Extracto
Rnd3 /RhoE es una pequeña GTPasa Rho implicado en la regulación de los diferentes comportamientos celulares. La desregulación de Rnd3 se ha relacionado con la tumorigénesis y metástasis. Los cánceres de pulmón son la causa principal de muerte relacionada con el cáncer en Occidente y en todo el mundo. La expresión de Rnd3 y su papel ectópico en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) aún no se han explorado. A continuación, se informó de que Rnd3 se había reducido regulado en tres líneas celulares de cáncer: H358, H520 y A549. La baja regulación de Rnd3 llevó a la hiper-activación de Rho-cinasa y la señalización de Notch. La reintroducción de Rnd3 o la inhibición selectiva de la señalización de Notch, pero no la señalización de Rho quinasa, bloquea la proliferación de H358 y H520 células. Mecánica, dominio intracelular Notch (NICD) la abundancia de proteínas en las células H358 estaba regulado por la degradación mediada por proteasoma Rnd3 INET. Rnd3 regula la proliferación de células H358 y H520 a través de un Notch1 /INET /Hes1 señalización eje independiente de Rho-cinasa
Visto:. Tang Y, Hu C, Yang H, L Cao, Li Y, Deng P, et al. (2014) Rnd3 regula la proliferación celular del cáncer de pulmón a través de la señalización de Notch. PLoS ONE 9 (11): e111897. doi: 10.1371 /journal.pone.0111897
Editor: Jeremy J. W. Chen, Instituto de Ciencias Biomédicas, Taiwán
Recibido: 13 Junio, 2014; Aceptado: September 29, 2014; Publicado: 5 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Tang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la clave de citar Centro Nacional de Investigación de Enfermedades Respiratorias Clincial, Clave Nacional Científica & amp; Programa de Apoyo a la Tecnología: La innovación colaborativa de Investigación Clínica para la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y el cáncer de pulmón, Nº 2013BAI09B09. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en los países desarrollados. Los principales tipos de cáncer de pulmón son el carcinoma de células pequeñas de pulmón (SCLC) y carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). A pesar de los avances en la medicina actual, la supervivencia global a los 5 años de los pacientes diagnosticados con NSCLC es de aproximadamente 15%, lo que indica que (1) carecemos de una forma eficaz de prevenir NSCLC; y que (2) que no entienden completamente NSCLC. La recurrencia de malignidad y resistencia a la quimioterapia son dos importantes limitaciones en el tratamiento de cánceres de pulmón. De interés, varias neoplasias malignas que son resistentes a la terapia han sido estrechamente asociado con la señalización de Notch hasta reguladas [1]. El papel de la señalización Notch en el CPNM es objeto de controversia. Algunos estudios han informado de que activa Notch1 inhibe el crecimiento de algunas células de NSCLC [2], [3], mientras que un estudio más reciente demostró que una mutación activadora Notch1 en aproximadamente el 10% de NSCLC llevó a un mal pronóstico en los pacientes [4]. Por lo tanto, la investigación adicional de señalización Notch en el CPNM es necesaria para entender esta enfermedad y puede ser beneficioso para el tratamiento del NSCLC.
Rnd3, también conocido como RhoE, es una pequeña GTPasa implicado en la regulación de una amplia variedad de comportamientos celulares, incluyendo el citoesqueleto, la proliferación, la migración y la apoptosis [5] - [9]. La función biológica de Rnd3 se identificó primero como un represor Rock1 que regula la dinámica de actina [5]. Recientemente, los estudios han informado de la amplia función de Rnd3 en el cáncer y sistema de neuronas desarrollo. Curiosamente, Rnd3 es el regulado en diferentes células cancerosas, como las células de cáncer de mama [8], carcinoma hepatocelular [10], carcinoma de células escamosas [11], las células tumorales mesenquimales [12], etc. Sin embargo, los estudios de la expresión y función biológica de Rnd3 en el CPNM son muy limitadas.
el papel de Rnd3 en la regulación del ciclo celular se informó hace una década. la sobreexpresión forzada de Rnd3 inhibe la proliferación celular y la entrada en fase S inducida por el suero, independiente de la señalización de RhoA-ROCK, lo que indica que la señalización complicado está implicado en la regulación del ciclo celular [13]. Una publicación reciente exploró una relación muy interesante entre Rnd3 y Notch de señalización [7]. La supresión de Rnd3 dio lugar a una regulación de la señalización de Notch en ratones células ependimarias, que promueve la proliferación de estas células. RNAi mediada Rnd3 baja regulación en dos líneas celulares, MDA-MB-231 y HepG2, promueve la proliferación celular, la progresión del ciclo celular y la invasión. Sin embargo, el papel de Rnd3 en los cánceres de pulmón, concretamente en NSCLC, sigue sin estar claro. Este estudio, por primera vez, descubre los papeles patogénicos de Rnd3 en CPNM, incluyendo las siguientes: 1) Rnd3 es el regulado en el A520, H358 y A549, líneas celulares de cáncer de pulmón de tres; 2) la expresión de Rnd3 forzado en células A520 y A358 inhibe la proliferación celular; 3) la proliferación celular mediada por Rnd3 se regula a través de la regulación de señalización Notch través de la modificación posterior a la traducción.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y generación de líneas celulares estables
H358 (ATCC, CRL-5807), (ATCC, CCL-185) las células H520 (ATCC, HTB-182) y A549 se cultivaron en RPMI-1640 (Life Technologies, Cat#11875-085) más suero bovino fetal al 10% (vida Technologies, Cat#16000-044) y 1% de penicilina-estreptomicina (Life Technologies, Cat#15140-148). HBEC células fueron cultivadas en medio libre de suero de queratinocitos (Life Technologies, Cat#17005-042), además de extracto de pituitaria bovina (Life Technologies, Cat#13028-014) y EGF humano recombinante (Life Technologies, Cat#PHG0311).
Rnd3 ADNc se subclonó en el vector lentiviral pWPI-polio-eGFP. 293 T (Invitrogen, Carlsbad, CA) las células se transfectaron con el vector lentiviral que expresa Rnd3 y dos vectores auxiliares, PMD2 y psPAX2, para producir lentivirus. células H358 y H520 se infectaron entonces con el virus a una MOI de 10. La eficacia de la infección se verificó mediante la expresión de GFP mediante microscopía fluorescente. Las células infectadas fueron seleccionados por puromicina (2 mg /ml). Un solo clon fue elegido para producir líneas celulares estables, H358-H520-Rnd3 y Rnd3.
Para los experimentos de medición del número de células, se sincronizaron las células durante 12 horas y 10
5 células de cada grupo se cultivaron en medio de crecimiento. El número de células se contó cada 24 h durante un total de 5 días.
inmunotransferencia
Las muestras de proteínas para el análisis de western blot fueron extraídos por tampón RIPA (Thermo Scientific, Cat#89900), además de una proteasa cóctel inhibidor (Roche, Cat#11836153001) y fosfatasa inhibidores (NaF 50 mM, 2 mM de Na
3Vo
4, 4 mM de pirofosfato de sodio). anticuerpos comercialmente disponibles eran de las siguientes fuentes: MYPT1 (2634 S), fosfo-T853 MYPT1 (4563 S) y PDK1 (3062) de Señalización Celular Tecnología (MA, EE.UU.); MLC2 (PA5-17624) y fosfo-Ser20 MLC (PA5-17727) de Thermo Scientific Pierce (IL, EE.UU.); Rock1 (sc-5560) y Rnd3 (SC-53874) de Santa Cruz Biotechnology (CA, EE.UU.). Hes1 (ab71559) y Notch 1 (ab27526) eran de Abcam (MA, EE.UU.). Equivalente a la carga de proteínas fue verificada por la intensidad de un GAPDH (sc20357, Santa Cruz, CA) blot.
extracción de ARNm y QRT-PCR
ARN total fue extraído mediante el reactivo Trizol (Life Technologies, 15596-026). QRT-PCR se realizó usando un método de verde SYBR con un sistema tampón de mezcla maestra. Las secuencias de los cebadores fueron los siguientes: Rnd3: CTATGACCAGGGGGCAAATA /TCTTCGCTTTGTCCTTTCGT; Jag-1: CTATGATGAGGGGGATGCT /CGTCCATTCAGGCACTGG; Jag-2: TGGGATGCCTGGCACA /CCGGCAGATGCAGGA; DLL-1: GAGGGAGGCCTCGTGGA /AGACCCGAAGTGCCTTTGTA; DLL-4: GCATTGTTTACATTGCATCCTG /GCAAACCCCAGCAAGAGAC; Notch 1: CACTGTGGGCGGGTCC /GTTGTATTGGTTCGGCACCAT; Hes1: AGGCGGACATTCTGGAAATG /CGGTACTTCCCCAGCACACTT; GAPDH:. GAGTCAACGGATTTGGTCGT /TTGATTTTGGAGGGATCTCG
incorporación de BrdU ensayo
Las células se sincronizan y después se cultivaron en medio de crecimiento durante 12 h seguido de BrdU tratamiento (bromodesoxiuridina) durante 30 min antes de la cosecha. El anticuerpo anti-BrdU (ratón, BD, 552598, 1:1000) se incubó a 4 ° C durante 16 h, y el anticuerpo anti-IgG de ratón de cabra secundario conjugado con Alexa Fluor 594 (1:200) se adquirió de Invitrogen ( A11032). El tiempo de incubación fue de 1 hora a temperatura ambiente, protegido de la luz. Los núcleos se visualizaron mediante DAPI (4 ', 6'diamidino-2-fenilindol) (Vectashield, Vector Laboratories, Inc. H1000), y las imágenes fueron adquiridas por microscopía de fluorescencia (DMI 4000B, Leica, Mannheim, Alemania).
El análisis estadístico
Los datos se expresan como media ± desviación estándar En múltiples comparaciones de grupos, ANOVA de una vía seguida por se utilizó el método de Student-Newman-Keuls. En las comparaciones de 2 grupos,
se utilizó t
prueba de un desapareado, de Student de dos colas. Todos los análisis fueron realizados por SigmaPlot 11.0 (Systat, San Jose, CA, EE.UU.). Un valor de P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Rnd3 es el regulado junto con el aumento de la actividad de Notch y Rho-cinasa en las células H358 y H520
Dos humano. líneas celulares de NSCLC, H358 y H520, se utilizaron en este estudio. Se usaron células epiteliales bronquiales humanas (HBEC) como un control normal. Se detectó la expresión Rnd3 tanto a nivel de ARNm y proteínas. En comparación con las células HBEC, la expresión Rnd3 fue significativamente las reguladas en H358 y H520 células (Fig. 1A-C). Rnd3 se identificó primero como un inhibidor endógeno Rock1 que regula el citoesqueleto. A continuación, se investigó la señalización Rho-cinasa sondeando dos sustratos de quinasa Rho bien caracterizadas en esas tres líneas celulares. Como se muestra en la Fig. 1D-G, la fosforilación de la miosina fosfatasa, el objetivo de la subunidad 1 (MYPT1) y ligera de la miosina de cadena 2 (MCL2) fue significativamente mayor en H358 y H520 células, lo que indica una actividad de Rho-cinasa activada por hiper. Sin embargo, el nivel de expresión Rock1 no fue diferente entre las líneas celulares (Fig. 1H). Un potente Rho quinasa 1 activador [14], PDK1, que podría competir con Rnd3 de unirse a Rock1, nivel de expresión fue también no cambió en el H358 y H520 células en comparación con las células HEBC (Fig. S1). De interés, además de la señalización de Rho quinasa-up regulado, también se observó la señalización de Notch hiper-activado en H520 y H358, en comparación con las células HBEC (Fig. 1I, 1J), como se evidencia por la acumulación de la forma activa Notch 1 , dominio intracelular Notch (NICD). Tanto Rho quinasa y Notch han sido ampliamente estudiado en diferentes células y modelos genéticos. El papel biológico de la activación de estas dos vías de señalización en CPNM, y la relación entre Rnd3 baja regulación y el INET sobre regulación en los cánceres de pulmón aún no se ha caracterizado.
(A) Rnd3 ARNm detectado por QRT PCR es el regulado en H358 y H520 en comparación con HBEC. (B) Rnd3 niveles de expresión de proteínas en las células por Western blot. (C) la cuantificación de la intensidad de la banda Densitometría occidental en B. (D), (F), (H) & amp; (I) una transferencia Western para detectar MYPT1 fosforilada, fosforilados MLC2, Rock1 y NICD en las células. (E), (G) & amp; (J) Densitometría cuantificación de la intensidad de banda occidental mostró sobre regulación de la actividad de quinasa Rho y expresión INET en H358 y H520 células en comparación con HBEC. Western blots se cuantificaron a partir de tres repeticiones experimentales independientes. BrdU de células positivas se cuantificaron a partir de 8 imágenes tomadas de cuatro diapositivas. Los datos representan la media ± SD
celular
La inhibición de la proliferación por la sobreexpresión estable de Rnd3 en H520 y H358
Para investigar el papel de la reducción de la expresión ectópica Rnd3 en células H520 y H358, que genera líneas que expresan establemente Rnd3-GFP usando un sistema de lentivirus. expresión Rnd3 se verificó por tanto anti-Rnd3 (detecta endógeno y exógeno Rnd3) y anti-GFP (detecta exógeno Rnd3 solamente) anticuerpos (Fig. 2A y 2C). H358-H520 y Rnd3-Rnd3 expresan de forma estable Rnd3 en 2,7 veces y 4,4 veces mayor en comparación con las células H358 y H520, respectivamente (Fig. 2B y 2D). A continuación, se determinó la tasa de proliferación de las dos líneas celulares estables utilizando un ensayo de incorporación de BrdU. Las células se sincronizaron por la privación de suero y después se cultivaron en medio de crecimiento durante 12 h, seguido de tratamiento BrdU durante 30 min antes de la cosecha. Las células se transfirieron a portaobjetos por Cytospin para la tinción y formación de imágenes. La tasa de proliferación se indica por la tinción de BrdU positivas fue significativamente menor en las células H358-H358 Rnd3 en comparación con células (Fig. 2E y 2F). El mismo resultado se observó en células H520-H520 Rnd3 en comparación con células (Fig. 2G y 2H). Contamos también la relación de BrdU + célula para GFP + células como se muestra en la Fig. S2. La relación fue significativamente mayor en H358 (50%) y H520 (41%) de las células en comparación con las células (11%), respectivamente (Fig. S2A y S2B) H358-Rnd3 (15%) y H520-Rnd3. Además, 1 × 10
5 células de cada grupo se sincronizan y luego cultivadas. El número de células se contó en diferentes puntos de tiempo (día 0, 1, 2, 3, 4 y 5). Se observó un aumento significativo en el número de células en las células H358 y H520. Sin embargo, este incremento se atenuó notablemente tanto en H358-Rnd3 y células H520-Rnd3 comenzó en el día 2 (Fig. 2I y 2J). Tomados en conjunto, la sobreexpresión de Rnd3 forzado en H358 y H520 podría reducir la tasa de proliferación de estas células. La inhibición del crecimiento celular del tumor es uno de la mayoría de las estrategias importantes en el tratamiento del cáncer. El papel de Rnd3 en la inhibición de la proliferación de estas dos NSCLCs hace que sea un posible objetivo para el tratamiento del cáncer
(A) & amp.; (B) La generación de una línea celular que expresa de forma estable H358 Rnd3 GFP-etiquetados. La expresión Rnd3 fue verificada por las dos anticuerpos Rnd3 y GFP. (C) & amp; (D) La generación de una línea celular que expresa de forma estable H358 Rnd3 GFP-etiquetados. La expresión Rnd3 fue verificada por las dos anticuerpos Rnd3 y GFP. (E) & amp; (F) H358-Rnd3 tiene una tasa de proliferación más bajo en comparación a las células H358 como se detecta por la incorporación de BrdU. (G) & amp; (H) H520-Rnd3 tiene una tasa de proliferación más bajo en comparación a las células H520 como se detecta por la incorporación de BrdU. (I) & amp; (J) El número de células se cuantificó en diferentes puntos de tiempo. Un promedio de tres muestras en cada punto de tiempo se presentó en esta figura. Western blots se cuantificaron a partir de tres repeticiones experimentales independientes. Los datos representan la media ± SD
La reintroducción Rnd3 mitigado Rho-quinasa y la señalización Notch en H520 y H358 células
Nos mostraron una mayor actividad de Rho-quinasa y la expresión INET junto con un reducido nivel de expresión en Rnd3 células H520 y H358 en comparación con las células epiteliales de pulmón normales, HBEC (Fig. 1). A continuación explorado si existe una correlación entre la expresión inferior y superior Rnd3 Rho-cinasa y expresión INET. La expresión INET se había reducido regulado más de 3,5 veces en las células H520-H520 Rnd3 en comparación con las células (Fig. 3A y 3B). El fosforilada fosfatasa de la cadena ligera de la miosina, la subunidad 1 (pMYPT1) y la cadena ligera de la miosina (pMLC2) se redujeron regulado de 2,5 y 1,8 veces, respectivamente, en las células H520-H520 Rnd3 en comparación con las células (Fig. 3C y 3D). En las células H358, se observó la misma tendencia de expresión INET y la actividad Rho-cinasa cuando se sobreexpresa Rnd3. La expresión NICD se redujo 2,9 veces en las células H358-Rnd3 en comparación con células H358 (Fig. 3E y 3F), mientras que pMYPT1 (2,46 veces) y pMLC2 (1,83 veces) también se redujo en las células H358-Rnd3 en comparación con H358 las células (Fig. 3G y 3H). Además, la sobreexpresión de Rnd3 en H358 y H520 células no cambió la expresión de ligando de Notch como se muestra en la Fig. S3. La expresión del ser humano Jagged-1 (Jag-1), Jagged-2, (Jag-2), Delta-like-1 (DLL-1) y el ARNm se midió mediante qRT-PCR Delta-como-4 (DLL-4) . No hay ningún cambio estadísticamente significativo en la expresión de los ARNm en H358 y H520 H358-comparó la Rnd3 y H520-Rnd3, respectivamente (Fig. S3 A y S3 B). Estos resultados sugieren que Rnd3 podría regular tanto Rho-cinasa y INET señalización en H358 y H520 células. Rnd3 es un regulador de inhibir la activación de Rho-cinasa y expresión INET en NSCLC. Rnd3 modulación de la señalización Notch mediada no lo hizo a través de la regulación de la expresión ligando Notch
(A) & amp.; (B) Disminución de la expresión en células INET H520-H520 Rnd3 en comparación con las células. (C) & amp; (D) Disminución de la actividad de Rho-cinasa en las células H520-Rnd3 comparación con las células H520 detectados por anticuerpos específicos para pMYPT1 y pMLC2. (E) & amp; (F) La disminución de la expresión en células INET H358-H358 Rnd3 en comparación con las células. (G) & amp; (H) Disminución de la actividad de Rho-cinasa en las células H358-H358 Rnd3 en comparación con las células detectadas por anticuerpos específicos para pMYPT1 y pMLC2. Western blots se cuantificaron a partir de tres repeticiones experimentales independientes. Los datos representan la media ± SD
La inhibición de la señalización Notch impedido la proliferación de las células H520 y H358
Hemos demostrado que la sobreexpresión forzada de Rnd3 por lentivirus tanto en H520 y H358 células 1) inhibió la proliferación (Fig. 2) y 2) bloqueó la activación de Rho quinasa y la señalización de Notch /NICD. Para determinar qué vía de señalización puede contribuir a la tasa de proliferación, inhibidores químicos se aplicaron a las células. Ya sea fasudil, un inhibidor de la quinasa Rho [15], [16], puede afectar a la tasa de proliferación celular en H358 y H520 células? Nuestros datos muestran que la inhibición de la actividad de Rho quinasa por fasudil no alteró la proliferación de células H520 y H358 (Fig. S4). Sin embargo, el compuesto E [17], un inhibidor específico de señalización Notch, puede atenuar la proliferación en ambas líneas celulares (Fig. 4). El tratamiento con el compuesto E redujo la proliferación de H358 por 40% en comparación con el grupo de control tratado DSMO como se indica mediante un ensayo de incorporación de BrdU (Fig. 4A y 4B). La tasa de proliferación se redujo a sólo el 32% del control en el grupo de H520 (Fig. 4C y 4D). Para probar la posible citotoxicidad del Compuesto E, se evaluó la muerte celular mediante tinción con azul de tripano. A la concentración de 5 nM compuesto E, no detectamos una muerte celular significativa en comparación con el grupo sin tratamiento, tanto en H358 y H520 células (Fig. S6, imagen 2 y 6 en comparación con 1 y 5, respectivamente), lo que sugiere la citotoxicidad de E Compuesto en todas las tres líneas celulares a esta concentración fue mínima. Hemos aumentado aún más la concentración del compuesto E a 50 nM y 500 nM, y encontramos que la muerte celular sólo menos del 5% se observó en el 50 grupo nM (Figura S6, la imagen 3, 7 y 11.), Mientras que la muerte celular masiva (& gt; 50%) fue causada por una alta dosis de compuesto e (500 nM, Fig. S6, imagen 4, 8 y 12). El experimento usando inhibidores de la señalización selectivos sugirió que Rnd3 baja regulación mediada NICD regulación puede jugar un papel más importante en la proliferación de H358 y H520 células y que esta proliferación no es Rho quinasa dependiente.
(A) &erio; (B) La aplicación del compuesto bloquea E la proliferación de las células H358 como se detectó mediante un ensayo de incorporación de BrdU. Las células se trataron con el compuesto E a la concentración final de 5 nM y sincronizados por el agotamiento de suero seguido por crecimiento en medios durante 12 horas. A continuación, las células se trataron con BrdU durante 30 minutos antes de ser cosechadas para el análisis. (C) & amp; (D) La aplicación del compuesto bloquea E la proliferación de las células H520 como se detectó mediante un ensayo de incorporación de BrdU. Las células se trataron con el compuesto E a la concentración final de 5 nM y sincronizados por el agotamiento de suero seguido por crecimiento en medios durante 12 horas. A continuación, las células se trataron con BrdU durante 30 minutos antes de ser cosechadas para el análisis. BrdU de células positivas se cuantificaron a partir de 8 imágenes tomadas de cuatro diapositivas. Los datos representan la media ± S. D.
Rnd3 regula la proliferación mediante la modulación de la señalización del eje INET /Hes1 en H520 y H358 células
señalización Notch es un importante regulador del ciclo celular. El bloqueo de la señalización de Notch inhibe el crecimiento de las diferentes células [18] - [20]. Notablemente, un estudio reciente realizado por Chang et al. INET grupo demostró que regula la proliferación de células epidérmicas a través de la regulación de Hes1 en ratones knockout Rnd3 [21]. Por lo tanto, se investigó la expresión Hes1 en nuestras células. Hes1 fue regulado hasta 5 veces en H520 y H358 en comparación con las células HBEC (Fig. 5A y 5B). De acuerdo con una tasa de proliferación atenuada observado en células H358-Rnd3 H520-Rnd3 y (Fig. 3E-3H), expresión Hes1 fue también el regulado por 2 veces y 2,5 veces en estas dos líneas celulares en comparación con H520 y H358, ., respectivamente (Fig. 5C-5F), lo que sugiere que NICD disminuciones de inhibición mediada en las tasas de proliferación de H520-H358 y células Rnd3-Rnd3 pueden ser a través de la expresión Hes1 las reguladas
(A) & amp; (B) Hes1 fue hasta reguladas en H520 y H358 células en comparación con las células HBEC. expresión (C-F) Hes1 disminuye cuando Rnd3 se sobreexpresa de forma estable en células H358 y H520. (G) & amp; (H) sobreexpresión transitoria de Rnd3 en células H358 INET y Hes1 el regulado en una forma dependiente de la dosis. (I) & amp; (J) La inhibición de la actividad del proteasoma por MG132 (concentración final de 15 mM) abolió la dosis Rnd3 dependiente NICD baja regulación en células H358. Western blots se cuantificaron a partir de tres repeticiones experimentales independientes. Los datos representan la media ± S. D. *
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control (grupo 0);#
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el grupo 1; $
p Hotel & lt; 0,05 comparado con el grupo 3. Los datos representan la media ± SD
Para definir la relación entre Rnd3 y INET, hemos realizado una expresión dependiente de dosis de Rnd3 en células H358 . myc-Rnd3 se transfectó transitoriamente en células H358 en diferentes dosis (0, 1 mg, 3 mg, 5 mg). A continuación, se analizó la expresión de NiCd y Hes1 por Western blot. Con el aumento de expresión Rnd3, el INET y disminuyeron los niveles de expresión Hes1 (Fig. 5G y 5H). No es de extrañar, Hes1 ARNm, un gen diana INET, cambió (barra de color negro. Fig S5 llena) en consecuencia. Sin embargo, no se observó ningún cambio en Notch1 ARNm (Fig. S5 barra vacía), a pesar de la disminución significativa en el nivel de proteínas debido a Rnd3 sobreexpresión, lo que sugiere que Rnd3 regulado NICD a nivel post-traslacional, ya que el nivel INET está regulada por la degradación del proteasoma [22]. Nos inhibe la actividad del proteasoma MG132 usando y encontramos que la degradación dependiente de la dosis Rnd3 INET fue bloqueado por completo (Fig. 5I y 5J), lo que sugiere un papel regulador posterior a la traducción de Rnd3 en la degradación del INET.
Rnd3 regula la proliferación a través Notch1 la señalización en células de adenocarcinoma de pulmón
línea celular
H358 se deriva de un carcinoma bronquioalveolar del pulmón y la línea celular H520 se obtuvo a partir de pulmón squamouse carcinoma de células. Sin embargo, el principal subtipo de NSCLC fue adenocarcinoma de pulmón. Así confirmamos nuestro estudio en células de adenocarcinoma de un pulmón, A549, como se muestra en la Fig. 6. Rnd3 se había reducido regulado junto con hasta reguladas Rho-cinasa y Notch1 señalización en las células A549 en comparación con las células HBEC (Fig. 6A y 6B). Se cuantificó la sobre regulación pliegue en cambio en dos de señalización. Los resultados se mostraron en la Fig. 6C. Rho-cinasa de señalización fueron hasta reguladas por casi 4 veces lo demuestra el nivel de pMYPT1; la señalización Notch 1 son regulados hasta en un 5 veces lo demuestra el nivel INET. La inhibición de Notch1 señalización por el Compuesto E bloqueó la proliferación de células A549 (Fig. 6d y 6e). La citotoxicidad de E Compuesto en la celda A549 también se evaluó mediante tinción con azul tripán. Como se muestra en la Fig. S6 (imagen 9-12), el 5 nM Compuesto E no causó muerte significativa en comparación con su estado básico en las células A549. Mecánica, Rnd3 regula la proliferación celular a través de la señalización INET /Hes1. La sobreexpresión Rnd3 suprimió la NICD y expresión Hes1 en una forma dependiente de la dosis en células A549 (Fig. 6F y 6G). Nuestros resultados en las células A549 fueron consistentes con los resultados de H358 y H520 células, lo que sugiere la señalización Rnd3-NICD-Hes1 era un mecanismo generalmente molecular para regular NSCLC crecimiento celular. En conjunto, se observaron mayores INET y expresión Hes1 y una menor expresión Rnd3 en H520, H358 y A549 células en comparación con las células HBEC. Reintroducción de Rnd3 inhibida INET y Hes1 expresión, lo que resultó en tasas de disminución de la proliferación de las células H520 y H358. El bloqueo de la señalización Notch1 inhibió la proliferación celular en H358, H520 y células A549. Rnd3 regula la abundancia INET a través provocando su degradación proteasomal en NSCLC
.
(A) Rnd3 ARNm detectado por QRT-PCR es el regulado en comparación con el A459 HBEC. (B) & amp; (C) Un western blot para detectar MYPT1 fosforilada, INET en las células. (Húmedo; (E) La aplicación del compuesto bloquea E la proliferación de células A459 como se detectó mediante un ensayo de incorporación de BrdU. Las células se trataron con el compuesto E a la concentración final de 5 nM y sincronizados por el agotamiento de suero seguido por crecimiento en medios durante 12 horas. A continuación, las células se trataron con BrdU durante 30 minutos antes de ser cosechadas para el análisis. (F) & amp; (G) la sobreexpresión transitoria de Rnd3 en las células A549 de NiCd y Hes1 el regulado en una forma dependiente de la dosis. Los datos representan la media ± S. D. *
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control (grupo 0);#
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p Hotel & lt; 0,05 comparado con el grupo 3. Los datos representan la media ± SD
Discusión
Rnd3 pertenece a la superfamilia Ras y es una pequeña GTPasa Rho que regula una variedad de funciones celulares y enfermedades. Se identificó originalmente como un inhibidor de Rock1 endógeno. Rnd3 une a Rock1 para inhibir la señalización aguas abajo [5]. Recientemente, los estudios han puesto de relieve el papel fundamental de Rnd3 en diferentes tipos de cáncer. Rnd3 es el regulado en muchos tipos de cáncer, como el carcinoma hepatocelular [10], [23], las células tumorales mesenquimales [12], y el cáncer de próstata [12]. Sin embargo, en algunos tipos de cáncer, Rnd3 está regulado, tal como en los tumores de páncreas [24], [25], las líneas celulares de cáncer de colon [25] y algunos melanomas [26]. Estas diferencias sugieren que Rnd3 tiene funciones específicas en diferentes linajes celulares. Curiosamente, como un gen altamente relacionada con tumores, la investigación sobre el papel de Rnd3 en NSCLC es extremadamente deficiente. Dos estudios mostraron que Rnd3 sobre-expresión puede estar asociada con un pronóstico desfavorable en pacientes con NSCLC [27], [28] mientras que el papel preciso de Rnd3 en CPNM aún no ha sido investigado. A continuación, se informó de que Rnd3 es el regulado en H358, H520 y células A549, y esto baja regulación promueve el crecimiento de estas dos líneas celulares y depende de la señalización de Notch hasta reguladas.
Una de las la mayoría de las estrategias importantes para curar el cáncer es la inhibición de la proliferación incontrolada de células tumorales. Sin embargo, la falta de inhibición específica es el principal problema que enfrenta en la clínica. La comprensión del mecanismo de regulación única del ciclo celular en células de cáncer favorecería el descubrimiento de nuevos fármacos y nuevos tratamientos para el cáncer. Rnd3 sobreexpresión en fibroblastos inhibe la entrada en la fase S mediante el bloqueo de la expresión de ciclina D1 en el nivel post-transcripcional [13]. En el mismo estudio, la sobreexpresión de ciclina D1 no rescató la detención del ciclo celular mediada por Rnd3, lo que sugiere que otros jugadores participan regulación del ciclo celular. En las células de cáncer de próstata, la expresión Rnd3 induce las células detenidas en G2 /M en lugar de en G1, como se ve en los fibroblastos, lo que sugiere que Rnd3 tiene la capacidad de regular la progresión del ciclo celular en diferentes fases [29]. Nuestros datos demuestran que la señalización de Notch /Hes1 es crítica en el crecimiento mediado por deficiencia de Rnd3 de H358, H520 y células A549. Este hallazgo amplía la comprensión de la función de Rnd3 en la regulación del ciclo celular de cáncer y también proporciona una diana potencial para el tratamiento de NSCLC.
expresión Rnd3 está correlacionada con la migración de células en el desarrollo y enfermedades. Dos estudios recientes encontraron que Rnd3 regula la migración de las neuronas a través de la señalización de Rho quinasa dependiente de [30], [31]. Mientras tanto, en los cánceres, la baja regulación de Rnd3 está estrechamente asociada con la invasión y la metástasis [10], [23], [32]. El mecanismo potencial también puede ser a través de la señalización de RhoA /Rock1. En este estudio, hemos demostrado que tanto el INET y Rho-quinasa se activan en H358, H520 y A549 células en comparación con HBEC. Reintroducción de Rnd3 inhibe ambas vías de señalización. Sin embargo, la inhibición de señalización Notch sólo se evita la hiper-crecimiento de H358 y H520 células; la inhibición de Rho quinasa no lo hace. Más estudios para investigar la regulación de la tumorigénesis, la migración y la apoptosis de las células tumorales en respuesta a la inhibición de Rho quinasa sería necesaria e interesante.
Notch es un receptor transmembrana conservadas evolutivamente que participan en el desarrollo y enfermedades. Tras la estimulación del ligando, Notch puede ser escindido por γ-secretasa. La parte intracelular (INET) puede trasladar en el núcleo para iniciar la transcripción. La expresión forzada de Notch 1 inhibió el crecimiento de las células A549 en cultivo [2]. Sin embargo, un estudio independiente ha desafiado esta noción [33]. Más recientemente, un mutante de activación Notch 1 se ha encontrado en aproximadamente el 10% de NSCLC, y las mutaciones que confiere un peor pronóstico en pacientes [4]. Esta controversia sugiere, al menos, que: 1) la función de Notch 1 en el CPNM se diversifica en diferentes células cancerosas y etapas diferentes; 2) la expresión de Notch1 se debe considerar mientras que el tratamiento de los pacientes; 3) que necesitamos con urgencia para entender el papel de Notch 1 en el CPNM. En este estudio, nuestros datos indican que la señalización Notch se activa en las células H358 y H520, y esta activación condujeron la proliferación de estas células a través de dos Hes1. Rnd3 pudo reprimir H358, H520 y células A549 antagonizando la proliferación de señalización Notch en forma posterior a la traducción.
Un estudio publicado recientemente destacó que Rnd3 era un mediador aguas abajo de la señalización Notch en los carcinomas de células escamosas (SCC) en la piel epitelios [34]. Estos autores sugirieron que Rnd3 es un objetivo transcripcional de Notch1 activado y Rnd3 agotamiento suprime la señalización de Notch por la mediación de la translocación nuclear de la NICD a través de una interacción con importins. En nuestro estudio, encontramos que la sobreexpresión Rnd3 suprime la señalización de Notch mediante el bloqueo de la degradación INET. Estas discrepancias pueden ser debido a 1) una línea celular diferente se utilizó para el estudio; 2) más probable es que estos dos tipos de regulación coexisten en las células, trabajando como un mecanismo de retroalimentación para controlar con precisión la señalización de Notch.
La expresión de Rnd3 expreso fue regulada con gran precisión en los tejidos tumorales humanos. Rnd3 fue hasta reguladas en el cáncer colorrectal en comparación con el tejido colorrectal humano normal [35]. Mientras que la baja regulación de Rnd3 fue la observación en el tejido del tumor de hígado humano y tejidos de carcinoma de células escamosas de esófago humanos en comparación con los tejidos normales adyacentes, respectivamente [11], [36]. A pesar de la diferente patrón de expresión de Rnd3 fue encontrado en diferentes tumores en humanos, la expresión Rnd3 estaba estrechamente asociada con la proliferación de células tumorales, la migración celular /metástasis y diagnóstico /pronóstico. Teniendo en cuenta el hecho de que Rnd3 se había reducido regulado en las células NSCLC y baja regulación de Rnd3 promovido la proliferación de células NSCLC, sería interesante y necesaria para evaluar la expresión Rnd3 en muestras de tejido de cáncer de pulmón.
En su conjunto , somos el primer grupo de informar que Rnd3 es el regulado en H358, H520 y A549 células, lo que resulta en una hiper-activación de Notch y la señalización de Rho-cinasa. Mecánica, Rnd3 regula la proliferación de H358, H520 y células A549 a través del eje de señalización INET /Hes1.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Expresión de PDK1, un activador de Rho quinasa, se mantiene sin cambios en H358 y células H520 comparado con células HBEC. (SEGUNDO).