Extracto
Varios tipos de metilación de las histonas se han asociado con la progresión del cáncer. Dependiendo del sitio de metilación en las proteínas histonas, sus efectos sobre la transcripción son diferentes. DPY30 es un miembro común de los complejos H3K4 metiltransferasa SET1 /MLL histonas. Sin embargo, su expresión y su papel en el cáncer gástrico han descrito adecuadamente. Para determinar si DPY30 tiene papeles fisiopatológicos en el cáncer gástrico, su expresión y papeles fueron examinados. Inmunohistoquímica y PCR en tiempo real mostró sobre regulación de la expresión DPY30 en algunas líneas celulares de cáncer gástrico y los tejidos de los pacientes. Su caída por siRNA se redujo la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico, mientras que su sobreexpresión mostró los efectos opuestos. Estos resultados indican que DPY30 tiene un papel crítico en la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico, y sugerir DPY30 podría ser una diana terapéutica en el cáncer gástrico
Visto:. Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh So (2015) Roles de DPY30 en la proliferación y motilidad de células de cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (7): e0131863. doi: 10.1371 /journal.pone.0131863
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos |
Recibido: March 3, 2015; Aceptado: June 8, 2015; Publicado: 6 Julio 2015
Copyright: © 2015 Lee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Bio & amp; Programa Médico Tecnología para el Desarrollo (# 2012M3A9C6050213, OSO) y la Fundación de Ciencias Básicas de Investigación (# 2012R1A1A3010521, HME) de la Fundación Nacional de Investigación (NRF), financiado por el gobierno de Corea (MEST), y por una subvención del Plan Nacional de I & amp; D del Programa de control del Cáncer, Ministerio de Sanidad, Bienestar Social y Asuntos de la Familia, República de Corea (# 0920050, OSO). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las modificaciones covalentes de histonas colas, tales como, acetilación, fosforilación, ubiquitinación y metilación, modular la estructura de la cromatina y juega un papel fundamental en la regulación de la progresión del ciclo celular, transcripción de genes, la reparación del ADN, el desarrollo embrionario, y celular diferenciación [1, 2]. Aunque el aumento de la acetilación de histonas se asocia generalmente con la activación transcripcional, la metilación de la histona se correlaciona con la activación transcripcional y la represión. Por ejemplo, la metilación de la histona H3 en la lisina 9, 20, o 27 residuos (H3K9, H3K20 o H3K27) está implicada en el silenciamiento transcripcional de genes, pero, por otro lado, la metilación en H3K4, H3K36, o H3K79 se asocia con la cromatina abierta y activa la transcripción de genes [3].
En los mamíferos, mono-, di- y tri-metilación de H3K4 (H3K4me1, H3K4me2, y H3K4me3) se llevan a cabo por los complejos de la familia /MLL seis distinta SET1 (SET1A, SET1B , mLL1, MLL2, MLL3, y MLL4) [4, 5]. Estos metiltransferasas H3K4 (H3K4MT) contienen diferentes subunidades catalíticas, y las actividades de los seis complejos de la familia son controlados por componentes de la base de múltiples subunidades comunes, que incluyen WDR5, rbbp5, ASH2L, y DPY30, y también se conocen como WRADs. [6-9]. Una pérdida de cualquier subunidad de resultados complejos WRAD en H3K4 metilación reducida. WDR5 y rbbp5 son cruciales para los tres tipos de metilación de H3K4 (H3K4me1, H3K4me2, y H3K4me3), mientras que ASH2L y DPY30 se requieren principalmente para H3K4me3 [6, 8, 10, 11].
DPY30 es una miembro de todos los complejos de MLL SET1 /humanos, y es necesaria para la plena actividad SET1 /MLL metiltransferasa [10, 12]. DPY30 ha sido implicado en el potencial de diferenciación de células madre embrionarias (CES) a lo largo del linaje neuronal [10] y es esencial para la adecuada diferenciación y proliferación de células progenitoras hematopoyéticas [12]. Por otra parte, el agotamiento de DPY30 hace que las células para entrar en un estado de senescencia similar y regular al alza de p16 (CDKN2A) y p15 (CDKN2B), que están directamente involucrados en la senescencia [13].
El cáncer gástrico es uno de los principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo [14]. A pesar de los recientes avances diagnósticos y terapéuticos proporcionan una excelente supervivencia para los pacientes con cáncer gástrico precoz, la enfermedad generalmente se diagnostica en una etapa tardía, cuando el pronóstico es malo [15]. carcinogénesis gástrica implica la acumulación progresiva de diversas alteraciones genéticas y epigenéticas, que conducen al aumento de la función de los oncogenes y la pérdida de la función de los genes supresores de tumores. Además, puesto que la transcripción de genes se basa en gran medida de la estructura de la cromatina, alterada o anormal metilación de las histonas ha sido típicamente asociados con la progresión del tumor y el pronóstico en el cáncer [16], y aunque el estado de metilación de las histonas ha sido bien descrito en muchos tipos de cáncer, este aspecto que no queda claro en el cáncer gástrico [16, 17].
en este estudio, para determinar si DPY30 tiene papeles fisiopatológicos en el cáncer gástrico, su expresión y papeles fueron examinados.
Materiales y Métodos
cultivo de células y transfección siRNA
las líneas celulares de cáncer gástrico, derivado snu1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, y NCI-N87 fueron adquiridos de la línea celular de Corea del Banco (Seúl). La línea de células epiteliales gástricas, HFE145 fueron dotados del profesor Hassan Ashktorab (Universidad de Howard). Las líneas celulares de cáncer gástrico se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
atmósfera de aire 2/95% en RPMI1640 suplementado con HEPES 25 mM, suero bovino fetal al 10% (FBS) (GE Healthcare Life Science, South Logan , UT, EE.UU.) y 100 g /ml de penicilina /estreptomicina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). DMEM (GE Healthcare Life Science) el medio suplementado con 10% de FBS y 100 g /ml de penicilina /estreptomicina se utilizó para HFE145 cultura. Las células fueron transfectadas con pequeños ARN de interferencia (siRNA) o revueltos (SCR) siRNA utilizando DhamaFECT reactivo 1 o 3 (Thermo Scientific, Lafayette, CO, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. secuencias de siRNA fueron los siguientes: DPY30 siRNA duplex (ORF) (Bioneer, Daejeon, Corea del Sur), 5'-CAC UCU CUC GAG UAC GGU A (dTdT) 3 ', 5'-UGA CUC GUA CGG UCU CAC A (dTdT) 3 ', 5'-CUC UCU ACU UAU AGG UAC T (dTdT) 3'; DPY30 siRNA duplex (3'-UTR) (Bioneer); 5'-CCG GAC AAC AGA ACC UAU UUU UGG A (dTdT) 3 ', 5'-GAG ACG GCU AUU UUA GCC agosto AUC A (dTdT) 3'; WDR5 siRNA duplex (Bioneer), 5'-AAG GUC GUG CUU CUC GUC U (dTdT) 3 ', 5'-GUC GUG AUC UCA ACA GCU T (dTdT) 3', 5'-CAG AUU CUA ACC NVND UUG T (dTdT) 3 '; Rbbp5 siRNA duplex (Bioneer), 5'-UGA GUG AAA GGG CUC AGU A (dTdT) 3 ', 5'-CAG AUU CUC AGG AUC UUG T (dTdT) 3', 5'-GUG GUU GAG AUU AGU AGA T (dTdT) 3 '; ASH2L siRNA duplex (Bioneer), 5'-GUA UGA ACG GGU UUU GUU A (dTdT) 3 ', 5'-CUG AGA ACA CCU GAA AUC A (dTdT) 3', 5'-GUC UAC CUU UCA UGA CCA A (dTdT) 3 '; revuelto (SCR) siRNA (Thermo Scientific), 5'-GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) 3 '.
sobreexpresión DPY30
El cDNA fue clonado en DPY30 pLenti6.3 vector -V5 /DEST (vector lentiviral destino) utilizando el
in vivo
sistema de clonación gateway, ubicada en la recombinación (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). El vector donante (pDONR221) que alberga la secuencia de ADNc de DPY30 se adquirió de Ultimate ORF clones (Invitrogen), y recombina con el contra-seleccionable
ccdB
gen de pLenti6.3-V5 /DEST usando mezcla de enzimas clonasa LR (Invitrogen). El pLenti6.3 vector vacío /V5-DEST se utilizó como control simulado. lentivirus recombinantes se producen en 293FT células, y se utilizaron para infectar células SNU216 y SNU638, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ViraPower Lentiviral sistema de expresión; Invitrogen). DPY30 células que sobreexpresan estables fueron establecidos por la selección con blasticidina (7,5 mg /ml) (Invitrogen).
Para los ensayos de rescate, modificamos, siguió un protocolo de "interferencia RNAi utilizando la recogida de precisión Lenti ORF ' (http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/precision-lentiorfs-rnai-rescue-appnote.pdf). Brevemente, las células fueron infectadas con lentivirus recombinante (pLenti6.3-V5 /DEST o construcciones DPY30-over). 24 horas después de la transducción, el medio que contiene virus se eliminaron y se reemplazaron con medio de cultivo completo. El día siguiente, se añadió blasticidin a una concentración de 7,5 g /ml. Las células se mantuvieron bajo selección durante seis días, en sustitución de medio o pases cada 2-3 días según sea necesario. Las poblaciones seleccionadas de células de control o células que expresan DPY30 se utilizaron para experimentos de transfección utilizando DPY30 siRNA dirigidos marco de lectura abierto (ORF) o región 3 'no traducida (UTR).
PCR en tiempo real
Las muestras de tejido se obtuvieron de 23 pacientes coreanos primarios no relacionados con cáncer gástrico que fueron sometidos a resección quirúrgica en Pusan National University hospital y el hospital Yangsan Universidad Nacional de Pusan y el consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por el Consejo Nacional de Pusan-Hospital Universitario de Revisión Institucional (IRB-PNUH) y el Consejo Nacional de Pusan Yangsan Hospital Universitario-Revisión Institucional (IRB-PNUYH). El ARN total de tejidos y las células se extrajeron usando el reactivo Trizol (Invitrogen) o un kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (PCR en tiempo real) se utilizó para verificar los niveles de mRNA DPY30. Los ADNc se sintetizaron con MMLV transcriptasa inversa (Promega, Madison, WI, EE.UU.), cebadores dNTP y oligo-dT. Las secuencias de los cebadores utilizados fueron los siguientes: DPY30, 5'-AAC GCA GGT TGC AGA AAA TCC T -3 'y 5' TCT GAT CCA GGT AGG CAC GAG -3 '; WDR5, 5'-TGT TAC TGG TGG GAA GTG GA -3 y 5'-CTG TTG GGT GAC AAG CTG TT-3 '; Rbbp5, 5'-AGT GCA CAC ATC CAT CCA GT-3 'y 5'-TCA TCG CAG GAA CCT AGA AC-3'; ASH2L, 5'-TAC AAG AGC TGC ACG GTT TC-3 'y 5'-CCA CCG CAT CAT ACT GTC AG-3'; GAPDH, 5'-TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC-3 'y 5'-CTC AGC CCG AGT AAT GGA GG-3'. PCR en tiempo real se realizó con un sistema en tiempo real LightCycler ™ 96 PCR (Roche, Nutley, NJ) y FastStart DNA esencial verde Master (Roche), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. GAPDH se utilizó como control interno.
Inmunohistoquímica
La tinción inmunohistoquímica con anticuerpo de conejo anti-humano policlonal DPY30 (Sigma-Aldrich) se realizó en una matriz de tejido de cáncer gástrico (n = 59) comprado desde SUPER BIO CHIPS (Seúl) o en secciones de 4 micras de muestras incluidas en parafina. En pocas palabras, después de la desparafinación y rehidratación, los portaobjetos se trataron con peróxido de hidrógeno 0,3% durante 30 min para inhibir la actividad de la peroxidasa endógena, y se bloquearon con 10% de suero normal de burro (NDS) y 1% de BSA en 1 × tampón fosfato salino (PBS). Los portaobjetos se incubaron a continuación durante la noche a 4 ° C en tampón de bloqueo que contiene un anticuerpo de conejo anti-humano DPY30 primaria (1:80, Sigma-Aldrich). El anticuerpo secundario (conjugado a HRP) de unión se realizó a una dilución de 1: 200 en tampón de bloqueo durante 2 horas a RT. La detección se realizó con HRP (Vector Laboratories) y se contratiñeron diapositivas tratándolos durante 1 min con tampón de tinción con hematoxilina (Sigma-Aldrich).
proliferación de las células de ensayo
Un día después de la transfección de células con siRNA, el medio se reemplazó con medio FBS 1%, y cuatro días más tarde, se añadieron 10 l de Ez-Cytox (ITSBIO, Seúl) y se incubaron durante 0,5 a 2 horas. Con el fin de comprobar el efecto de la sobreexpresión DPY30 sobre la proliferación celular, las células se sembraron en medio FBS 10%, y después de tres días de cultivo, se añadieron 10 l de Ez-Cytox (ITSBIO) y se incubaron durante 0,5 a 2 horas. viabilidades de células se determinó midiendo la absorbancia a 450 nm utilizando VICTOR3 múltiples lectores (PerkinElmer, MA, EE.UU.).
Boyden cámara de ensayo
A modificado Boyden transwell cámara (Neuro Probe, Gaithersburg, MD, se utilizó EE.UU.). La cámara inferior se llenó con 50 l de RPMI que contiene 10% de FBS. Para examinar los efectos de DPY30 conocido abajo, snu1 y SNU16 (células no adherentes) fueron transfectadas con el ARNsi ORF-orientación. Un día después de la transfección, se lavaron las células, se suspendieron a una densidad de 5 × 10
5 células /ml en 50 l de RPMI suplementado con 0,5% de FBS, y se sembraron en la cámara superior. Para eliminar los efectos de proliferación, se añadió mitomicina C (0,01 g /ml, Sigma-Aldrich). Las células se incubaron entonces durante 24 horas a 37 ° C con 5% de CO2. Se evaluó el número de células migradas contando las células en pocillos de fondo. Para examinar los efectos de la sobreexpresión DPY30, las células estables (células adherentes; SNU216 y SNU638) se utilizaron. Las células (simulacros y DPY30-over) se trataron con tripsina, y se sembraron a una densidad de 1 × 10
5 células /ml. Para eliminar los efectos de la proliferación, se añadió mitomicina C. Las células se dejaron migrar durante cuatro horas, las membranas se fijaron y tiñeron utilizando Diff-Quik solución (Sysmex, Kobe, Japón) y se lavaron con agua destilada. El número de células en 10 campos elegidos al azar se contaron usando un microscopio de luz. Los experimentos se realizaron por triplicado.
Matrigel invasión de ensayo
Las capacidades invasivas de las células cancerosas se evaluó a través de 8 micras porosas insertos de cámara BioCoat Matrigel (BD Bioscience, San Jose, CA, EE.UU.). Un día después de la transfección con SCR o DPY30 siRNA, las células se tripsinizaron, y se suspendió a una densidad de 5 x 10
4 células /ml en 500 l de RPMI suplementado con 0,5% de FBS y mitomicina C (0.01 g /ml, Sigma -Aldrich). Las células fueron entonces añadidos a los insertos de cámara y se colocan en pozos llenos de 0,7 ml de medio suplementado con 10% de FBS como quimioatrayente. Después de la incubación durante 24 o 48 horas, las células no invasoras en la parte superior de la membrana se retiraron por raspado y las células invasoras en la parte inferior de la membrana fueron fijadas y teñidas con solución de Diff-Quik (Sysmex). El número de células en 10 campos elegidos al azar se contaron usando un microscopio de luz. Los experimentos se realizaron por triplicado y al menos 5 campos fueron contados por experimento.
El análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar (DE) de tres experimentos independientes. Los significados de las diferencias se determinaron utilizando de Student
t-test para
observaciones no pareadas.
P
valores de & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
Expresión de DPY30 en tejidos de cáncer gástrico
Para investigar la expresión DPY30 en el cáncer gástrico humano, se realizó inmunohistoquímica utilizando una matriz de tejido de cáncer gástrico o de archivo incluido en parafina cortes de tejido. En los tejidos gástricos normales, la expresión DPY30 era difícil de detectar (Fig 1A), pero en tejidos de cáncer de DPY30 proteína se sobreexpresa ampliamente (Fig 1B-1D). En particular, DPY30 se sobreexpresa en la invasión de células de cáncer gástrico (Fig 1B-1D). Por otra parte, a fin de determinar los niveles de mRNA de DPY30 en una línea inmortalizada de células epiteliales normales gástrica (HFE145) y seis líneas de cáncer gástrico-derivados de células (snu1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 y NCI-N87) usando PCR en tiempo real. El nivel de ARNm de DPY30 fue considerablemente mayor (cambio & gt veces; 5) en snu1 y SNU16 que en HFE145 células, mientras que el nivel de expresión de DPY30 en SNU216, SNU620 y SNU638 fue similar a las de HFE145 células y fue menor (doble cambio & gt ; 10) en la NCI-N87 (figura 1E). También se verificaron los niveles de mRNA de DPY30 en tejidos de cáncer gástrico. DPY30 fue altamente expresado en 15 casos (15/23, 65%) en comparación con los tejidos normales (Fig 1F). Estos resultados indican que DPY30 es altamente expresado en algunos tipos de cáncer gástrico humano.
(A-D) La tinción inmunohistoquímica demostró la sobreexpresión de DPY30 en tejidos de cáncer gástrico. Cabe destacar que su sobreexpresión era obviamente mayor en la invasión de células cancerosas (B-D) que en la mucosa gástrica normal (A). (E) El nivel de ARNm de DPY30 en células de cáncer gástrico (snu1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 y NCI-N87) y normal de las células epiteliales gástricas (HFE145) se determinó mediante PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos para DPY30. GAPDH se utilizó para normalizar los datos. Los valores mostrados son la media ± DE de los tres experimentos independientes realizados por triplicado. *,
p Hotel & lt; 0,01 (
t de Student
, frente HFE145). (F) La expresión de DPY30 en tejidos de cáncer gástrico fue examinado por PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos para DPY30. GAPDH se utilizó para normalizar los datos. Los valores son la media ± DE de tres experimentos independientes realizados por triplicado. *,
p Hotel & lt; 0,01; **,
p Hotel & lt; 0,05 (
t de Student
, en comparación con lo normal).
Roles de DPY30 en la proliferación de células de cáncer gástrico
Con el fin de determinar las posibles funciones de DPY30 en células de cáncer gástrico, primero derribado DPY30 utilizando el ORF-focalización DPY30 siRNA y monitoreados su eficiencia caída por PCR en tiempo real (figura 2A). El ORF de metas de DPY30 siRNA (100 nM) disminuyó el nivel de mRNA de DPY30 en HFE145, snu1, SNU16, SNU216, y SNU638 células en comparación con siRNA revueltos (SCR) por 78%, 89%, 79%, 76%, y 88%, respectivamente. Cinco días después de la transfección de las células con el SCR o siRNA ORF de metas, se realizaron ensayos de proliferación. Desmontables de DPY30 inhibe las proliferaciones de HFE145, snu1 y SNU16 en comparación con SCR en un 31%, 69% y 71% respectivamente, mientras que la caída no afectó a las proliferaciones de SNU216 y SNU638 (Fig 2B), en la que el nivel de expresión de DPY30 fue baja (figura 1E). A continuación, hemos producido líneas celulares que sobreexpresan DPY30 (DPY30-over) utilizando HFE145, SNU216 y SNU638 células, y luego compararon los niveles de mRNA en células DPY30 falsos (control) y células DPY30-over. En tiempo real PCR resultados mostraron que el nivel de expresión de DPY30 fue de 4,2, 3,5 y 3,2 veces mayor en DPY30 sobreexpresan HFE145, SNU216 y SNU638 células que las células simuladas, respectivamente (Figura 2A). DPY30 sobreexpresión mejorado las proliferaciones de HFE145, SNU216 y SNU638 células frente a las células simuladas por 1,9, 2,2 y 1,6 veces, respectivamente (Figura 2B).
(A) PCR en tiempo real se utilizó para determinar la eficiencia de la precipitación o sobreexpresión de DPY30 en HFE145, snu1, SNU16, SNU216 y SNU638 células. eficiencia desmontables se determina después de la transfección de células con 100 nM DPY30 siRNA dirigidos a la ORF o siRNA revueltos (SCR). eficiencias de sobreexpresión se determinaron en células que sobreexpresan DPY30 y simulacros. (B) Efecto de DPY30 knockdown o sobreexpresión sobre la proliferación celular. Un ensayo de viabilidad celular se utilizó para medir la proliferación celular en presencia de 1% de FBS. Para los experimentos DPY30 desmontables, ensayos de viabilidad celular se realizaron cinco días después de la transfección de 100 nM DPY30 siRNA o SCR. Después de tres días de cultivo, los ensayos de viabilidad celular se realizaron en DPY30-over y células simuladas. (C) Análisis de la expresión de DPY30 después conocida abajo o sobreexpresión de siRNAs o DPY30 ORF respectivamente. La ORF-focalización o el ARNsi 3'-UTR de metas se utilizó para el knock-down. (D) exógena DPY30-ORF rescató a la inhibición de la proliferación por la 3'-UTR de metas de DPY30 siRNA. simulacros de células o DPY30 sobreexpresan fueron transducidas con dos tipos de DPY30 siRNA (-UTR 3 'de metas u ORF-targeting), se examinó a continuación, ensayo de viabilidad celular. Los valores son la media ± DE de tres experimentos independientes realizados por triplicado. *,
p Hotel & lt; 0,01 (
t de Student
, frente SCR o Mock).
Para confirmar la especificidad de DPY30 siRNA, hemos realizado los experimentos de rescate. Para los experimentos de rescate, se utilizó una DPY30 siRNA dirigidos 3'-UTR en lugar de ORF porque el siRNA ORF de segmentación también puede degradar la DPY30 exógena de ADN ORF introdujimos. Para sobreexpresan DPY30, transduced snu1 y SNU16 con partículas virales, pLenti6.3-V5 /DEST (control) o construcciones DPY30-ORF-over. Snu1 o SNU16 células que sobreexpresan DPY30 mostraron una mayor expresión de DPY30 2,1 o 2,5 veces mayor que las células simuladas, respectivamente (Fig 2C). El siRNA ORF-focalización condujo a la baja regulación de los niveles de expresión DPY30 en más de un 75% en el simulacro, así como células que sobreexpresan DPY30. El 3'-UTR-siRNA dirigidos a las reguladas por la expresión DPY30 superior al 85% en las células simuladas, mientras que, en las células que sobreexpresan DPY30, disminuyó la expresión DPY30 a un nivel similar al de las células transfectadas con siRNA SCR ( Fig 2C). Este resultado indica que el ADN exógeno DPY30-ORF es resistente a la 3'-UTR de metas de siRNA y se expresa en un nivel similar a la de mRNA DPY30 endógeno. La ORF-siRNA dirigidos a inhibir la proliferación de células independientemente de la expresión DPY30 exógeno (figura 2D). Proliferación también se inhibió por el siRNA 3'UTR-focalización en las células simuladas, sin embargo, fue parcialmente inhibida en las células que sobreexpresan DPY30. En las células DPY30 sobreexpresan, el siRNA ORF de metas de disminución de la proliferación de snu1 y SNU16 en comparación con SCR siRNA por 74% y 66%, respectivamente, sin embargo, el siRNA 3'-UTR de metas disminuyó en un 20% y 8%, respectivamente . Este resultado indica que DPY30 exógeno rescata la inhibición de la proliferación inducida por el siRNA 3'-UTR de metas, y los fenotipos causados por DPY30 siRNA no sean a efectos fuera de la meta.
Debido a DPY30 es un componente de las salas , se examinaron las expresiones y funciones de los otros componentes de las salas. PCR en tiempo real mostró que los niveles de mRNA de WDR5 y rbbp5 en snu1, SNU16, SNU216 y SNU638 fueron similares a los de HFE145. Sin embargo, el nivel de ARNm de ASH2L fueron significativamente mayores (cambio & gt; 3) en snu1 y SNU16 que en HFE145 células (Figura 3A) como DPY30 en la figura 1E. Con el fin de investigar si los componentes WRAD están asociados con la proliferación de células de cáncer gástrico, que knockdowned cada componente WRAD utilizando su siRNA específico y monitoreados eficiencias desmontables por PCR en tiempo real (Fig 3B). Cada siRNA (100 nM) disminuyó los niveles de mRNA en células snu1 y SNU16 en comparación con SCR en un 65% -75%. Desmontables de WDR5 y rbbp5 inhibe la proliferación de células snu1 y SNU16 en comparación con SCR por 30 a 48% (figura 3C). Sin embargo, ASH2L inhibe la proliferación de snu1 y SNU16, en el que el nivel de expresión de ASH2L era alta, en comparación con SCR por 85% y 75%, respectivamente
.
(A) Los niveles de mRNA de WDR5, rbbp5 y ASH2L en HFE145, snu1, SNU16, SNU216 y SNU638 células se determinó por PCR en tiempo real, utilizando cebadores específicos para WDR5, rbbp5 y ASH2L. GAPDH se utilizó para normalizar los datos. eficiencia (B) Derribo fue determinada por PCR en tiempo real. eficiencia desmontables se determina después de la transfección de las células con 100 nM WDR5, rbbp5 y ASH2L siRNA o revueltos (SCR). (C) Efectos de WDR5, rbbp5 y ASH2L caída en la proliferación celular. Un ensayo de viabilidad celular se utilizó para medir la proliferación celular en presencia de 1% de FBS. 24 horas después de la transducción, se realizaron ensayos de viabilidad celular. Los valores son la media ± DE de tres experimentos independientes realizados por triplicado. *,
p Hotel & lt; 0.01 (de Student
t
de prueba, frente HFE145 (A) o SCR (BC)).
Roles de DPY30 en la migración y la invasión de células de cáncer gástrico
a continuación examinó si DPY30 regula la migración de células de cáncer gástrico. Desmontables de DPY30 disminuyó las migraciones inducidas por el FBS de células snu1 y SNU16 frente a SCR por 35% y 45%, respectivamente (Fig 4). Por el contrario, la sobreexpresión DPY30 aumentó las migraciones inducidas por el FBS de SNU216 y SNU638 células frente a las células simuladas por 2,5 y 2,2 veces, respectivamente (Fig 4). Estos resultados nos llevaron a examinar el papel de DPY30 en la invasión de células de cáncer gástrico. En un ensayo de invasión de Matrigel, DPY30 siRNA inhibe la invasión inducida por FBS de células snu1 y SNU16 frente a SCR siRNA por 65% y 84%, respectivamente (Fig 5A y 5C). Además, la sobreexpresión DPY30 aumentó las invasiones inducidas-FBS de células SNU216 y SNU638 frente a las células simuladas por 3,2 y 2,9 veces, respectivamente (Fig 5B y 5C). Estos resultados muestran que DPY30 promueve la migración y la invasión de células de cáncer gástrico.
ensayo se utilizó (A) A Boyden cámara para medir la migración de células de cáncer gástrico. 10% de FBS se utilizó para inducir la migración, y se añadió mitomicina C (0,01 g /ml) para eliminar los efectos de la proliferación. Dos días después de la transfección con 100 nM ORF-focalización DPY30 siRNA o revueltos (SCR) siRNA, se realizaron ensayos de migración (ensayo de cámara de Boyden). ensayos de migración se realizaron en DPY30-over y células simuladas después de cultivo durante un día. Bar = 100 micras. Se contaron las células (B) migrados y los resultados se presentan como un gráfico de barras. Los valores son la media ± DE de tres experimentos independientes realizados por triplicado. *,
p Hotel & lt; 0,01 (
t de Student
, frente SCR o Mock).
(A-B) Se utilizó un ensayo de invasión de Matrigel para medir la invasión de células de cáncer gástrico. Los resultados presentados son representativos de los resultados obtenidos. 10% de FBS se utilizó para inducir la invasión, y se añadió mitomicina C (0,01 g /ml) para eliminar los efectos de la proliferación. Invasión ensayos se llevaron a cabo dos días después de la transfección con 100 nM ORF-focalización DPY30 o SCR siRNA. Después de cultivo durante un día, ensayo de invasión se llevó a cabo para la DPY30-over y células simuladas. Bar = 100 micras. (C) se contaron las células invasoras y los resultados se muestran como un gráfico de barras. Los valores son la media ± DE de tres experimentos independientes realizados por triplicado. *,
p Hotel & lt; 0,01 (
t de Student
, frente SCR o Mock).
Discusión
Roles de DPY30 en la biología del cáncer han descrito adecuadamente aunque sus papeles en la diferenciación de las CES y las células progenitoras hematopoyéticas se había informado [10, 12]. En el presente estudio, mostramos nuevos papeles de DPY30 en el cáncer gástrico. DPY30 se amplifica (datos no presentados) y altamente expresado (Fig 1) en algunos tejidos de cáncer gástrico. Además, su caída o sobreexpresión regulan la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico. Las alteraciones en la expresión, translocaciones cromosómicas y mutaciones somáticas de los genes que codifican las subunidades de los complejos de MLL SET1 /se han reportado en muchos tipos de cáncer. Estos resultados apoyan el papel fundamental de los miembros de SET1 complejo /MLL en la progresión del cáncer.
se observó Sobre regulación de la expresión DPY30 sólo en células de cáncer gástrico y snu1 SNU16 entre seis células de cáncer gástrico que hemos examinado. Sin embargo se observó su regulación en más de la mitad de los tejidos con cáncer gástrico que hemos examinado (Figura 1). Es difícil de explicar esta discrepancia. Sin embargo, es obvio que el número de los tejidos de cáncer gástrico hemos examinado no es suficiente. Por lo tanto, se requiere un amplio estudio expresión usando mucho más número de tejidos para evaluar el valor clínico en el futuro.
Roles de SET1 /complejo metiltransferasa MLL H3K4 en la biología del cáncer es complejo. subunidades reguladoras de complejos MLL SET1 /WRAD, entre ellos, contienen dos oncoproteínas potentes y supresores de tumor. Por ejemplo, el gen MEN1 codifica menin, una subunidad integral de mLL1 y MLL2, y está mutado en pacientes con neoplasia endocrina múltiple tipo 1 (MEN1) [18, 19]. Por otra parte, la menina regula p18 (CDKN2C) y p27 (CDKN1B) mediante la contratación de mLL1 complejo [20]. Por el contrario, WDR5, un componente del complejo WRAD, se ha informado de actuar como una oncoproteína en el cáncer de próstata, en el que se sobreexpresa y crucial para la proliferación inducida por andrógenos de las células tumorales [21]. ASH2L, que es otro componente del complejo WRAD y puede interactuar con el oncoproteína MYC [22], es crucial para la transformación MYC /Ha-RAS-dependiente de fibroblastos de embrión de rata. Por otra parte, se sobreexpresa en muchos tipos de tumores y es crítica para la proliferación de células tumorales [23]. En el presente estudio, mostramos papeles de DPY30 como una oncoproteína en el cáncer gástrico.
¿Cuáles son los mecanismos moleculares que subyacen a las funciones de DPY30 en el cáncer gástrico? A pesar de que no reveló, varias hipótesis se pueden proponer en base a estudios anteriores. Una de las posibles hipótesis es que DPY30 sobreexpresión conduce a las sobreexpresiones de oncogenes a través de una mayor actividad H3K4MT. El agotamiento de DPY30 o ASH2L conduce a una disminución en H3K4me3, mientras WDR5 y rbbp5 son cruciales para los tres tipos de H3K4 (H3K4me1, H3K4me2, y H3K4me3) [6, 8, 10, 11]. Además, la sobreexpresión de DPY30 solo puede aumentar la actividad H3K4MT [10]. Desde H3K4me2 /3 es una marca activa para la transcripción [3, 24], el aumento H3K4MT puede regular al alza directamente muchos genes, tales como, oncogenes, o, alternativamente, indirectamente abajo-regular supresores de tumores. Un informe anterior apoyo a esta hipótesis es que ASH2L, un componente crítico del complejo SET1 /MLL, se ha demostrado que desempeñan como una oncoproteína [25, 26]. Otro informe anterior es que DPY30 activa directamente la expresión de proteínas de identificación a través de H3K4 metilación [13, 27]. ID de proteínas inhiben las actividades de ETS1 y ETS2 que pueden inducir una de gen supresor de tumor, p16. En el presente estudio, hemos demostrado que los componentes de WRAD (WDR5, rbbp5 y ASH2L) pueden inhibir la proliferación de células de cáncer gástrico (Figura 3), lo que sugiere que actúan DPY30 a través del aumento de la actividad H3K4MT. Se requieren más estudios para revelar los mecanismos que subyacen a las funciones de DPY30 en células de cáncer gástrico.