células
Extracto
tetraploide (4N) se consideran importantes en el cáncer, ya que pueden mostrar una mayor tumorigenicidad, resistencia a las terapias convencionales, y se cree que son los precursores de toda la aneuploidía del cromosoma. Por tanto, es importante determinar cómo las células cancerosas surgen tetraploide, y la forma de dirigirse a ellos. P53 es una proteína supresora de tumores y regulador clave de la tetraploidia. Como parte de la "punto de control tetraploidia", p53 inhibe la proliferación de células tetraploides mediante la promoción de un G1-detención en las células tetraploides incipientes (referido como una detención en G1 tetraploide). Nutlin-3a es una droga preclínica que estabiliza p53 mediante el bloqueo de la interacción entre p53 y MDM2. En el estudio actual, Nutlin-3a promovió una detención en G1 tetraploide dependiente de p53 en dos clones diploides de la línea celular de cáncer de colon HCT116. Ambos clones fueron sometidos a endorreduplicación después de la eliminación Nutlin, dando lugar a clones tetraploides estables que mostraron aumento de la resistencia a la radiación (IR) y cisplatino (CP) de la apoptosis inducida por ionizante en comparación con sus precursores diploides. Estos hallazgos demuestran que la activación de p53 transitoria por Nutlin puede promover la formación de células tetraploides a partir de precursores diploides, y las células tetraploides resultantes son la terapia (IR /CP) resistente. Es importante destacar que los clones tetraploides seleccionados después del tratamiento Nutlin expresan aproximadamente dos veces más
P53
y
MDM2
mRNA como precursores diploides, expresaron aproximadamente el doble que los complejos de proteínas p53-MDM2 (por co-inmunoprecipitación) , y eran más susceptibles a la apoptosis de detención y el crecimiento dependiente de p53 inducida por Nutlin. Sobre la base de estos resultados, proponemos que p53 juega un papel novedosos tanto en la formación y la orientación de las células tetraploides. En concreto, se propone que 1) transitoria activación de p53 puede promover un paro tetraploide-G1 y, como resultado, puede promover inadvertidamente formación de células tetraploides resistentes a la terapia, y 2) las células tetraploides resistentes a la terapia, en virtud de tener mayor
p53
número de copias de genes y la expresión de dos veces más complejos p53-MDM2, son más sensibles a la apoptosis y /o la detención del crecimiento por los antagonistas de MDM2 anti-cáncer (por ejemplo nutlin) guía
Visto:. Davaadelger B, Shen H, Maki CG (2014) Roles novedosos para P53 en el Génesis y la orientación de las células del cáncer tetraploide. PLoS ONE 9 (11): e110844. doi: 10.1371 /journal.pone.0110844
Editor: Andrei L. Gartel, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Junio, 2014; Aceptado: September 24, 2014; Publicado: 7 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Davaadelger et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención 1RO1CA137598-01A1 del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) (a C.G.M.). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Autor Carl Maki es miembro del consejo editorial de la revista PLoS One. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales.
Introducción
células tetraploides contiene el doble de la cantidad normal de ADN y son poco comunes en la mayoría de los tejidos normales. Sin embargo, las células tetraploides son relativamente comunes en el cáncer y se cree que contribuyen al desarrollo de tumores, aneuploidía, y resistencia a la terapia [1]. La evidencia directa para el potencial tumorigénico de las células tetraploides fue proporcionado por Fujiwara et al. [2], que aisló las células epiteliales mamarias tetraploides binucleadas de ratones p53 nulo. Sorprendentemente, estas células eran más susceptibles de transformación inducida por carcinógeno a (crecimiento en agar blando) que sus homólogos diploides, y las células tetraploides tumores formados en ratones desnudos mientras que las células diploides no lo hicieron. Otros estudios han relacionado tetraploidia a la radiación y la resistencia a la quimioterapia. Por ejemplo, Castedo et al. [3], [4] aislado clones tetraploides y diploides a partir de dos líneas celulares de cáncer humano con p53 de tipo salvaje. Es importante destacar que, clones tetraploides fueron resistentes a la radiación y varios agentes de quimioterapia en comparación con homólogos de diploides. Finalmente, existe evidencia creciente de que las células cancerosas aneuploides se generan a partir ya sea división asimétrica o pérdida cromosómica progresiva a partir de precursores tetraploides. La evidencia preliminar para este vino de estudios en el esófago de Barrett premaligna. En estos estudios, la aparición de células tetraploides correlacionados con la pérdida de p53 y precedió aneuploidía bruto y la carcinogénesis [5], [6]. En resumen, las células tetraploides pueden tener mayor potencial tumorigénico, sean terapia y resistente a la radiación, y ser precursores de aneuploidía cáncer. Por tanto, es importante identificar cómo las células tetraploides surgen y cómo pueden ser objeto de tratamiento contra el cáncer.
P53 es un gen supresor tumoral y un regulador importante de la tetraploidia [7]. p53 se mantiene en niveles bajos por MDM2, un E3-ligasa que se une p53 y promueve su degradación [8], [9]. daño en el ADN y otras tensiones interrumpen la unión de p53-MDM2, haciendo que los niveles de p53 para aumentar. El aumento de p53 detiene la proliferación mediante la inducción de la expresión de genes que promueven G1-detención (
P21
) o apoptosis (
PUMA, NOXA, BAX
) [10]. La evidencia de que las funciones de p53 en un "puesto de control tetraploidia" viene en gran parte de los estudios que utilizan inhibidores de los microtúbulos (MTI) que las células en metafase bloque. Las células detenidas en la metafase de exposición prolongada MTI eventualmente puede salir de la mitosis y entrar en un estado de pseudo-G1, conocido como G1 tetraploide [11], [12]. Endorreduplicación se refiere al caso en el que estas células tetraploides entran en la fase S y se replican su ADN, dando lugar a células de alta ploidía con el aumento de duplicaciones del genoma (8N, 16N, 32N, etc). Las células que carecen de p53 /p21 son más propensos a endorreduplicación inducida por MTI que las células de tipo salvaje [11] - [14]. Esto apoya un puesto de control dependiente de p53-p21 tetraploidia que la entrada bloques de la fase S por 4N células.
tetraploide G1-detención se caracteriza típicamente por el agotamiento de las proteínas G2 /M (por ejemplo, ciclinas A /B, CDC2) y el aumento la expresión de proteínas de arresto G1 (por ejemplo, P53, p21) en las células 4N [15] - [19]. Agentes que dañan el ADN por ejemplo, la radiación ionizante (IR) activar las células p53 y la detención en G1 y G2 fases. Dos informes tempranos encontraron IR causado p53 y p21 dependiente de agotamiento de Cdc2, ciclina A y ciclina B ARNm y proteínas [20], [21]. En un caso, el agotamiento de estos G2 /M marcadores coincidió con Endorreduplicación 1-6 días después del tratamiento [21]. Estos resultados sugirieron que la activación de p53-p21 en las células tratadas con IR podría promover una detención en G1 tetraploide seguido posteriormente por endorreduplicación. Nutlin-3a (nutlin) es un fármaco preclínica que estabiliza p53 mediante el bloqueo de la unión de p53-MDM2. Hemos informado de que Nutlin podría promover una detención en G1 tetraploide en múltiples líneas celulares de p53 de tipo salvaje, caracterizado por el agotamiento de las proteínas G2 /M y una mayor expresión de p53 y p21 en células 4N [18], [19]. Tras la eliminación Nutlin, p53 y p21 se redujeron y, en algunos casos, las células se sometieron a endorreduplicación [18]. Se requiere p53 y p21, tanto para la detención en G1 y tetraploide para endorreduplicación después de la eliminación Nutlin. Es importante destacar que, clones tetraploides estables podrían ser aislados a partir de células tratadas Nutlin, y estos clones tetraploides fueron resistentes a la IR y cisplatino (CP) de la apoptosis inducida por [19]. Estos estudios sugieren p53-p21 activada por Nutlin puede promover un tetraploide G1-detención y, cuando los niveles de p53 disminución (eliminación Nutlin) las células puede replicar su DNA (endorreduplicación) y dar lugar a células tetraploides que son IR y CP-resistente. Sin embargo, una advertencia de estos estudios previos es que se realizaron en líneas celulares de cáncer, que pueden incluir una mezcla de células diploides y tetraploides, algunos de los cuales pueden ser inherentemente IR /CP-resistente. Es posible que habíamos aislado clones tetraploides IR /CP-resistentes que ya estaban presentes en la población, o que los clones tetraploides que aislamos se obtuvieron a partir de células diploides que ya estaban IR /CP-resistentes. Por lo tanto, no estaba claro si la activación de p53 transitoria por Nutlin podría convertir células diploides en las células tetraploides y, en caso afirmativo, si los clones tetraploides resultantes mostrar una mayor resistencia a la apoptosis inducida por el tratamiento. El presente estudio se inició para abordar estas cuestiones, y para poner a prueba la posibilidad de que las células cancerosas tetraploides pueden ser especialmente sensibles a los antagonistas de MDM2.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y condiciones de cultivo
p53 de tipo salvaje y las células HCT116 p53 nulo (que se describen en [11] se obtuvieron del Dr. Bert Vogelstein (Universidad de John Hopkins). D3 y D8 se han descrito [22] y son clones diploides que fueron aisladas de p53 células HCT116 de tipo salvaje por dilución limitante. Las células se cultivaron en medio 5A de McCoy con 10% de suero bovino fetal (FBS), penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml). Las células se sembraron 24 horas antes de ser tratado con Nutlin-3 (10 mmol /L; Sigma), la irradiación (10 Gy), cisplatino (Laboratorio Bedford), o como se indica
Immunoblotting
extractos de células enteras se prepararon mediante la resuspensión. sedimentos de células en tampón de lisis (NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 0,5% Nonidet P-40, 50 mM Tris, pH 7,5), resuelto por SDS-PAGE, y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (NEN Life Science Products). Los anticuerpos frente a p21 (H-164), ciclina A (H-432), geminina (FL-309), Cdk2 (M2) y p53 (AB-6) eran de Santa Cruz Biotechnology; anticuerpos contra la ciclina B1 (V152), CDC2 (POH1), y Tyr-15 fosfo-CDC2 eran de Señalización Celular; anticuerpos para MDM2 (2A10) eran de Calbiochem. El anticuerpo para ciclina E (HE-2) fue de BD Pharmingen. Los anticuerpos primarios se detectaron con anticuerpo de cabra anti-ratón (Pierce) o de cabra anti-conejo (Life Technologies) anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante, usando quimioluminiscencia Claridad (Bio-Rad).
Flujo Análisis de citometría de células vivas y Ordenación
Para el análisis del ciclo celular, las células fueron cosechadas y se fijaron en etanol al 25% durante la noche. Las células fueron teñidas con yoduro de propidio (25 mg /ml; Calbiochem). Citometría de flujo El análisis se realizó en Gallios citómetro de flujo (Beckman Coulter) y se analizaron con CellQuest (Becton Dickinson) y FlowJo 8,7 (TreeStar, Inc). Para cada muestra, se recogieron 10.000 acontecimientos. Para la clasificación de células en vivo, las células se incubaron con Hoechst 33342 (2 mol /litro; Invitrogen) durante 90 min a 37 ° C y después se recogieron. clasificación de células se llevó a cabo basado en el contenido de ADN utilizando un citómetro MoFlo equipado con un láser de excitación UV. Las células clasificadas se cultivaron en placas a baja densidad.
análisis de ARNm
Cuantitativo PCR en tiempo real (QRT-PCR) se realizó para medir los niveles de mRNA de la ciclina A2, la ciclina B1, CDC2, P21, Bax, Noxa, PUMA, P53R2, actina en las células que no fueron tratados o tratados con Nutlin, cisplatino, o del IR como se indica. El tiempo real de reacción PCR cuantitativa se realizó en un Sistema 7300 PCR en tiempo real (Applied Biosystems, Foster, CA) usando PCR SybrGreen mezcla maestra, (Applied Biosystems, Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Termociclado se realizó en un volumen final de 20 l que contenía 2 l de cDNA y 400 nmol /L de cebadores (primers se enumeran en la Tabla S1). Todas las muestras se amplificaron por triplicado usando el esquema siguiente ciclo: 95 ° C durante 2 minutos, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 55 ° C durante 60 segundos. Se midió la fluorescencia en cada ciclo y los niveles de ARNm se normalizaron con los valores de actina en todas las muestras. Se obtuvo un único pico para los objetivos, apoyando la especificidad de la reacción.
propagaciones de metafases
celulares se incubaron con Colcemid (50 ng /l) (Sigma-Aldrich) durante una hora a 37 ° C, se recogieron y se lavaron con PBS y solución hipotónica (2 partes de 0,075 M KCl y 1 parte de 0,7% citrato sódico). Las células se fijaron en fijador (3 parte de metanol y ácido acético 1 parte) y se extienden sobre un portaobjetos. Los diferenciales se examinan bajo un microscopio de contraste de fase.
Análisis Fish &
Las células se recogieron y se lavaron con PBS. A continuación, se incubaron con solución hipotónica (2 partes de 0,075 M KCl y 1 parte de 0,7% de citrato sódico) por 20 minutos a 37 ° C. Las células se fijaron en fijador (3 parte de metanol y 1 parte de ácido acético). Las diapositivas se prepararon y se envejeció a 55 ° C durante 3 minutos en un thermobrite. Los portaobjetos se incubaron con 0,05% de pepsina (Fisher#P53-100) durante 16 min a 37 ° C y después se lavaron con PBS y se deshidrataron en 70%, 85% y 100% de etanol durante 1 minuto cada uno a temperatura ambiente. A continuación se añadió la sonda Vysis LSI TP53 SpectrumOrange /CEP 17 SpectrumGreen (Abbott Molecular Inc#01N17-020) hibridar a 73 ° C durante 5 min y 37 grados durante 18 horas. A continuación, los portaobjetos se lavaron con tampón de SSC (Gibco#15557-044) con 0,5% NP-40 (Fisher#P53-100) durante 2 minutos a 73 ° C y de contraste con DAPI II (Abbott Molecular Inc#30-804818). Los portaobjetos se examina bajo el microscopio fluorescente.
Ensayo clonogénico.
Las células se sembraron 24 horas antes de ser tratadas o tratadas con CP, IR, o Nutlin en diluciones adecuadas para formar 50-100 colonias. Después de 2-3 semanas colonias se fijaron con formaldehído y se tiñeron con 0,05% de cristal violeta. Las colonias se contaron y se normalizó con la eficiencia de plaqueo de las células no tratadas.
Resultados
Nutlin promueve un arresto G1-tetraploide en las células diploides
Hemos querido preguntar si p53 transitoria activación por Nutlin podría promover la formación de células tetraploides a partir de precursores diploides y, en caso afirmativo, si las células tetraploides resultantes se habrían incrementado la resistencia a la apoptosis inducida por el tratamiento. HCT116 es una línea celular de cáncer de colon humano que expresa p53 de tipo salvaje. En nuestro estudio anterior, HCT116 se sembraron a una densidad de células individuales y se aislaron diez clones diploides individuales (clones designado D1-D10), que variaban en su sensibilidad relativa a cisplatino (CP) inducida por la apoptosis [22]. Elegimos clones diploides D3 y D8 para el estudio actual, porque estos clones mostraron una sensibilidad relativamente alta de CP en nuestro estudio anterior. D3 y D8 tratados con Nutlin durante 24 horas acumuladas con 2N y 4N contenido de ADN (Figura 1A). Inmunotransferencias mostraron que el tratamiento Nutlin en ambos clones causó completa o casi completa de agotamiento de ciclina A, ciclina B1, y Tyr-15 CDC2 fosforilada (pCDC2), y el agotamiento parcial de la proteína total de CDC2 (Figura 1B). Ciclina A, ciclina B1, y mRNA CDC2 también se agotaron en las células Nutlin tratados, lo que sugiere la disminución del nivel de estos G2 /proteínas M pueden resultar de la transcripción disminución (Fig 1C). En contraste, los niveles de p53 y la proteína p21 se incrementaron notablemente por el tratamiento Nutlin (Fig 1B). Nuestros estudios anteriores mostraron p53 y p21 se incrementaron tanto en el 2N y células detenidas-Nutlin 4N [18]. Por lo tanto, Nutlin causa el agotamiento de las proteínas G2 /M y aumento de la expresión de las proteínas G1-detención (p53, p21) en las células detenidas 4N, indicativo de una detención en G1 tetraploide. Es importante destacar que, Nutlin no tuvo efecto sobre la ciclina A, ciclina B1, pCDC2, y los niveles totales de CDC2 en las células HCT116 p53 null (Figura 1B), y no causó un 2 N y detención 4 N en estas células (Fig 1A), lo que demuestra el tetraploide G1 detención inducida por Nutlin es dependiente de p53. Se controlaron además niveles de geminin, un inhibidor de la replicación del ADN que está ausente en G1 y se acumula en S, G2, y M-fase [23]. Geminin se agotó por Nutlin en las células D3 y D8, en consonancia con las células de ser (figura 1B) G1-detenido. Cdk2 niveles se mantuvieron sin cambios por Nutlin, mientras que se incrementaron los niveles de proteínas ciclinas fase G1 ciclina D1 y ciclina E, también en consonancia con las células están detenidas en la fase G1. En suma, los resultados demuestran que Nutlin causa un tetraploide-G1 detención dependiente de p53 en los clones diploides HCT116 D3 y D8.
A) HCT116 clones diploides D3 y D8, y HCT116 que expresan p53 de tipo salvaje (p53 + /+) o son p53-null (p53 - /-) fueron tratados o tratados con Nutlin (NUT 10 M) durante 24 horas, y el perfil de ciclo celular determinada por citometría de flujo. B) Expresión de las proteínas indicadas se monitorizó mediante inmunotransferencia en células no tratadas o tratadas con Nutlin (NUT 10 M) durante 24 hrs. los niveles C) de mRNA de los factores indicados en las células no tratadas o células tratadas con Nutlin (NUT 10 mM) durante 24 horas se determinó mediante qRT-PCR.
tratamiento transitoria Nutlin promueve la formación de terapia clones resistentes tetrapolid a partir de células precursoras diploides
anteriormente mostró 4N células detenidas pueden reiniciar la síntesis de ADN después de la eliminación Nutlin y replicar su ADN sin una división mitótica intervenir, un proceso conocido como endorreduplicación [18], [19]. Para preguntar si D3 y D8 se someten a endorreduplicación después de la eliminación Nutlin, las células se trataron Nutlin durante 24 horas, seguido de eliminación Nutlin para varios puntos de tiempo. La citometría de flujo se utilizó para monitorear los perfiles del ciclo celular y inmunotransferencias utilizados para controlar los niveles de proteína después de la eliminación Nutlin (Fig 2). D3 y D8 acumulan con contenido de ADN 2N y 4N cuando Nutlin tratados durante 24 horas, como en la figura 1. Los dos clones fueron sometidos a endorreduplicación después de la eliminación Nutlin, evidenciado por la aparición pronunciada de & gt; células 4N 16 horas después de la eliminación Nutlin y su acumulación transitoria en un pico 8N. La aparición de & gt; células 4N y su acumulación en un pico 8N es indicativo de células 4N que inician la síntesis de ADN, la replicación de su ADN, y entrar en mitosis. Ciclina A2, ciclina B1, y los niveles volvieron CDC2 16 horas después de la eliminación Nutlin, en consonancia con las células son en su mayoría en G2 /M en este punto de tiempo. se cree que la actividad de ciclina E-CDK2 para promover o ser necesarios para iniciación de la síntesis de ADN [24], [25], y p21 se une e inhibe la actividad de ciclina E-CDK2 [26]. En particular, la aparición de & gt; 4N, las células de ADN replicar 12-16 horas después de la eliminación Nutlin coincidió con una fuerte disminución en los niveles de proteína p21. Especulamos los niveles disminuidos de p21 después de la eliminación de activación permitido Nutlin de la ciclina E-CDK2 complejos que luego podrían impulsar la síntesis de ADN.
A) clones de HCT116 diploides D3 y D8 se dejaron sin tratar (NT) o expuestos a Nutlin (NUT 10 M) durante 24 horas, seguido de eliminación Nutlin. Las células se recogieron en los tiempos indicados después de la eliminación Nutlin. Las células fijadas se tiñeron con yoduro de propidio (25 g /ml) y se sometieron a análisis de citometría de flujo. B) Las células se dejaron sin tratar (NT) o expuestos a Nutlin (NUT 10 M) durante 24 horas, seguido de la eliminación Nutlin. Los lisados celulares se recogieron en los puntos de tiempo indicados y se analizaron por inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. Actina se como control de carga.
P-Cdc2
, fósforo Cdc2 (Tyr-15).
A continuación, hemos querido preguntar si endorreduplicación después de la eliminación Nutlin podría dar lugar a clones tetraploides estables y, en caso afirmativo , si los clones tetraploides resultantes serían resistentes a la CP o la radiación ionizante (IR) apoptosis inducida. Con este fin, D3 y D8 se trataron Nutlin durante 24 horas seguido de la eliminación Nutlin durante 16 horas adicionales. Las células se marcaron a continuación con la tinción de ADN de células vivas Hoechst 33342. células 2N y 8N fueron aislados por citometría de flujo y se volvieron a sembrar a una densidad baja para el aislamiento de clones individuales (Fig 3A). Un total de 11 clones D3 y D8 12 clones se obtuvieron a partir de poblaciones aisladas 8N que surgieron después de la eliminación Nutlin. 7 de los 11 clones D3 (63%) y 8 de los 12 clones D8 (66%) creció a medida que las células tetraploides 4N. Esto se evidenció por: 1) el pico G1 de estos clones solapantes la G2 /M pico de las células diploides D3 y D8 (Fig 3B), 2) el conteo de cromosomas de metafase para untar que apoyaron los clones tetraploides que tienen dos veces el contenido de ADN de la diploide D3 y D8 precursores (figura 3C), y 3) el análisis FISH utilizando
P53
y sondas de cromosoma 17-específicos. Este análisis FISH mostraron clones tetraploides tienen 4 copias del cromosoma 17 y
P53
, mientras que las células D3 y D8 diploides tienen 2 copias del cromosoma 17 y
P53 gratis (figura 3D). Por último, hemos probado si los clones tetraploides que surgieron después del tratamiento Nutlin eran más resistentes a la CP y la apoptosis inducida por IR que sus homólogos diploides. En primer lugar, 5 clones tetraploides y diploides 5 clones aislados a partir de células tratadas Nutlin D3 o D8 se expusieron a CP (20 M) o infrarrojos (10 Gy), y la apoptosis monitoreados 48 horas más tarde por el contenido de ADN sub-G1. Como se muestra en la figura 4A, los clones tetraploides, como grupo, fueron significativamente más resistentes a la CP y la apoptosis inducida por IR que las células parentales y clones diploides aisladas después del tratamiento Nutlin. clones tetraploides individuales (T3 y TD6) también eran más resistentes a la CP y la apoptosis inducida por IR en comparación con sus homólogos diploides (D3 y D81B), evidenciado por un menor porcentaje de células sub-G1 después de la CP y el tratamiento IR (Figura 4B) y una menor expresión de PARP escindida y se escindió de la caspasa-3 (figura 4D). Estos resultados son coherentes con los informes por nosotros y otros que mostraban las células tetraploides pueden ser resistentes terapia [3], [19]. Estudios previos han informado de que p53 y p21 pueden contribuir a CP y IR-resistencia en HCT116 y otras células, lo más probable mediante la inducción o la aplicación de una detención del ciclo celular que bloquea CP o las células de proliferación y tratar de dividir IR-tratada [27] - [31]. En particular, hemos encontrado p53, MDM2 y p21 proteínas fueron inducidos a niveles comparables en CP y diploide tratado con IR y clones tetraploides (figura 4C), y que los genes detención del ciclo celular p53-sensible (
P21
), los genes de reparación del ADN (
P53R2
), y los genes apoptóticos (
PUMA, Noxa, Bax
), fueron también inducidos comparable en el CP y diploide tratado con IR y clones tetraploides (figura 4E). Estos resultados sugieren CP y IR-resistencia en los clones tetraploides no se asocia con un aumento de los niveles de p53 o actividad. En total, los resultados indican la activación de p53 transitoria por Nutlin puede promover una detención en G1 y tetraploide endorreduplicación después de la eliminación Nutlin en las células precursoras diploides, lo que lleva a la generación de la terapia (CP /IR) clones tetraploides resistentes.
) se muestra el procedimiento para aislar clones diploides y tetraploides a partir de células transitoriamente expuestos a Nutlin. D3 y D8 se dejaron sin tratar (NT) o tratados con 10 mM Nutlin (NUT) durante 24 horas, seguido de eliminación Nutlin durante 16 horas adicionales. Las células fueron luego vivir-tiñeron con Hoechst 33342 (5 mg /ml). clasificación de células se realizó en un citómetro MoFlo equipado con un láser de longitud de onda de excitación UV. Las células clasificadas 2N y 8N se sembraron a baja densidad en medio normal (menos Nutlin) y los clones individuales aislados. B)
Top of, la comparación de los perfiles de ADN entre D3 y un clon tetraploide representativa aislada de D3.
Bottom
, la comparación de los perfiles de ADN entre un clon representativo diploide (D81B) aislado a partir de células D8, y un clon tetraploide representante (TD6) aislado a partir de células D8. C) Representante propagación de metafase a partir de células diploides D3 y T3 células tetraploides. El número en la parte inferior derecha indica el número de cromosomas contados. D) El análisis FISH con el cromosoma 17 (Chr 17) y sondas específica de p53 muestra células tetraploides (T3) contiene 4 copias del gen p53 y Chr 17, mientras que las células diploides (D3) tienen 2 copias de p53 y Chr 17.
A) cinco clones diploides aisladas de Nutlin trataron células D3 (D3 diploides) y células D8 (D8 diploides), y cinco clones tetraploides aisladas de Nutlin células D3 (D3 tetraploides) y células D8 (D8 tetraploides) fueron tratados sin tratar (NT) o expuestos a CP (20 M) o IR (10 Gy) durante 48 hrs. Se determinó el porcentaje de células con ADN sub-G1. Se muestran los resultados medios de tres experimentos separados,
bares, error estándar (SE). * Valor de significación (P & lt; 0,05). B) clones tetraploides (T3, TD6) y sus homólogos diploides (D3, D81B) se dejaron sin tratar (NT) o expuestos a CP (20 M) o IR (10 Gy) durante 72 hrs. Se determinó el porcentaje de células con ADN sub-G1 (yoduro de propidio tinción). Se muestran los resultados medios de tres experimentos separados,
bares, error estándar (SE). * Valor de significación (P & lt; 0,05). C) El diploide indicado y clones tetraploides se dejaron sin tratar (NT) o expuestos a CP (20 M) o IR (10 Gy) durante 24 hrs. p53, p21, y los niveles de proteína MDM2 se determinaron por inmunotransferencia y cuantificada. Los números indican el nivel relativo de cada proteína. Actina se utilizó como control de carga. D) El diploide indicado y clones tetraploides no tratados (NT) o expuestos a la CP (20 M) o IR (10 Gy) durante 48 hrs. niveles de PARP escindida y proteína caspasa-3 se determinó por inmunotransferencia y cuantificada con respecto a la no tratada. E) QRT-PCR se utilizó para determinar los niveles de ARNm para los genes indicados en diploide (D3, D81B) y clones tetraploides (T3, TD6) que se dejaron sin tratar (NT) o expuestos a CP (20 M) o IR (10 Gy ) durante 24 hrs. El nivel de cada transcrito de ARNm en los clones diploides no tratados (NT D3, D81B NT) se consideró "1.0", y todos los demás valores se representan con relación a la misma.
clones tetraploides son más susceptibles a p53 dependiente de la apoptosis y la detención del crecimiento inducido por Nutlin
fue un tanto sorprendente que la p53 fue inducida por CP comparable e IR en los clones diploides y tetraploides, a pesar del hecho de que los clones tetraploides albergan el doble de copias del
P53
gen (FISH, la figura 3D). Esto indica el nivel al que p53 es inducido por CP e IR no depende de
P53
número de copias, pero en su lugar puede estar limitado por otros factores, tal vez la cantidad de ADN dañado o el nivel de activación de la tensión inducida quinasas que estabilizan p53. Sin embargo, se especuló el nivel al que p53 es inducida por antagonistas de MDM2 (por ejemplo nutlin) puede depender de la
P53
número de copias, y que las células tetraploides pueden por lo tanto expresan niveles más altos de p53 en respuesta a Nutlin y ser hiper sensible a la inhibición de crecimiento mediada por Nutlin. Para probar esto, diploide D3 y D81B y sus homólogos tetraploide T3 y TD6 se trataron Nutlin durante 24 horas. los niveles de p53 y la proteína MDM2 se determinaron mediante inmunoblot y los niveles de ARNm determinado por qRT-PCR. Los resultados mostraron que los clones tetraploides expresan p53 elevada (~2X más) y ARNm de MDM2 y la proteína de clones diploides, tanto basales (Fig 5A) y después del tratamiento Nutlin 24 hr (Figs 5C). Para evaluar los niveles de complejos p53-MDM2, las células se trataron con MG132 inhibidor del proteasoma para bloquear la degradación de p53, y los complejos p53-MDM2 determinado por co-inmunoprecipitación. Estos estudios mostraron clones tetraploides tenían más complejos p53-MDM2 después del tratamiento MG132 de los clones diploides que les dieron origen (Figura 5B). Por lo tanto, los clones tetraploides expresan niveles más altos de p53 y MDM2, y contienen niveles más altos de complejos p53-MDM2. Especulamos en los clones tetraploides esto se traduciría en mayores niveles de p53 tras el tratamiento Nutlin, y el consiguiente aumento de la detención en G1 dependiente de p53 y la apoptosis. Para probar esto, se comparó la sensibilidad relativa de clones diploides y tetraploides a la detención del ciclo celular inducida por Nutlin o apoptosis. En primer lugar, clones diploides y tetraploides se trataron con dosis crecientes de Nutlin (1,0 a 5,0 M) durante 24 hrs. El aumento de G1 /S relación, lo que refleja el agotamiento de células en fase S y una acumulación de células en la fase G1, se utilizó como una medida de detención G1 inducida por Nutlin. Como se muestra en la figura 6A, los clones tetraploides, como grupo, son más susceptibles a la detención en G1 inducida por Nutlin que las células parentales o clones diploides (relación de G1 /S aumentó más con dosis crecientes nutlin en clones tetraploides de clones parentales o diploides). clones tetraploides individual T3 y TD6 también eran más susceptibles a la detención en G1 inducida por Nutlin que sus homólogos D3 y D81B (figura 6B) diploides. Como se muestra en la figura 6C, se indujeron las proteínas p53 y p21 a niveles más altos y más bajos en dosis nutlin en los clones tetraploides en comparación con los clones diploides. Estos resultados indican los clones tetraploides expresan mayores niveles de p53 y p21 después del tratamiento Nutlin y son más susceptibles que los clones diploides a la detención de G1 inducida por Nutlin. A continuación, los clones diploides y tetraploides fueron tratados con una dosis Nutlin mayor (20 M) durante 72 horas, y la apoptosis monitoreados por porcentaje de células con contenido de ADN sub-G1 y /o la expresión de PARP escindida y se escindió de la caspasa-3. Como se muestra en la figura 6D, los clones tetraploides, como grupo, son más susceptibles a la apoptosis inducida por Nutlin de clones diploides. clones tetraploides individuales (T3 y TD6) también eran más susceptibles a la apoptosis inducida por Nutlin que sus homólogos diploides (D3 y D81B), evidenciado por un alto células sub-G1 por ciento después del tratamiento Nutlin y el aumento de la expresión de PARP escindida y se escindió de la caspasa-3 ( figuras 6E y F).
a) P53 y los niveles de ARNm de MDM2 se compararon en los clones no tratados tetraploides (T3, TD6) y sus homólogos diploides (D3, D81B). B) diploide (D3, D81B) y tetraploide (T3, TD6) clones eran sin tratar o tratadas con inhibidor del proteasoma MG132 (10 mM) durante 8 horas.
Alta
Los niveles de MDM2, p53, y la actina (control de carga) en no tratados y tratados MG132 se muestran las células.
Baja
Para determinar niveles de complejos p53-MDM2 en diploides y tetraploides células, lisados de proteínas se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-p53, seguido de inmunotransferencia para MDM2. C) diploides (D3, D81B) y clones tetraploides (T3, TD6) se dejaron sin tratar o se trataron con Nutlin (10 M) durante 24 hrs. los niveles de p53 y la proteína MDM2 se detectaron por inmunotransferencia y se cuantificaron usando el software Image-J. La cantidad relativa de proteína p53 y MDM2 en los clones diploides no tratados se le dio un valor de "1.0". Los números indican el nivel relativo de cada proteína. Actina se utilizó como control de carga.
A) cinco clones diploides aisladas a partir de células tratadas Nutlin D3 (D3) y células diploides D8 (D8), diploides y tetraploides cinco clones aislados a partir de células tratadas Nutlin D3 (D3 tetraploide) y las células D8 (D8 tetraploide) se dejaron sin tratar o tratadas con el aumento de Nutlin (1,0 a 5,0 M) durante 24 hrs. Las células ciento G1 y fase S se determinó por citometría de flujo, y el pliegue del cambio de G1 /S se traza la relación. Si no se trata clones diploides G1 /S ratio se le dio un valor de 1,0. Se muestra es el promedio de tres experimentos separados, +/- SE. B) clones tetraploides (T3, TD6) y homólogos diploides (D3, D81B) se dejaron sin tratar o se trataron con Nutlin (1,0 a 5,0 M) durante 24 hrs. El factor de cambio de la relación de G1 /S se representa. Se muestra es el promedio de tres experimentos separados, +/- SE. C) diploide (D3, D81B) y los clones tetraploides (T3, TD6) fueron tratados o tratados con el aumento de Nutlin (1,0-5,0 M) 24 hrs. los niveles de p53 y la proteína p21 se cuantificaron utilizando el software Image-J. Los números indican los niveles relativos de cada proteína. los niveles de p53 y p21 en los clones diploides no tratados se le dio un valor de "1.0". Actina se utilizó como control de carga. D) Cinco clones diploides aisladas de Nutlin trataron células D3 (D3 diploides) y células D8 (D8 diploides), y cinco clones tetraploides aisladas de células nutlin tratados D3 (D3 tetraploides) y células D8 (D8 tetraploide) eran sin tratar (NT) o tratado con Nutlin (20 mM) 72 hrs y apoptosis determinados. Se muestran los resultados medios de tres experimentos separados,
bares, error estándar (SE). * (P & lt; 0,05). E) diploide Representante (D3, D81B) y tetraploide (T3, TD6) clones se dejaron sin tratar (NT) o tratados con Nutlin (20 M) durante 72 horas. Se determinó el porcentaje de células con contenido de ADN sub-G1 (yoduro de propidio tinción). Se muestran los resultados medios de tres experimentos separados,
bares, error estándar (SE).