la célula en una muesca de 0 m. Dado que la pendiente en un punto de cada curva de fuerza-indentación está relacionado con la rigidez de células, la variabilidad de pistas para cada sondeó celular en una línea celular dado indica la variabilidad de la rigidez entre las células individuales de la misma cultura. En general, las curvas correspondientes a las células no malignas IOSE tienen pendientes mayores que los correspondientes al cáncer ovárico HEY células y son por lo tanto más rígido.
(A) Los diagramas de caja y bigotes de la rigidez de las células individuales en diferentes células líneas, los percentiles son 10%, 25%, 50%, 75% y 90%, el recuadro muestra las curvas de fuerza representativos de IOSE y HEY. diferencia global entre medias es significativa (valor de p & lt; 2,2 x 10
-16, Kruskal-Wallis); pairwise diferencias son significativas entre IOSE y HEY, HEY A8 y células OVCAR-3, entre HEY HEY A8 y las células y entre HEY A8 y OVCAR-4 células (p & lt; 0,05, después de la prueba de Dunn); pruebas (B) migración y la invasión de IOSE, HEY HEY células y A8. F (480/520) es una intensidad de fluorescencia a 480 nm de excitación y 520 nm de emisión, que es proporcional a la cantidad de la migración de células o invasor.
Las curvas de fuerza se analizaron con un modelo de contacto de Hertz para determinar el correspondiente módulo de células individuales de Young. Se determinó el módulo de Young para diferentes líneas de células epiteliales de ovario, incluyendo IOSE no malignos y una variedad de líneas celulares de cáncer (OVCAR-3, OVCAR-4, HEY, HEY y A8). La distribución de módulo de células individuales de jóvenes de diferentes líneas celulares se representa en la caja y bigote parcelas (Fig. 2
a
). IOSE demostró mayor rigidez media que cualquiera de los cánceres de ovario. La diferencia global entre las líneas celulares fue significativa (p & lt; 2,2 x 10
-16) con los siguientes pares se presentan diferencias significativas (p & lt; 0,05): IOSE vs OVCAR-3, IOSE vs HEY, IOSE vs HEY A8, OVCAR- 4 vs HEY A8, y HEY HEY vs A8. Los módulos estándar y media de las desviaciones de estas células de Young se resumen en la Tabla 1. Las células IOSE no malignas demostraron mayor variabilidad intrínseca de la rigidez de células que las células de cualquier línea celular de cáncer de ovario, lo que es consistente con la previamente reportados mayor variabilidad en la rigidez de células benignas relación con las células de cáncer de mama aisladas de fluidos pleurales [3].
en particular, las células A8 HEY HEY y derivados de la misma muestra de tumor [38] muestran diferencias significativas en rigidez, con células HEY A8 siendo más compatible (Fig. 2
a
). Este hallazgo es significativo en que estas células isogénicas también difieren en su tumorigenicidad en ratones desnudos, en los que las células HEY A8 son más tumorigénico después de la inyección intraperitoneal a ratones desnudos [38]. Para explorar la relación entre las propiedades mecánicas de estas líneas celulares de ovario y su potencial metastásico, se examinaron las propiedades migratorias e invasivas de HEY HEY células y A8 en relación con el uso de Iosé
in vitro
ensayos. HEY células A8 muestran la mayor actividad invasiva y migratoria seguida de HEY células y las células de control IOSE (Fig. 2
b
) lo que indica que la rigidez relativa se correlaciona inversamente con los indicadores de potencial metastásico (migración y la invasión). Estos resultados, resumidos en la Fig. 3 y en la Tabla 2, son coherentes con los informes anteriores que une deformabilidad celular con tumorgenic y el potencial metastásico [5], [7], [33].
Los datos de puntos están equipados con la ley de potencia para mayor claridad. Las barras de error: errores estándar de las medias
perfiles de expresión génica de HEY HEY A8 y Células Enlaces Aumento potencial metastásico con cambios en la mediada citoesqueleto de actina Remodelación Rutas
Después de haber establecido. que la adquisición de la rigidez disminuido en HEY células A8 relación con las células HEY se correlaciona con un aumento en (es decir, la migración celular y la invasión) potencial metastásico, se realizó un análisis comparativo de la expresión génica (microarrays de ADN) de estas dos líneas celulares con el fin de profundizar en la posible base molecular del fenotipo adquirido.
Uso del análisis de la importancia microarrays (SAM) se identificaron 3.641 rasgos expresados diferencialmente entre estas líneas celulares (F1) de archivos y determinamos que 1.258 fueron de genes regulados y 1.272 las reguladas en HEY HEY A8 en relación con las células (15 genes muestran cambios discordantes en la expresión entre HEY HEY células y A8 para conjuntos de sonda redundantes). vías significativamente enriquecidos GeneGo (Tabla 3) y las redes de proceso (Tabla 4) que corresponden a nuestro conjunto de genes expresados diferencialmente indican que las diferencias entre HEY y HEY células A8 incluyen cambios en la fase mitótica del ciclo celular (conjunto de husillo /separación de los cromosomas, los microtúbulos del huso) , la regulación de la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT), la remodelación del citoesqueleto, la adhesión celular, y la regulación de CFTR (regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis)
Red termómetro:. genes transcripcionalmente arriba regulado en células HEY A8; Termómetro azul: los genes transcripcionalmente-regulado en células HEY A8; amarillo termómetro: proteínas topológicamente relevantes para el conjunto de genes regulados hasta
(A) IOSE, (B) OVCAR-4, (C) HEY, (D) OVCAR-3 y (e. ) HEY A8.
(a) función de distribución de la orientación Representante para cada línea celular, (B) la rigidez frente a grado de coalignment de F-actina, barra de error representa el error estándar de la media (SEM).
Para explorar aún más el potencial importancia biológica de las diferencias en la expresión de genes entre HEY HEY células y A8, que emplea importancia el análisis topológico (TSA). Usando este enfoque se identificaron 1.108 identificadores únicos Entrez Gene correspondientes a las proteínas topológicamente relevantes asociados a los genes regulados hasta en las células HEY A8 (identificación de genes Entrez convertidos a los 1.199 símbolos oficiales de genes se presentan en S2 Archivo). Significativamente enriquecido vías GeneGo para estas proteínas topológicamente relevantes (360 rutas a FDR = 0,26%) sugieren considerables diferencias biológicas entre HEY HEY células y A8 incluyendo aquellos que no pudieron ser identificados en el nivel transcripcional (S3 Archivo). Una discusión completa de estos resultados está más allá del alcance de este documento y será presentado en otros lugares. Aquí nos limitaremos nuestra discusión a los cambios más relevantes a las diferencias observadas en la rigidez del celular se discutió anteriormente.
La parte superior y asegurar la vía GeneGo de proteínas topológicamente pertinentes (S3) del archivo es la "vía TGF, WNT y la remodelación del citoesqueleto "(Fig. 4). Esta vía también se identificó enriqueció significativamente como para los genes regulados en células HEY A8 (Tabla 3). Estos resultados indican que las diferencias en la rigidez entre HEY HEY y células A8 están relacionados con la remodelación del citoesqueleto. Nuestros resultados apoyan las predicciones anteriores que la base de rigidez reducida asociada con el cáncer [39] y las células altamente invasivos [40] puede estar asociado con la remodelación del citoesqueleto. Más apoyo a esta conclusión proviene de la TSA que encontró varios isophorms de actina superfamilia topológicamente significativa de los genes regulados hasta en HEY A8 células (S2 Archivo), así como del análisis de la expresión diferencial, que encontró que las proteínas actina-monómero vinculante CFL2 , TWF1 y PFN1 que regulan la incorporación de monómeros de actina en filamentos [41] se sobreexpresa en células HEY A8. La sobreexpresión de la cofilina-2 (CFL2) mejora la tasa de recambio de filamentos de actina por despolimerización de filamentos en sus extremos puntiagudos [42] mientras twinfilin (TWF1) funciona como una proteína actina-monómero-secuestro que también separa los filamentos de actina para promover el desmontaje de filamentos
Hoteles en vitro y su rápida rotación
in vivo
[43]. El hecho de que la cadena ligera de la miosina quinasa (MYLK), que promueve una actividad motora miosina actina-activado y generación de tensión [44], es significativamente reducido regulado en HEY células A8 apoya aún más el papel de las fibras de estrés en la diferencia observada en la rigidez de la célula. Curiosamente, BDM y ML-7, los inhibidores de la MYLK, se ha informado anteriormente para inducir ablandamiento de las líneas celulares de fibroblastos [45]. La fosforilación de la cadena ligera de la miosina, la formación de fibras de estrés, y el posterior aumento de la rigidez de células puede ser también inducida a través de RhoA /Rho-quinasa vía [46], que se inactiva por la proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA) [47]. Se encontró que el regulador (PRKAR2A, PRKAR2B) y la subunidad catalítica (PRKACB) los genes de la PKA se sobreexpresa significativamente en HEY HEY A8 en relación con las células que sugiere la inactivación dependiente de PKA de quinasa vía RhoA /Rho en células HEY A8. qPCR validación de los datos de expresión génica diferencial de microarrays experimento confirmó la sobreexpresión de los genes PRKAA2 y TWF1 con las respectivas veces cambia de 3.89 y 2.63 y disminución de la expresión del gen MYLK con doble cambio -2.0 en células HEY HEY A8 en relación con las células (Fig. S2).
los análisis microscópicos de células de cáncer ovárico y de control Confirmar que mediada por actina citoesqueleto remodelación está asociada con el cambio en el potencial metastásico
Desde nuestros análisis moleculares indican que la remodelación del citoesqueleto de actina mediada puede ser un importante contribuyente a las diferencias observadas en la rigidez del celular entre HEY y la Hei células más invasivos /tumorigénicas A8, hemos probado la hipótesis mediante el examen de la estructura del citoesqueleto de HEY y HEY células A8 en relación con otras células de cáncer de ovario (OVCAR-3, OVCAR-4) y no células epiteliales de ovario -malignant inmortalizadas superficie (IOSE). Los resultados presentados en la Fig. 5 más densa de visualización, bien alineada F-actina con fibras de estrés más largos en IOSE relativa a todas las células de cáncer de ovario. Esto es consistente con las comparaciones entre células normales y cancerosas se informó anteriormente [5], [20].
Además, el grado de co-alineación de fibras F-actina entre las diversas líneas celulares examinadas correlacionados con el observado diferencia en células rigidez. Por ejemplo, para las células IOSE más rígidos, los filamentos de actina se distribuyen a través del cuerpo de la célula, con la mayoría de los haces de actina F-alineados a lo largo del eje largo de la celda con las fibras de estrés bien definidos y contactos focales. En contraste, los filamentos de actina en las células de cáncer de ovario más blandas son menos organizada y haces de F-actina están orientadas al azar con interrumpidos, segmentos cortos. En OVCAR-4 células, los filamentos de actina están alineados sólo a nivel local y forman una red enmarañada. En las células HEY, los filamentos de actina se rompen en segmentos más cortos y exhiben reducida co-alineación. F-actina en células OVCAR-3 mantiene una estructura cortical con la mayoría de los filamentos se extiende en la región periférica de la célula, aunque con una densidad relativamente baja. HEY células A8 muestran características similares de distribución de F-actina a HEY células, pero con una menor densidad. Dado que el citoesqueleto de actina contribuye a las propiedades mecánicas de las células, las variaciones observadas son consistentes con diferencias en la rigidez de la célula y con los informes anteriores [8], [19].
analizó cuantitativamente el grado de co-alineación de F-actina en las cinco líneas celulares mediante el uso de la función de distribución de la orientación. Los resultados se muestran en la Fig. 6
a
. Un parámetro
D
, define como se utilizó para cuantificar el grado de co-alineación de F-actina de las funciones de distribución de la orientación, donde
P (θ)
representa la función de distribución de la orientación, la cual es la probabilidad de que una fibra orientada en el ángulo de
θ
la imagen de la fluorescencia en.
P
0 (θ)
es la función de distribución de la orientación para el caso extremo en que la F-actina están completamente distribuido al azar y por lo tanto tiene un valor de
P
0 (θ) =
1/180. En el caso extremo en el que todas las fibras de actina están orientadas al azar sin ninguna preferencia, la función de distribución de la orientación debe ser una constante e independiente del ángulo. De la definición de
D
, un mayor valor de
D
indica una desviación creciente de la alineación al azar y un mayor grado de co-alineación de F-actina. distribuciones de orientación de F-actina difieren entre las cinco líneas celulares de ovario (Fig. 6
a
). En las células IOSE no malignos, la mayoría de los haces de F-actina fueron alineados a lo largo del eje largo de la célula, que es ~135 °. Por el contrario, OVCAR-4 células presentan varias orientaciones de F-actina, lo que indica que los filamentos de actina son ni uniformemente alineados, ni uniformemente distribuidos. Este resultado es manifiesto a partir de la imagen de fluorescencia en la Fig. 5. La relación entre el grado de co-alineación de F-actina y la rigidez de célula única se representa en la Fig. 6
b
, que muestra fuerte correlación positiva y significativa (r = 0,99834 con p-val = 8.064 × 10
-5 y ρ = 1 con p-val = 0.01667). Este resultado sugiere que los cambios en la co-alineación de los haces de actina F también podrían contribuir a las diferencias en la rigidez de células dentro de las líneas de células de ovario examinados.
Conclusiones
Nuestro análisis de IOSE no maligno y cuatro líneas celulares de cáncer de ovario indica que las células cancerosas exhiben una relativa rigidez media inferior a las células precursoras no malignas. Curiosamente, también encontramos que el aumento de la capacidad invasiva y migratoria asociada con HEY células A8 relación con las células HEY también se correlaciona con una reducción significativa en la rigidez de la célula. análisis de expresión génica comparativo de HEY HEY y células A8 indica que la base molecular de la reducción en la rigidez entre estas células es un reflejo de los cambios moleculares extensos, incluyendo cambios en las vías del citoesqueleto de actina remodelación. Los análisis microscópicos del citoesqueleto de actina en las células del cáncer de ovario y de control son consistentes con esta hipótesis
.
Desde nuestras mediciones se llevan a cabo con las líneas celulares de cáncer, se necesitan más estudios para ver si se encuentran resultados similares en el caso de los pacientes -derivado células. Establecer el potencial metastásico relativa de las células cancerosas es un factor importante en el diseño de estrategias óptimas en el tratamiento personalizado del cáncer [48]. Actualmente, se requiere extensa perfil molecular para estimar el potencial metastásico de las células del cáncer [49]. En conjunto, nuestros resultados indican que la rigidez mecánica puede ser un biomarcador útil en el desarrollo de métodos clínicos precisos y no invasivas para evaluar el potencial metastásico relativa de ovario y quizás otros tipos de células cancerosas.