Extracto
Recepteur d'origine nantais (Ron) se sobreexpresa en un panel de células de cáncer de páncreas y muestras de tejido de pacientes con cáncer de páncreas. Ron puede ser activado por su proteína ligando de macrófagos estimulante (MSP), activando de este modo vías de señalización oncogénicas. Crosstalk entre Ron y EGFR, c-Met, o IGF-1R puede proporcionar un mecanismo que subyace a la resistencia a fármacos. Por lo tanto, la orientación Ron puede representar una nueva estrategia terapéutica. IMC-RON8 es el primer anticuerpo monoclonal Ron (mAb) que entra en ensayo clínico para la orientación Ron sobreexpresión. Nuestros estudios muestran IMC-RON8 downmodulated expresión Ron en las células de cáncer de páncreas y significativamente bloqueó la activación estimulada por el MSP Ron, Akt aguas abajo y la fosforilación de ERK, y la expresión del ARNm de survivina. IMC-RON8 obstaculizado la migración celular inducida por MSP y la transformación celular reducida. se informan inhibidores de histona desacetilasa (HDACi) para dirigir la expresión de varios genes a través de la modificación de las histonas de nucleosomas y proteínas no histonas. Nuestro trabajo demuestra HDACi TSA y panobinostat (PS) disminuyeron Ron ARNm y la expresión de proteínas en células de cáncer de páncreas. PS también reduce la señalización aguas abajo de pAkt, survivin, y XIAP, así como la apoptosis de células mejorada. Curiosamente, PS reduce la formación de colonias en las células desmontables Ron en un grado mayor que las células de control scramble RON en la formación de colonias y los ensayos de agarosa blanda. IMC-RON8 también podría sensibilizar a las células de cáncer de páncreas a PS, como se refleja en el número de colonias y la reducción de tamaño en el tratamiento de combinación con IMC-RON8 y PS comparado con el tratamiento solo por sí solo. El co-tratamiento redujo aún más la expresión de Ron y pAkt, y el aumento de la escisión de PARP en comparación con cualquiera de los tratamientos por sí solo. Este estudio sugiere la posibilidad de un enfoque de combinación novedosa que finalmente pueden ser de valor en el tratamiento de cáncer de páncreas
Visto:. Zou Y, Howell GM, Humphrey LE, Wang J, Brattain MG (2013) Ron y Derribo Ron anticuerpo monoclonal IMC-RON8 Sensibilizar cáncer de páncreas a los inhibidores de histona deacetilasa (HDACi). PLoS ONE 8 (7): e69992. doi: 10.1371 /journal.pone.0069992
Editor: Lu-Zhe Sun, Universidad de Texas Health Science Center, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Marzo, 2013; Aceptado el 13 de junio de 2013; Publicado: July 29, 2013
Derechos de Autor © 2013 Zou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud de financiación: CA34432, CA38173, CA72001 y CA54807, adjudicado a MG Brattain. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es una enfermedad altamente maligno, con aproximadamente 40.000 nuevos casos diagnosticados en los EE.UU. en 2012 [1]. La tasa de supervivencia a cinco años es muy baja (& lt; 5%) [2]. Actualmente, menos del 10% de los pacientes son candidatos a cirugía curativa, mientras que más del 90% de las enfermedades localmente avanzado o metastásico son tratados con radioterapia y /o quimioterapia [3]. El cáncer de páncreas finalmente desarrolla resistencia a estas terapias. Los estudios moleculares revelaron que los cambios genéticos y epigenéticos en coche cáncer de páncreas [4]. Una mejor comprensión de las bases moleculares de cáncer de páncreas se beneficiará el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.
Recientemente, Ron se ha identificado que se sobreexpresa en un subgrupo de pacientes con cáncer de páncreas y estableció líneas celulares de cáncer [5], [ ,,,0],6]. Ron pertenece a MET receptor tirosina quinasa de la familia (RTK). Estudios anteriores mostraron que los niveles de Ron son elevados en muchos tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama epiteliales [7], colon [8], pulmón [9], y la vejiga [10] cánceres. Ron sobreexpresión era pronóstico de supervivencia pobre y correlacionada con la progresión de la enfermedad [11].
Los estudios funcionales mostró que Ron puede ser activado por su MSP ligando para iniciar una cascada de señalización molecular, incluyendo PI3K /Akt, MAPK, β -catenina, JNK y las vías de Fak a regulan diversas funciones celulares [12]. El eje MSP /Ron se ha demostrado que influyen en la migración celular y la invasión, y, potencialmente, la promoción de la metástasis del tumor [12], [13]. Regulación a la baja de Ron por caída resultó en la proliferación reducida de células, transformación, crecimiento tumoral, metástasis y el aumento de la apoptosis celular, en células de cáncer de colon [14], [15]; y las células de cáncer de páncreas sensibilizados a la gemcitabina [16]. Por lo tanto, Ron juega un papel importante en el mantenimiento de fenotipos malignos en los cánceres humanos. IMC-41A10 era la única contra Ron-mAb humano que se ha informado que tienen actividad contra el cáncer [17]. IMC-41A10 inhibe la unión a Ron MSP, reduce la fosforilación mediada por MSP Ron, PI3K /Akt y la activación de MAPK, y la migración celular
in vitro
. Recientemente, un nuevo mAb IMC-RON8 humano se generó y entró en la fase I de ensayos clínicos como el primer Ron mAb.
La resistencia a fármacos es un obstáculo importante en la terapéutica del cáncer. Diafonía entre las RTK puede representar uno de los mecanismos de resistencia a los medicamentos. Ron se ha informado que hetero-dimerize con c-Met [18], y la diafonía con EGFR [19], [20] para activar el RTK de manera recíproca. Integrina y IGF1-R también pueden activar Ron a través de una forma MSP-independiente [21], [22]. La sobreexpresión de Ron mayor resistencia al medicamento inhibidor de IGF1-R BMS-536924 en el sarcoma infantil [23]; mientras que desmontables de Ron sensibiliza las células resistentes a BMS-536924 [23]. Estos resultados ponen de relieve un beneficio potencial para los tratamientos de combinación racionales basadas en redes Ron tirosina quinasa.
Los cambios epigenéticos, tales como acetilación y metilación, son la clave modificaciones post-traduccionales de los residuos de lisina altamente cargados de las histonas del nucleosoma centrales. Los cambios en la acetilación de histonas están bajo el control de las actividades de acetytransferases histonas (HAT) y desacetilasas de histonas (HDACs) [24], que determinan la activación o represión transcripcional de la expresión génica de oposición. HAT y HDAC también juegan un papel importante en la acetilación y desacetilación de las proteínas no histonas [25], [26].
La sobreexpresión de HDAC se ha encontrado en colon, de mama, de páncreas, y otros tipos de cáncer [27] - [31], que sugieren que pueden ser dianas contra el cáncer atractivos. inhibidores de la HDAC son reportados para dirigir la expresión de varios genes a través de la modificación de las histonas de nucleosomas y proteínas no histonas. El pan-HDACi TSA, vorinostat, Belinostat y panobinostat (PS) han sido ampliamente investigados. PS ejercida robustos efectos contra el cáncer en células de leucemia a través de hyperacetylation de histonas de nucleosomas y la regulación positiva de la transcripción de p21 y la expresión de p27 [32]. PS redujo el crecimiento del cáncer de páncreas través de la inhibición de la proliferación celular y la inducción de apoptosis de las células [33]. TSA aumentó la respuesta de las células de cáncer de páncreas a quimioterapias convencionales incluyendo 5-FU y gemcitabina [2], [34]. Sin embargo, los mecanismos exactos que subyacen tratamiento HDACi son en gran parte desconocidos. Nuestro laboratorio demostró que HDACi Belinostat indujo la expresión de TGF epigenetically silencio RII y por lo tanto restaura TGF la señalización mediada por la inhibición del crecimiento de células de tipo salvaje en Smad4 (en peso) de células de cáncer pancreático (por ejemplo, MiaPaCa-2), [35]. Ron es altamente expresado en células de cáncer pancreático mutantes Smad4. de tipo salvaje expresión Smad4 se informó para suprimir Ron expresión [36]. Desmontables de Smad4 o la inhibición de la señalización de TGF dio lugar a la inducción de la expresión de Ron. Los estudios muestran que aquí HDACi PS y TSA downregulated Ron y su señalización corriente abajo en las células de cáncer de páncreas. Ron Ron KD o mAb sensibilizan las células de cáncer de páncreas a PS. Oral PS se ha utilizado en el ensayo clínico de fase II en pacientes adultos con refractario /linfoma y el ensayo de fase I de Hodgkin en recaída de tumores sólidos avanzados [32]. Nuestros estudios han explorado un posible mecanismo subyacente tratamiento PS de cáncer de páncreas y proporcionado evidencia importante para el potencial de un tratamiento de combinación racional para Ron-expresión de células de cáncer pancreático.
Materiales y Métodos
Cultivos Celulares
líneas celulares de cáncer pancreático humano Capan-1 y CFPAC-1 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), y L3.6pl células se originó a partir de Dr. IJ Fidler [37]. Las células se cultivaron en medio SM (medio libre de suero 5A de McCoy con piruvato, vitaminas, aminoácidos y antibióticos), suplementado con 10% FBS. Todas las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2 a 37 ° C.
Los anticuerpos y reactivos
Los anticuerpos para Ron C-20, survivina, MAPK y pERK1 /2 fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology Inc. poli- (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), pAkt (Ser
473), Akt, los anticuerpos de la caspasa 9 se obtuvieron de Cell Signaling Technology. anticuerpo XIAP fue de Abcam. Anti-PTRY clon 4G10 fue adquirido de Millipore. Anticuerpo para actina se compró a Sigma
MSP humana recombinante se adquirió de amp I +;. D Systems (Minneapolis, MN) y se utiliza a una concentración de 400 ng /ml en todos los experimentos. IMC-RON8 fue proporcionado por el sistema de ImClone LLC (New York, NY). Panobinostat (PS) se obtuvo de Selleckchem. Tricostatina (TSA) fue de Sigma-Aldrich. Tanto el PS y TSA se solubilizaron en DMSO y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso.
Generación de Ron derribo líneas celulares estables
La lucha expresión (PSR-SC) y shRNA PSR-Ron plásmidos fueron proporcionados por el Dr. J. Wang [15]. Para establecer líneas celulares estables con Ron derribado por shRNA para las células L3.6pl, PSR-Ron y un vector de control (PSR-SC) se cotransfectaron en una línea celular paquete HEK293GP junto con el virus de la estomatitis vesicular-G (G-pVSV ) plásmido utilizando el reactivo de transfección Fugene HD. El sobrenadante se recogió 48 horas más tarde y se utiliza para infectar las células L3.6pl. Puromicina se utilizó para seleccionar las células infectadas. Las células individuales se aislaron mediante siembra de las células agrupadas en densidades bajas. Dos clones A6 y B21 con Ron específica KD se utilizaron en los estudios posteriores.
análisis de transferencia Western
Las células se lisaron en tampón de lisis NP40 [50 mmol /L de Tris-HCl (pH 7,4) , 150 mmol /L de NaCl, 0,5% de NP40, 50 mmol /L NaF, 1 mmol /L Na
3Vo
3, 1 mmol /L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 mmol /L de DTT, 25 mg /ml de aprotinina, 25 mg /ml de inhibidor de tripsina, y 25 mg /ml de leupeptina] a 4 ° C. Los lisados celulares se hirvieron en un tampón de carga de gel y se separaron por SDS /PAGE en geles de 4~15%. Después de PAGE, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore). Después de la transferencia, las membranas se bloquearon con 5% de leche en TBST durante 1 hora. A continuación, las membranas se sondearon con los anticuerpos primarios indicados a 4 ° C durante la noche. Después de lavar tres veces en TBST, las membranas se incubaron durante 1 hora con los anticuerpos secundarios conjugados con HRP específicos de especie apropiadas. Después de otro lavado tres veces, las membranas se procesaron y se visualizaron con reactivos de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Amersham).
in vitro
Ensayo de proliferación de MTT Usando
La proliferación celular se analizó utilizando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- difeniltetrazolio bromuro (MTT) ensayo. Brevemente, Capan-1, las células CFPAC-1 y L3.6pl se sembraron a una densidad de 2000~3000 células /pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se trataron con diferentes concentraciones de PS en el día 2. Cuarenta y ocho horas después del tratamiento, las células fueron incubadas con MTT (0,5 mg /ml) durante 2 horas a 37 ° C. Después se retiró el medio que contenía MTT, se añadieron 150μl de DMSO a cada pocillo y se mezclaron en el eje de balancín. Las placas se leyeron a 570 nm utilizando un lector de microplacas (Bio-Rad). La absorbancia medida es directamente proporcional al número de las células viables en el cultivo.
fragmentación del ADN (muerte celular ELISA)
La apoptosis se cuantificó utilizando la fragmentación del ADN de la célula kit de detección de muerte ELISA Plus ( Roche) según las instrucciones del fabricante. Las células se trataron con PS como se describe anteriormente. Veces el aumento de la fragmentación del ADN se normalizaron con los valores de MTT de las condiciones de tratamiento idénticas.
La extracción de RNA y cuantitativa en tiempo real RT-PCR
El ARN total se preparó a partir de células tratadas con el aislamiento de ARN de alta Pure kit (Roche). Expresión de Ron mRNA se midió por cuantitativa en tiempo real PCR con reactivos TaqMan (Applied Biosystems) en ADNc a transcripción inversa de 2 mg de ARN total. El mRNA GAPDH se amplificó simultáneamente para un control endógeno.
inmunoprecipitación (IP)
Los lisados celulares con 600 g de proteína se incubaron con 10 mg de anticuerpo y perlas de Sepharose anti-Ron la noche a 4 ° C . El día siguiente, las perlas se recogieron por centrifugación y se retiró el sobrenadante para su posterior análisis. Las perlas se lavaron tres veces con PBST. Después del lavado final, las perlas aglomeraron se resuspendieron en 30 l de tampón de muestra SDS. Las muestras se calentaron a 95 ° C durante 5 min. Los complejos inmunes resultantes se corrieron en un gel de SDS-PAGE al 8% seguido de inmunotransferencia (IB) para pTyr y Ron.
Ensayos y la curación de heridas Transwell Motilidad Ensayos
Se sembraron células Capan-1 en 60 mm plato y crecieron hasta confluencia. Ellos luego se mueren de inanición durante la noche antes del tratamiento IMC-RON8 por 1 h. monocapas de células confluentes fueron entonces heridas manualmente por una punta de pipeta para formar un hueco. El medio de cultivo celular se sustituyó con medio SM fresco seguido de estimulación MSP durante 24 h y 48 h. Cierre de la herida se controló por microscopía. Se midió
La migración celular en respuesta a MSP utilizando una cámara de Boyden modificada con 8 micras de poro de filtros de policarbonato Transwell 6,5 mm (Corning Costar). Después de tripsinización, suspensiones de células individuales fueron sembradas en las cámaras superiores en medio SM en placas de 24 pocillos. MSP Chemo-atrayente se añadió en las cámaras inferiores, con 10% de FBS se utilizó como control positivo. IMC-RON8 se añadió en la cámara superior 2 horas antes de la adición de MSP. Las células se dejaron migrar hacia la cámara inferior con quimio-atrayentes. Después de la incubación 24 h, se añadió 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio al medio. Las células en la cámara superior del filtro se retiraron con un hisopo de algodón, y se visualizaron las células que migran a la parte inferior del filtro bajo el microscopio seguido de solubilización en DMSO y cuantificación a 570 nm.
Formación de Colonias ensayos y suaves agarosa ensayos
células SC L3.6pl y clones shRNA KD A6 y B21 se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 300 células /pocillo. Las células se trataron con PS en día 2 a las concentraciones indicadas durante 48 horas. Luego, las células se lavaron con PBS tres veces. Se añadieron medio fresco con 10% de FBS. Después de 10 días adicionales de incubación, las colonias de células se visualizaron por tinción con MTT, seguido de solubilización en DMSO y quatifying a 570 nm.
ensayos de agarosa blanda se utilizaron para determinar las propiedades de transformación de CFPAC-1 y L3. células 6PL en presencia o ausencia de IMC-RON8 y /o PS. Brevemente, las células se suspendieron a 2000 células /ml en 1 ml de 0,4% de agarosa en medio SM que contenía 10% de FBS y se sembraron en la parte superior de 1 ml de 0,8% de agarosa en el mismo medio en placas de 6 pocillos. Las placas se incubaron durante 2 semanas a 37 ° C con 5% de CO
2 en un incubador humidificado. Las colonias celulares se visualizaron por tinción con 0,5 mol de
p
-iodonitrotetrazolium violeta (Sigma) y se fotografiaron. Se contaron los números de colonias. El crecimiento independiente de anclaje de células Ron KD L3.6pl SC y también se midieron mediante ensayos de agarosa blanda con o sin tratamiento PS.
Análisis estadístico
Los datos se resumieron como media ± error estándar ( SE). La significación estadística se calculó utilizando el software SPSS con el estudiante
t
prueba o ANOVA para determinar las diferencias en las medias. La significación fue aceptado para lt
p
valor de
&;
0,05. Todos los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente.
Resultados
IMC-RON8 downmodulated Ron Expresión e inhibió MSP dependiente de fosforilación Ron y aguas abajo de señalización
Para evaluar el efecto del IMC- RON8 sobre la expresión de Ron en Ron sobreexpresan células de cáncer pancreático, células Capan-1 y CFPAC-1 se trataron con 100 nM de IMC-RON8 para diversos intervalos de tiempo, seguido de análisis de transferencia Western. La Figura 1A muestra que la reducción de Ron fue visto después del tratamiento con IMC-4h RON8 y duró hasta 48 horas en ambas líneas celulares. IMC-RON8 se evaluó entonces por su capacidad para bloquear la activación de Ron y sus efectores aguas abajo, MAPK y Akt. células CFPAC-1 fueron privadas de suero durante la noche y se trataron con IMC-RON8 seguido por la estimulación MSP durante 30 minutos. Los resultados de IP (Fig. 1B) demostraron que en sí IMC-RON8 no indujo la fosforilación de Ron, lo que indica que IMC-RON8 no tenía efectos agonistas. fosforilación de la tirosina de Ron se incrementó significativamente por la estimulación MSP, pero en gran parte anulada por el tratamiento IMC-RON8. Un estudio informó de que la estimulación MSP activa Ron aguas abajo de señalización de PI3K /Akt y MAPK en las células de cáncer de páncreas [6]. En consecuencia, se investigó el papel de IMC-RON8 de MAPK y la fosforilación de Akt en las células CFPAC-1 Capan-1, y L3.6pl. Nuestros resultados mostraron que todas las líneas celulares de cáncer pancreático que examinamos mostraron una fuerte fosforilación MSP-dependiente de Akt y MAPK, y que el tratamiento IMC-RON8 bloqueados inducida por MSP activación de Akt y MAPK en todas las líneas celulares (Fig. 1C). Para determinar si la activación Ron puede aumentar la survivina y la expresión de XIAP, se trataron Capan-1 y CFPAC-1 células con IMC-RON8 seguido por la estimulación MSP durante 12 horas después de la privación de suero durante una noche. Los resultados mostraron que la estimulación MSP aumentó la expresión de ARNm de survivina (Fig. 1D), pero no nivel XIAP ARNm (datos no mostrados). IMC-RON8 puede bloquear este aumento de la expresión de ARNm de survivina. No se observó aumento significativo de XIAP y la expresión de la proteína survivina MSP después de la estimulación en el Western Blot.
A) Efecto de IMC-RON8 (100 nM) sobre la expresión de Ron. Western blot para Ron. β-actina sirvió como control de carga. B) Efecto de IMC-RON8 sobre la activación inducida por Ron MSP. Las células se privaron de suero durante la noche y se trataron con IMC-RON8 durante 1 hora seguido por la estimulación MSP para media hora. Los lisados celulares fueron sometidos a IP, y IB para Pron. C) Efecto de IMC-RON8 de señalización corriente abajo. El mismo tratamiento que B). Western blot para Perk y pAkt. D) la activación de Ron y la expresión del ARNm de survivina. células CFPAC-1 Capan-1 y se trataron con IMC-RON8 seguido por la estimulación MSP durante 12 horas después de la privación de suero durante una noche. RT-PCR cuantitativa se realizó en ARN total para determinar el nivel de ARNm de survivina. ARNm de GAPDH se utilizó como control interno.
IMC-RON8 inhibió significativamente la célula MSP impulsada por la motilidad
Para evaluar el efecto del IMC-RON8 sobre la motilidad celular, un ensayo de migración transwell se llevó a cabo en las células Capan-1 con tratamiento IMC-RON8 en presencia o ausencia de MSP. IMC-RON8 redujo significativamente MSP- la migración de células inducida en células Capan-1 por 80~90% (Fig. 2A).
in vitro
ensayos de curación más confirmado la capacidad del IMC-RON8 para bloquear la migración de células de la herida. células Capan-1 estimuladas con MSP comenzaron a migrar a la zona de la herida 24 horas después de la cero (Fig. 2B). La herida estaba casi curada por células que migran a las 48 horas después del tratamiento MSP, mientras IMC-RON8 redujo significativamente la movilidad celular
.
células Capan-1 fueron privadas de suero durante la noche. La migración celular se evaluó mediante el ensayo transwell con MSP como un quimioatrayente en la cámara inferior. A) Imágenes de células migraron con éxito hasta el lado inferior de la membrana Transwell. B) Cuantificación de las células migradas. C.
in vitro
cicatrización de la herida ensayo.
HDACi Downregulated Ron ARNm y la expresión de la proteína y aguas abajo de señalización
Para determinar el efecto de HDACi sobre la expresión de Ron, Capan -1, L3.6pl y las células CFPAC-1 se trataron con pan-HDACi PS durante 8, 24 y 48 horas. Los resultados mostraron que PS agota expresión Ron en todas las líneas que expresan Ron-celulares examinados (Fig. 3A). Reducción de Ron se observó dentro de las 8 horas con el aumento de agotamiento se producen más de 48 períodos h (Fig. 3A). La regulación a la baja pronunciada de Ron también se observó en las células de cáncer de páncreas tratados con otro pan-HDACi, TSA (Fig. 3B), lo que indica la reducción de Ron es una característica común para el tratamiento de Pan-HDACi. Se determinó a continuación si los cambios en la proteína Ron eran al menos parcialmente debido a cambios en su transcripción. El tratamiento con PS disminuyó significativamente el nivel de ARNm de Ron en una forma dependiente del tiempo (Fig. 3C). Además, las células tratadas con DMSO solo (disolvente para PS y TSA) no tuvieron influencia sobre la expresión de Ron tanto en los niveles de ARNm y proteínas. Estudios anteriores mostraron que Ron fosforilación activa una cascada de moléculas de señalización corriente abajo, incluyendo la fosforilación de Akt [6], [15], [17]. A continuación se determinó el efecto de PS en la señalización celular aguas abajo. células Capan-1, L3.6pl y CFPAC-1 fueron tratados con PS. Después del tratamiento durante 8 y 24 horas, la fosforilación de Akt se redujo de manera dependiente de la concentración en las 3 líneas celulares de cáncer de páncreas (Fig. 3D). PS tratamiento durante 24 y 48 horas también redujo tanto los niveles de XIAP y proteína survivina de una manera dependiente de la concentración en las células de cáncer de páncreas (Fig. 3D).
A) cáncer de páncreas células fueron tratadas con diferentes concentraciones de PS para 8h, 24h, y de 48 horas. Se realizó Western blot para Ron. β actina sirvió como control de carga. B) Las células fueron tratadas con TSA con el IB para Ron. número sustancial de células estaban muertos (aproximadamente 80%) en las células Capan-1 tratados con TSA 1000 nM a las 48 horas. C) Las células se trataron con 50 nM de PS durante 8, 24 y 48 horas. RT-PCR cuantitativa se realizó en ARN total para determinar el nivel de ARNm de Ron. GAPDH mRNA se utilizó como control interno. D) Las células fueron tratadas con diferentes concentraciones de PS en los puntos de tiempo indicados. Western blot para pAkt, XIAP y la expresión de survivina. B-actina se utilizó un control de carga.
PS crecimiento celular más bajos y mayor apoptosis de las células mediante la inducción de ciclo celular p21 y caspasa Regulador Actividad
La función de los miembros de la familia IAP y XIAP survivin es inhibir la caspasa 3, 7, 9 y la actividad de apoptosis de las células dependiente de caspasa mediante la unión a las caspasas activas [42]. Se demuestra que después de 48 h de incubación, PS reduce la proliferación celular (Fig. 4A) y un aumento de la apoptosis de células (Fig. 4B) de una manera dependiente de la concentración en las 3 líneas celulares ensayadas como se determina por MTT y fragmentación del ADN. Estudios anteriores indicaron que los resultados del tratamiento HDACi en la proliferación alterada de células de cáncer pancreático, debido a una detención en el ciclo celular y la inducción de la muerte celular programada dependiente de caspasa [33]. Hemos detectado un aumento de la p21 dependiente de ciclina inhibidor de quinasa (CDK) en células de cáncer de páncreas después del tratamiento HDACi (Fig. 4C). Aumento Capase-9 y la escisión de PARP activación siguiente caspasa también se observó en células L3.6pl (Fig. 4C) Capan-1 y. Se encontró que en células CFPAC-1, el aumento de escisión de caspasa 9 sólo se detectó a altas concentraciones de tratamiento PS a las 48 horas, pero no a las 24 horas. Correspondientemente, la escisión de PARP se observó sólo en la alta concentración de tratamiento PS en células CFPAC-1, lo que indica que las células CFPAC-1 son relativamente resistentes a PS apoptosis de células inducida en comparación con las células Capan-1 y L3.6pl.
Las células se trataron con diferentes concentraciones de PS, A) el crecimiento celular se midió mediante MTT; B) apoptosis de las células se midió por la fragmentación del ADN; C) Las transferencias Western para p21 y la activación de caspasas (PARP y caspasa 9 divisiones). B-actina se utilizó como control de carga.
Ron Ron de derribo o mAb IMC-RON8 sensibilizados cáncer pancreático células para el tratamiento PS
Tanto IMC-RON8 y PS downmodulated expresión Ron. IMC-RON8 reduce la señalización oncogénica a través pAkt y Perk e inhibe la migración celular en las células de cáncer de páncreas. Sin embargo, IMC-RON8 no afecta a la proliferación celular y la apoptosis de células
in vitro
como se evidencia por MTT, PARP y caspasa 9 divisiones, que es el mismo para Ron desmontables (datos no mostrados). PS, sin embargo, induce significativamente la apoptosis de células y reduce la proliferación celular en células de cáncer pancreático. La combinación entre Ron caída o IMC-RON8 y PS puede compensar la falta de inhibición de la supervivencia celular en la orientación Ron IMC-RON8 o Ron caída. Para determinar los efectos proliferativos de Ron caída y el tratamiento PS, se realizó un ensayo de formación de colonias estándar. En primer lugar, los plásmidos revueltos (SC) y Ron shRNA fueron entregados en las células mediante transfección L3.6pl-infección para establecer un control SC L3.6pl y Ron líneas celulares estables desmontables. clones de células individual A6 y B21 fueron seleccionados después del tratamiento puromicina. Ron golpeó shRNA específicamente hacia abajo la expresión de Ron, ya que c-Met, que tiene una alta identidad de secuencia con Ron, no mostró ningún cambio (Fig. 5A). A continuación, las células L3.6pl SC y los clones Ron KD A6 y B21 fueron tratados con bajas concentraciones de PS. Los resultados mostraron que tanto L3.6pl SC y el crecimiento celular Ron KD se inhibieron significativamente por PS de una manera dependiente de la concentración (Fig. 5A). tratamiento PS a la misma concentración reducida de formación de colonias en las células Ron KD L3.6pl a un mayor grado que las células de control SC Ron (Fig. 5A). sí Ron KD no cambió la proliferación celular en células de cáncer pancreático. A continuación realizamos ensayos de agarosa blanda para determinar con mayor precisión las propiedades de transformación de células L3.6pl con Ron KD y el tratamiento PS. Figura 5B mostró que los clones L3.6pl Ron KD producen un menor número de colonias (30~40%) que las células SC Ron en la agarosa blanda. PS reduce significativamente colonias formadas tanto en clones de células KD (Fig. 5B) L3.6pl Ron y SC. Curiosamente, el tratamiento dio lugar a PS significativamente más menos el número de colonias en células L3.6pl Ron KD que en las células SC L3.6pl a todas las concentraciones de PS (Fig. 5B). Los tamaños de colonias en PS trataron células L3.6pl Ron KD eran obviamente más pequeño que PS células tratadas SC (datos no mostrados). A fin de determinar el papel de Ron en el cáncer de páncreas, IMC-RON8 se introdujo para medir los posibles efectos de combinación junto con PS. En ambas células L3.6pl (Fig. 5C) y CFPAC-1 (Fig. 5D), el bloqueo de Ron con IMC-RON8 podría reducir la formación de colonias en comparación con los controles sin tratamiento (hasta 50%). El tratamiento combinado con PS y el IMC-RON8 genera aún más significativamente menor número de colonias con un tamaño más pequeño que el tratamiento farmacológico solo solo en tanto L3.6pl y las células CFPAC-1 (Fig. 5C y 5D).
A) L3. 6PL células fueron transfectadas de forma estable con Ron SC y plásmidos shRNA. clones Ron KD A6 y B21 fueron seleccionados para el ensayo clonogénico: L3.6pl Ron SC y clones KD A6 y B21 se trataron en los días 2 con PS a las concentraciones indicadas durante 48 horas. Después del lavado, las células se cultivaron durante 10 días adicionales en 10% de FBS que contienen medio. Las colonias celulares se visualizaron después de la tinción MTT y se cuantifiquen en DMSO. SEGUNDO). Se determinó el crecimiento independiente del anclaje de L3.6pl SC y clones Ron KD tratados por PS como se describe en Materiales y Métodos. ensayo de argrose blanda también se realizó para C) células L3.6pl y D) CFPAC-1 en las células tratadas con IMC-RON8 o PS solo o sus combinaciones.
Los mecanismos subyacentes a IMC-RON8 sensibilización de las células del cáncer pancreático a PS
Para determinar el efecto del tratamiento de combinación con PS y el IMC-RON8 sobre la expresión de Ron, Capan-1, L3.6pl y CFPAC-1 células fueron tratadas con las concentraciones indicadas de IMC-RON8 , PS o su combinación. Se encontró que Ron se degradó por IMC-RON8 24h después del tratamiento (Fig. 6A). PS solo tratamiento que reduce Ron, pAkt y el aumento de la escisión de PARP. Sin embargo, co-tratamiento redujo aún más la expresión de Ron (Fig. 6A), en comparación con un solo tratamiento por sí solo en las tres líneas celulares de cáncer pancreático que examinamos. Además, co-tratamiento también reduce aún más pAkt y el aumento de escisión de PARP (Fig 6B). Estos podrían explicar la formación de colonias reducida en el tratamiento de combinación con un único agente.
A) expresión Ron después de co-tratamiento de las células CFPAC-1 Capan-1, L3.6pl y con IMC-RON8 y PS. B) Efecto de la co-tratamiento de IMC-RON8 y PS en pAkt y la escisión de PARP. β-actina se utilizó como control de carga.
Discusión
Este estudio identificó un posible nuevo enfoque terapéutico en el cáncer de páncreas usando una estrategia de combinación a través de la explotación de las características tanto genéticos y epigenéticos. El cáncer de páncreas es uno de los problemas más difíciles en la terapia del cáncer. La quimioterapia actual de gemcitabina tiene una muy baja tasa de respuesta (& lt; 20%) y la resistencia a los medicamentos se desarrolla rápidamente dando como resultado el fracaso del tratamiento [2]. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas estrategias terapéuticas.
Ron se ha informado recientemente a ser altamente expresado en células de cáncer de páncreas y muestras de pacientes [5], [6]. La estimulación con MSP activa Ron y su señalización aguas abajo, incluyendo PI3K /Akt y MAPK y promueve la migración celular y la invasión. Sin embargo, la activación Ron no tuvo ningún efecto sobre la proliferación en las células de cáncer de páncreas [6]. Desmontables de Ron ha mostrado una mayor susceptibilidad a la apoptosis de las células de cáncer de colon al estrés privación del factor de crecimiento a través de la activación mutante p110α [14], [15]. Sin embargo, las células de cáncer de páncreas no contienen mutaciones p110α. Ron KD no tuvo ningún efecto sobre la proliferación celular y la apoptosis según la evaluación de MTT, PARP y caspasa 9 divisiones
in vitro
(datos no mostrados) en las células de cáncer de páncreas.
Nuestros estudios mostraron que aquí IMC -RON8 downmodulated expresión Ron, que era consistente con estudios previos que el ratón anti-Ron mAb Zt /g4, Zt /f2 y Zt /C9 reducción de la expresión de Ron en células de cáncer de colon [43]. Human mAb IMC-41A10 reduce eficazmente la activación mediada por Ron MSP y su PI3K aguas abajo /Akt y MAPK activación [17]. reducción de señalización MAPK por IMC41A10 se evidenció por la reducción de pERK en todas las líneas celulares de cáncer elegido. Sin embargo, el efecto de IMC41A10 en pAkt no es coherente en todas las líneas celulares. Por ejemplo, IMC41A10 tuvo un fuerte impacto en la reducción de la activación de Akt en células HT29, Du-145 y AGS, mientras que IMC-41A10 no cambió pAkt en otras células, incluyendo la línea celular de cáncer de páncreas BxPC3 [17].
IMC-RON8, otra completamente humanos anti-Ron mAb, muestra actividad antitumoral contra de colon humano, pulmón y páncreas xenoinjertos en ratones desnudos [44]. Nuestros estudios demostraron que aquí IMC-RON8 inhibe eficazmente la fosforilación Ron en células CFPAC-1, así como pMAPK aguas abajo y la activación pAkt en todas las líneas celulares de cáncer pancreático que examinamos incluyendo BxPC3 (datos no mostrados). Esto indicaba que el IMC-RON8 es funcional para la inhibición de las vías de señalización mediada por MSP y exhibe una fuerte eficacia en relación con el bloqueo de la vía PI3K /Akt.
El trabajo previo de nuestro laboratorio y otros han demostrado que la activación de Akt está vinculada a