Extracto
La reprogramación del metabolismo de la energía es fundamental para el cáncer, por lo que las mitocondrias son objetivos potenciales para la terapia contra el cáncer. Un estudio previo ha demostrado la actividad anti-proliferativa de una nueva clase de rosamines mitocondrias-orientación. El presente estudio describe
in vitro
citotoxicidad de los análogos de rosamine de segunda generación, su modo de acción, y sus
in vivo
eficacias en un modelo de ratón aloinjertado tumor. Aquí, hemos demostrado que estos compuestos exhiben una potente citotoxicidad (IC promedio
50 & lt; 0,5 M), inhibió Complejo II y ATP sintasa actividades de la vía de la fosforilación oxidativa mitocondrial y la pérdida inducida del potencial de membrana mitocondrial. A NCI-60 líneas celulares de serigrafía indicaron, además, que los análogos rosamine 4 y 5 exhiben efectos antiproliferativos potentes con Log
10GI
50 = -7 (GI
50 = 0,1 mM) y fueron más eficaces contra un cáncer colorrectal subpanel que otras líneas celulares. Preliminar
in vivo
estudios sobre ratones 4T1 /c-murinos portadores de cáncer de mama hembra BALB indicaron que el tratamiento con análogo 5 en una única dosis de 5 mg /kg o un programa de dosificación de 3 mg /kg una vez cada 2 días de 6 veces (q2d × 6) exhiben solamente un mínimo de inducción de retraso del crecimiento tumoral. Nuestros resultados sugieren que los análogos rosamine pueden desarrollarse aún más como agentes de focalización mitocondriales. Sin lugar a dudas estrategias adecuadas necesidad de crear mecanismos para mejorar la captación tumoral de rosamines, es decir, mediante la integración a moléculas portadoras para un mejor resultado terapéutico
Visto:. Lim SH, Wu L, LV Kiew, Chung LY, Burgess K, Lee HB (2014) Rosamines focalización del cáncer de fosforilación oxidativa Camino. PLoS ONE 9 (3): e82934. doi: 10.1371 /journal.pone.0082934
Editor: Siyaram Pandey, Universidad de Windsor, Canada |
Recibido: 13 Junio, 2013; Aceptado: 30 Octubre 2013; Publicado: 12 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Lim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación cáncer de iniciativas de investigación, Malasia Ministerio de subvenciones HIR-mohe de Educación Superior (UM.C /625/1 /HIR /MoHE /MED /17 y UM.C /625/1 /HIR /MoHE /MED /33), Universiti Malaya post Graduate Beca de Investigación (PS204 /2010B), y por las subvenciones a KB de los Institutos nacionales de Salud (GM087981) y la Fundación Robert A. Welch (a-1121). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
convencional quimioterapia contra el cáncer depende de los fármacos que actúan mediante la interrupción de la replicación del ADN, es decir, mediante la inhibición de la síntesis o la función de nuevos materiales nucleicos, o causando daños irreparables a los ácidos nucleicos vitales a través de la intercalación, la alquilación o la inhibición enzimática. La falta de selectividad para las células neoplásicas exhibidas por estos fármacos normalmente limita su éxito como agentes de tratamiento. estrategias quimioterapéuticos contemporáneas que se dirigen a las vías de señalización o productos génicos particulares tienden a ser limitados a los cánceres impulsados por un oncogén dominante y a menudo son vulnerables a la resistencia a través de la multiplicidad de señalización tumorigénesis vías [1]. Por ejemplo, la mayoría de los pacientes HER-2 positivo cáncer de mama metastásico que respondieron inicialmente al tratamiento con trastuzumab desarrollan resistencia a trastuzumab secundaria dentro de un año después del inicio del tratamiento [2]. Observaciones similares se han hecho para vemurafenib BRAF-objetivo para la terapia del melanoma [3] y EGFR erlotinib o gefitinib para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas [4].
Una alternativa relativamente nueva de ADN de direccionamiento y enzimas en las células que proliferan rápidamente, o vías de señalización es centrarse en orgánulos como las mitocondrias. Las mitocondrias son los generadores de energía que mantienen la vida celular y las funciones celulares esenciales, incluyendo múltiples cascadas de señalización que regulan las células, por ejemplo, el metabolismo, el control del ciclo celular, desarrollo y muerte celular [5]. En la quimioterapia del cáncer, las drogas mitocondrias de metas interfieren con los metabolismos celulares de cáncer por pertubing el potencial transmembrana mitocondrial, la inhibición de los complejos de la cadena redox de electrones, lo que interfiere la transmembrana permeabilidad mitocondrias, y la orientación mitocondrial de ADN [6],. Los tipos más comunes de los medicamentos mitocondrias de metas son fármacos lipófilos, catiónicos; éstos son selectivos para las células del cáncer, ya que tienden a tener mayores potenciales de membrana mitocondrial que las células epiteliales normales [8], [9].
Hemos informado anteriormente de relaciones estructura-actividad (SAR) para las propiedades anticancerígenas de una serie de rosamines (Fig. 1A) [10], [11]. Estos compuestos son cationes lipofílicos deslocalizados (DLC) con aminas cíclicas periféricos y diversos grupos en el
meso
posición; la mayoría de estos cationes son sustancialmente más potente que la rodamina-123 que es un catión lipofílico deslocalizado bien estudiado. Coherencia con esto, los datos de SAR para los rosamines sugirió buenas potencias correlacionados con aminas cíclicas hidrofóbicos e
meso
sustituyentes arilo. Tiofurilo y 4-yodofenil
meso
sustitución correspondieron a una mejora de aproximadamente 5 veces en la potencia en comparación con la sustitución de fenilo. Además, los datos indicaron que la CI significativamente menor
50 valores se obtuvieron para compuestos asimétricos (X
1 no mismo que X
2), pero la combinación de sustituyentes de amina asimétricas con tiofurilo y 4-yodofenil
meso
sustitución no fue explorado. formación de imágenes intracelular en ejemplos representativos se indica que estos compuestos se acumulan en la mitocondria. Estos compuestos (es decir rosamine 2 y 5) también se han encontrado para ser más citotóxico contra las células cancerosas en comparación con las células epiteliales normales inmortalizadas del mismo tipo de órganos [10].
(A) de los colorantes rosamine funcionalizado diversamente en
meso
posición como se informó anteriormente por Lim et al. (Medicamentos contra el cáncer de 2009, 20: 461-468), los que se muestran aquí con
meso CD - tiofurano o 4-yodofenil tenían actividades contra el cáncer superiores en ensayos celulares. (B) La segunda generación de los objetivos presentados en este trabajo
se llevó a cabo la investigación aquí para sondear cómo dos modificaciones moleculares afectan citotoxicidad en esta serie:. Sustitución de (i)
párrafo
-yodo o grupos tiofurano con otros grupos
párr
haluro o furanos; y, (ii) combinación de tiofurilo y 4-yodofenil
meso
sustitución con combinaciones de piperidina /morfolina. Por lo tanto nos informan de síntesis de rosamines de segunda generación (Fig. 1B) y sus citotoxicidades con respecto a un panel de líneas celulares de tumores sólidos. Los compuestos con actividad prometedora fueron evaluados en la pantalla de líneas de células tumorales humanas NCI-60. También se examinaron rosamines seleccionadas por su efecto en los sistemas redox celular y para los efectos en un
in vivo
modelo de tumor en.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con protocolos revisados y aprobados por el Dr. Haji Azizuddin Bin Haji Kamaruddin, Centro de animales de Laboratorio (ALC) Cuidado de animales y el empleo Comisión de la Facultad de Medicina de la Universidad de Malaya (número de referencia FAR /14/07 /2010 /LSH). los ratones Balb /c hembras de edades comprendidas entre 6-8 semanas con un peso mínimo de 17 g se mantuvieron en un ambiente controlado de 12 h ciclos de luz-oscuridad con acceso libre al alimento (dieta estándar de pellets comprado a Altromin Internacional, Lage, Alemania) y agua purificada. Los ratones hembra se utilizaron porque el entorno hormonal esencial para el desarrollo de carcinoma mamario de ratón 4Ti implantado estaría presente.
Materiales
medio esencial mínimo con de sal y L-glutamina Earl, medio RPMI 1640 con L -glutamine, suero bovino fetal, Pen-Strep (10 000 U /ml de penicilina, 10 mg /ml de estreptomicina), tripsina 10 × fueron suministradas por GIBCO, Invitrogen (Auckland, Nueva Zelanda). JC-1 se adquirió de Molecular Probes, Invitrogen (Oregon, EE.UU.). Dimetil sulfóxido (DMSO), ácido clorhídrico al 37%, polietilenglicol 400 (PEG 400) y 2-propanol se adquirieron de Merck (Hohenbrunn, Alemania). Etilenglicol
bis gratis (aminoetiléter) -
tetra
acético (EGTA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 3 - (
N
morfolino) propanosulfónico (MOPS ), cloruro de potasio, potasio dihidrógeno ortofosfato, cloruro de sodio, hidrógeno carbonato de sodio, hidrógeno disódico anhidro ortofosfato, sacarosa y Tris fueron adquiridos Fisher Scientific (Leicestershire, UK). Tiazolilo bromuro de tetrazolio azul (MTT) se adquirió de Amresco (Ohio, EE.UU.). Saline (cloruro de sodio 0,9%) se obtuvo de Duopharma Sdn. Bhd. (Selangor, Malasia). Carbonilo cianuro 3-clorofenilhidrazona (CCCP) se adquirió de Sigma (Steinheim, Alemania). ensayo de proteína de concentrado de colorante reactivo se obtuvo de Bio-Rad Laboratories (California, USA). Complejo I, Complejo II, complejo IV y la enzima sintasa kit de ensayo de la actividad de microplacas ATP se adquirieron de MitoSciences (Oregon, EE.UU.).
Síntesis de Análogos Rosamine
Rosamines se sintetizaron y se purificaron como se ha descrito previamente [11]. El material de partida de ditriflato xantonas se preparó en solución por triflación de los fenoles, seguido de la animación del triflato con piperidina para dar simétrica sustitución aminas cíclicas (Fig. 2A) o por adición gradual de piperidina y morfolina para dar asimétrica sustitución aminas cíclicas ( la Fig. 2B) [11]. El resultado 3,6-diamino-xanten-9-ona se hizo reaccionar con organolitio o reactivos de Grignard para producir las estructuras rosamine deseados.
(A) El material de partida de ditriflato xantonas se preparó en solución por triflación de la fenoles, seguido de la animación del triflato con piperidina para dar simétrica sustitución cíclico o aminas; (B) mediante la adición por etapas de piperidina y morfolina para dar asimétrica sustitución aminas cíclicas.
En general, se añadió un reactivo de Grignard o reactivo de litio (1,0 mmol) gota a gota durante 1 min a la solución de 0,2 mmol de 3,6-diamino-xanten-9-ona en 5 ml de THF a 0 ° C. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a temperatura ambiente. Después de la terminación de la reacción, se añadieron 2 ml de HCl acuoso 2 M, se agitó durante 10 min para inactivar la reacción y se diluyeron con 20 ml de CH
2Cl
2. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre anhidro Na
2SO
4, y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía flash (5% a 10% de MeOH /CH
2Cl
2) para dar el producto puro.
Aquí se enumeran los datos espectrales de los compuestos sintetizados, excepto la síntesis y los datos espectrales para rosamines 1, 2 y 5 fueron como se informó anteriormente [11]. Ellos se nombran a continuación de una forma que describe los
meso
sustituyentes y asume el compuesto es simétrico a menos que se indique lo contrario.
4-bromobenceno Rosamine 3.
1H RMN (300 MHz, CDCl
3) δ 7,72 (d, 2H,
J
= 8,4 Hz), 07/27 a 07/21 (m, 4H), 7,09 (dd, 2H,
J
= 9,6, 2,6 Hz), 6,94 (d, 2H,
J
= 2,6 Hz), 3,74-3,70 (m, 8H), 1,74 (br, 12H);
13C RMN (75 MHz, CDCl
3) δ 158,1, 156,3, 155,0, 132,2, 131,6, 130,9, 130,5, 124,9, 115,0, 113,3, 97,4, 49,1, 25,9, 24,0; λ
abs max 570 nm, λ
max emiss 590 nm, ε 110800 M
-1 cm
-1, FWHM 38 nm, Φ 0,78 ± 0,02 en CH
2Cl
2; HRMS (ESI) m /z calculado para (M-Cl)
+ C
29H
30BrN
2O 501,1542; encontrado 501,1539.
4-clorobenceno Rosamine 4.
1 H RMN (300 MHz, CDCl
3) δ 7,56 (d, 2H,
J
= 8,4 Hz), 7,30 (d, 2H,
J
= 8,4 Hz), 7,26 (d, 2H,
J
= 9,6 Hz), 7,09 (dd, 2H,
J
= 9,6, 2,4 Hz), 6,95 (d, 2H,
J
= 2,4 Hz), 3,74-3,70 (m, 8H), 1,74 (br, 12H);
13C RMN (125 MHz, CDCl
3) δ 158,1, 156,3, 155,1, 136,7, 131,6, 130,8, 130,1, 129,3, 115,0, 113,4, 97,5, 49,2, 25,9, 24,1; λ
abs max 570 nm, λ
max emiss 590 nm, ε 119100 M
-1 cm
-1, FWHM 38 nm, Φ 0,80 ± 0,02 en CH
2Cl
2; HRMS (ESI) m /z calculado para (M-Cl)
+ C
29H
30ClN
2O 457,2047; encontrado 457,2052.
furano Rosamine 6.
1 H RMN (500 MHz, CDCl
3) δ 7,97 (d, 2H,
J = 9,7
Hz), 7,92-7,91 (m, 1H), 7,18 (dd, 2H,
J
= 9,7, 2,6 Hz), 7.15 a 7.14 (m, 1H), 6,90 (d, 2H,
J
= 2,6 Hz), 6,82-6,81 (m, 1H), 3,74-3,72 (m, 8H), 1,76 (br, 12H);
13C RMN (125 MHz, CDCl
3) δ 158,2, 156,0, 147,3, 145,7, 142,2, 132,0, 120,5, 115,0, 113,3, 111,8, 97,5, 49,0, 25,9, 24,1; λ
abs max 592 nm, λ
max emiss 627 nm, ε 86900 M
-1 cm
-1, 105 nm FWHM, Φ 0,38 ± 0,01 en CH
2Cl
2; HRMS (ESI) m /z calculado para (M-Cl)
+ C
27H
29N
2O
2 413,2229; encontrado 413,2232.
asimétrica 4-yodofenil Rosamine 7.
1 H RMN (300 MHz, CDCl
3) δ 7,96 (d, 2H,
J
= 8,3 Hz), 7,35-7,29 (m, 2H), 7.17 a 7.9 (m, 6H), 3,88 (t, 4H,
J
= 4,7 Hz), 3,78-3,71 (m, 8H) , 1,77 (br, 6H);
13C RMN (75 MHz, CDCl
3) δ 158,6, 157,9, 156,9, 156,7, 155,9, 138,2, 131,9, 131,5, 131,1, 131,0, 115,5, 114,6, 114,0, 113,7, 98,6, 97,9, 97,1, 66.4, 49.5, 47.4, 26.1, 24.0; λ
abs max 565 nm, λ
max emiss 586 nm, ε 80900 M
-1 cm
-1, FWHM 39 nm, Φ 0,52 ± 0,02 en CH
2Cl
2; HRMS (ESI) m /z calculado para (M-Cl)
+ C
28H
28in
2O
2 551,1195; encontrado 551,1192.
asimétrica tiofurilo Rosamine 8.
1 H RMN (500 MHz, CDCl
3) δ 7,69 (dd, 1H,
J =
4,8, 1,4 Hz), 7,62 (d, 1H,
J
= 9,7 Hz), 7,59 (d, 1H,
J
= 9,7 Hz), 07.26 a 07.22 (m, 2H) , 7,19 (dd, 1H,
J
= 9,7, 2,5 Hz), 7,09 (dd, 1H,
J
= 9,7, 2,5 Hz), 7,00 (d, 1H,
J
= 2,5 Hz), 6,90 (d, 1H,
J
= 2,5 Hz), 3,78 (t, 4H,
J
= 4,9 Hz), 3,68-3,65 (m , 8H), 1,67 (br, 6H);
13C RMN (75 MHz, CDCl
3) δ 158,1, 157,5, 156,6, 156,3, 149,8, 132,2, 132,0, 131,7, 130,6, 130,6 (dos picos: 130.62, 130.56), 128.2, 115.2, 114.6, 114,3, 114,0, 97,8, 97,2, 66,2, 49,1, 47,2, 25,9, 23,9; λ
abs max 576 nm, λ
max emiss 599 nm, ε 87600 M
-1 cm
-1, FWHM 42 nm, Φ 0,30 ± 0,01 en CH
2Cl
2; HRMS (ESI) m /z calculado para (M-Cl)
+ C
26H
27N
2O
2S 431,1793; encontrado 431,1795.
Cultivo de células y
in vitro
viabilidad celular Ensayo
MCF-7 de carcinoma de mama y HCT-116 líneas celulares de carcinoma de colon se obtuvieron de la American Tissue Culture Collection ( Virginia, EE.UU.) y se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS. HSC-2 células de carcinoma escamoso humano cavidad bucal se obtuvieron de Ciencias de la Salud de Investigación de Recursos del Banco (Japón). HK-1, A previamente caracterizadas células de carcinoma escamoso nasofaríngeo [12] es un regalo por el Prof. Wong Y.C. de la Universidad de Hong Kong. Ambas líneas celulares se cultivaron en medio MEM suplementado con 10% FBS. Para el ensayo de viabilidad celular, las células a 4000 células /pocillo en 80 l de medio se inocularon en placas de 96 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Las células se trataron luego con cada compuesto a concentraciones comprendidas entre 0,001-10 M dando el volumen final de 100 l en cada pocillo. Al final del período de incubación, a 15 l de 5,0 mg /ml de MTT en solución salina tamponada con fosfato (PBS) se añadió y se incubó durante 4 h. MTT Medium y excesivo se aspiró y el formazan resultante se solubilizó con 100 l de sulfóxido de dimetilo. Se leyó la absorbancia a 570 nm con un espectrofotómetro de microplacas SpectraMax M4 (Molecular Devices, CA).
NCI-60 humana tumor línea celular de pantalla
detección panel de células NCI-60 se llevó a cabo por el Instituto Nacional del Cáncer /Institutos nacionales de Salud programa de terapia en desarrollo (Bethesda, EE.UU.). Esta plataforma permite la determinación de los perfiles de inhibidores del crecimiento de compuestos de ensayo en 60 líneas celulares de cáncer humano distintas, lo que representa la leucemia, melanoma y cánceres de pulmón, colon, del sistema nervioso central, ovario, mama, próstata, y subpanel renal. Sulforodamina B de ensayo se utilizó para evaluar la citotoxicidad de agentes de ensayo en un panel de 60 líneas de células [13]. Brevemente, las líneas celulares de tumores humanos del panel de detección de cáncer fueron cultivadas en RPMI 1640 que contenía 5% de FBS y 2 mM L-glutamina. Para un experimento de selección típico, las células se inocularon en 96 placas de microtitulación de pocillos en 100 l a densidades de chapado en función del tiempo de duplicación de líneas de células individuales. Después de la inoculación de células, las placas de microtitulación se incuban a 37 ° C, 5% de CO
2 y 100% de humedad relativa durante 24 h. Después de la incubación, se añadieron alícuotas de 100 l de compuesto a diferentes diluciones a los pocillos de microtitulación apropiados y se incubaron adicionalmente durante 48 h. En el punto final de ensayo, las células se fijaron con ácido tricloroacético seguido de sulforodamina B tinción para el contenido de proteína celular. Sulfordamina B absorbancia se leyó a una longitud de onda de 515 nm como una medida de la densidad celular.
Las mitocondrias aislamiento y solubilización de detergente
mitocondrias funcionales fueron aisladas de hígado de ratón por el método de centrifugación diferencial [14]. Brevemente, un ratón (~ 30 g) se hambre durante la noche antes sacrificados por dislocación cervical. El hígado se recogió inmediatamente y se enjuagó con tampón enfriado con hielo mitocondrias de aislamiento (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA /Tris, 0,2 M de sacarosa, pH 7,4) hasta que libre de sangre. A continuación, el hígado se cortó en trozos pequeños en un vaso de precipitados con unas tijeras mientras se mantiene en un baño de hielo. El tampón se reemplazó con 5 ml de tampón de aislamiento fresco y el hígado se homogeneizó con una sonda de Polytron (Ultra-Turrax T8, Ika-Werke, Alemania) hasta que esté suave. El homogeneizado se centrifugó a 1000 g durante 15 min a 4 ° C. El sedimento se desechó y el sobrenadante se centrifugó a 12.000 g durante 15 min a 4 ° C para sedimentar las mitocondrias. Las mitocondrias se lavaron dos veces por resuspensión en 4 volúmenes de tampón de aislamiento que contiene el inhibidor cóctel 1 × proteasa. La concentración de la proteína mitocondrial se determinó mediante el método de Bradford (ensayo de proteínas Biorad). Las mitocondrias se congelaron en 10 mg alícuota /ml a -80 ° C.
detergente solubilización de las proteínas de las mitocondrias se realizó antes de la medición de la actividad de los complejos de la fosforilación oxidativa. Las mitocondrias se diluyeron a 5,5 mg /ml con PBS y se solubilizaron mediante la adición de un /10a volumen de detergente 1 proporcionado para dar la concentración final de proteína de 5 mg /ml. La mezcla se incubó en hielo durante 30 min y se centrifugó a 17 000 g a 4 ° C durante 20 min. Se recogió el sobrenadante y se diluyó a la concentración apropiada para cada actividad complejos de la fosforilación oxidativa.
Medición de la fosforilación oxidativa Complejos Actividad
Las mediciones de las actividades de fosforilación mitocondrias oxidativos para el Complejo I, II, IV y ATP sintasa se llevaron a cabo usando el kit de ensayo de ELISA de microplacas inmunocaptura de acuerdo con protocolos su respectiva del fabricante [15]. En general, la placa recubierta previamente con anticuerpo apropiado inmunocaptura se incubó con mitocondrias extraen a una concentración recomendada para permitir la inmovilización de sus respectivos complejos. Complejos actividad se midió mediante la adición de mezcla de solución sustratos proporcionado por el kit y se añadió compuesto a una concentración que varía desde 0,01 hasta 10 M por triplicado. Los pocillos de control tratados con sólo el 0,1% de DMSO (v /v) y los pozos sin incubación extracto de las mitocondrias se incluyen como referencia fondo. La cinética de la actividad de los complejos fue grabado con SpectraMax M4 espectrofotómetro lector de microplacas usando los parámetros de medición sugeridas.
JC-1 Análisis del Potencial de membrana mitocondrial
El potencial de membrana mitocondrial se mide con base en el potencial la acumulación dependiente de la catiónico JC-1 tinte que resulta en un cambio de la emisión de fluorescencia de verde (~525 nm) al rojo (~590 nm) debido a la formación de agregados J-[16]. Por lo tanto, la despolarización mitocondrial está indicada por una disminución en la relación de intensidad de fluorescencia roja /verde. Brevemente, se recogieron las células y se suspendieron en 1 ml de medio caliente a aproximadamente 1 × 10
6 células /ml. En un tubo de control, se añadió 1 l de CCCP 50 mM y se incubaron a 37 ° C durante 5 min. Después, se añadieron 10 l de 200 mM JC-1 en las células y se incubaron a 37 ° C durante 30 min. Las células se lavaron dos veces con PBS caliente, se resuspendieron en 500 l de PBS y se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur usando filtros de 488 nm de excitación con 530/30 nm y de emisión de 585/42 nm de paso de banda.
En Vivo
antitumoral eficacia
aloinjertos de tumores se iniciaron por inyección subcutánea de 5 x 10
5 4T1 de ratón de carcinoma de mama en 0,1 ml de medio RPMI 1640 en las inguinales mamarias grasa almohadillas de ratones [17]. El crecimiento tumoral se controló y los tratamientos se iniciaron cuando los tumores alcanzaron volumen de aproximadamente 200 mm
3. Para evaluar la inhibición del crecimiento tumoral, los ratones portadores de tumor 4T1 fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de al menos ocho animales por grupo. Compuesto 5 se preparó a 0,3 mg /ml en solución salina normal y el tratamiento se administró por vía intravenosa a 5 mg /kg en días estadificación o 3 mg /kg cada dos días durante seis tratamientos (q2dx6). Para el grupo de control, se le dio solución salina normal. El volumen del tumor y peso de los animales se midieron tres veces por semana durante 14 d. El volumen del tumor se calculó utilizando la ecuación: (longitud x anchura
2) se calculó /2 y relativa del volumen del tumor (RTV) para cada volumen del tumor en cualquier momento dado (V
T) contra el volumen del tumor en la estadificación día (V
0) usando la ecuación: V
T /V
0. El RTV - perfil de tiempo para cada grupo se representó gráficamente y se determinó retraso del crecimiento tumoral en la consecución de un número especificado de duplicaciones en comparación con el control [18], [19]. Los resultados se expresaron como mediana del intervalo de confianza ± 95% (n = 8).
Análisis estadístico
La significación estadística se realizó mediante ANOVA de una vía
post hoc de Bonferroni
con la prueba (SPSS 16.0, IBM Corporation, Armonk, Nueva York) y la diferencia se considera significativa cuando
P
. & lt; 0,05
resultados y Discusión
Rosamine análogos
Nuestro estudio anterior con
meso
sustituido con 4-yodobenceno 2 y 5 fueron tiofurano 5 veces más activo que el compuesto fenilo sustituido 1. los compuestos 3, 4 y 6 se sintetizaron para probar si
meso
-Reemplazo con 4-bromobenceno 3, 4-clorobenceno 4 o 2-furilo 6 grupos afectarían a la actividad contra el cáncer. Además, la 4-yodobenceno 7 o 2-tiofurano
meso
sustituyentes 8
y sustituyentes de amina de piperidina /morfina asimétricos
se sintetizaron y se investigó. Rosamines 1-4 y 7 no eran por lo que se reconstituyeron en DMSO a 10 mM como tratamiento stock apreciablemente soluble en agua. Rosamines 5, 6 y 8 se solubilizaron fácilmente en medios acuosos a concentraciones similares, por lo que se utilizaron sin DMSO.
In Vitro
antitumoral Eficacia de Rosamine y NCI-60 Pantalla
La
vitro
actividad antitumoral en de rosamines se evaluó usando un ensayo de 48 h la viabilidad celular de punto final methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio bromuro (MTT) contra un panel de líneas celulares de tumores humanos sólidos, incluyendo carcinoma de mama (MCF-7), colon carcinoma (HCT-116), carcinoma de células escamosas oral (HSC-2) y el carcinoma nasofaríngeo (HK-1). El IC
50 valores de estos rosamines a través del panel de líneas celulares de cáncer probado osciló entre 0.07-1.2 M como se resumen en la Tabla 1. A partir de este estudio, que llevan rosamines de haluro de fenilo o heterocíclicos restos fueron significativamente (
P
& lt; 0,05) más potente que el fenilo sustituido rosamine 1. sustitución de haluro resultó en una mejoría de la citotoxicidad; esto era de esperar debido a la sustitución de
H fotos: por haluro se usa comúnmente para aumentar la lipofilia compuesto que mejora la bicapa lipídica de la membrana de permeabilidad [20]. Dentro de la serie de haluro, citotoxicidad aumenta en el siguiente orden gt 4 y; 3 & gt; 2 (Cl & gt; br & gt; I), aunque no fue estadísticamente significativa (
P Hotel & gt; 0,05). Los compuestos con
meso
sustituyentes heterocíclicos 5 y 6 eran más potentes que los haluros aromáticos 2-4. De los dos compuestos con
meso
-heterocycles la tiofurano sustituido 5 fue ligeramente más activa que 6, el furano sustituido con uno.
Los compuestos 7 y 8 tienen una combinación más polar sustituyentes de amina que la simétrica
bis
piperidina 2, y demostraron ser más citotóxica (Tabla 1). Esto es consistente con nuestros datos anteriores para el 2-metilbencenos asimétricamente sustituidos con piperidina y morfolina que mostraron casi 2 veces más baja IC
50 valores en comparación con la estructura hidrófoba simétrico que contiene sólo piperidina [10]. Mientras tanto para el
meso
-thiofuran 5, sustitución de uno de los grupos de piperidina con morfolina da 8, que tiene un poco
disminución de la actividad
, contrariamente a nuestras expectativas.
Rosamines pueden presentar fototoxicidad debido a la generación de especies reactivas del oxígeno en presencia de luz. Para probar esto, una placa duplicada se irradió con 5,3 J /cm
2 de luz de amplio espectro durante 2 h después del tratamiento compuesto en paralelo con una placa mantenida en la oscuridad. No hubo diferencias significativas en la IC
50 valores obtenidos entre ambos experimentos irradiados y no irradiados (datos no mostrados), indicando fototoxicidad no fue un problema.
Sobre la base de las conclusiones anteriores, rosamines 4 ( NSC751819) y 5 (NSC751817) se sometieron a la NCI 60 líneas de células tumorales humanas pantalla para ofrecer más información sobre los perfiles de inhibición del crecimiento contra 60 líneas celulares de cáncer humano diferentes, que representan la leucemia, melanoma y cánceres del pulmón, de colon, del sistema nervioso central ,, mama, próstata, y subpanel renal ovario. Esta plataforma permite que el modo de acción para inferir mediante la comparación con los patrones de fármaco-actividad de agentes estándar con características de orientación conocidos usando COMPARAR (algoritmo de reconocimiento de patrones computarizada) analiza [21]. El IG
50 valores generados a partir de la pantalla del NCI-60 líneas celulares indicó que tanto rosamine 4 y 5 exhiben efectos antiproliferativos potentes con Log
10GI
50 = -7 (GI
50 = 0,1 M) y eran particularmente más eficaz contra una sub-panel de líneas celulares de cáncer colorrectal (Fig. 3). COMPARAR análisis indicaron que estos dos rosamines tenían patrones similares de actividad con violeta de metilo (NSC271967), un colorante de triarilmetano catiónico que se ha utilizado anteriormente en la medicina para su antimicrobiana, propiedades antifúngicas y antihelmínticos. Esta clase de colorantes se ha demostrado para promover la inhibición respiratoria mitocondrial mediante la inhibición de la síntesis de ATP, disipando potencial de membrana mitocondrial y la inducción de transición de permeabilidad mitocondrial [22], [23]. De este modo la pantalla NCI-60 líneas celulares indicada los compuestos ensayados tenían una firma única de agentes contra el cáncer metabolismo de metas de energía.
GI
50 (inhibición del crecimiento del 50%) gráficos de medias que muestran los patrones de actividad de 4, 5 y violeta de metilo (NSC271967) en las tramas de líneas de células NCI-60. Tanto los rosamines mostrado efectos antiproliferativos potentes con Log
10GI
50 = -7 (GI
50 = 0,1 mM) y fueron particularmente más eficaz contra el panel de cáncer colorrectal. COMPARAR análisis indicaron 4 y 5 tienen patrón similar de actividad como el violeta de metilo con Pearson valores del coeficiente de correlación de 0,767 y 0,72, respectivamente.
Rosamines interferido el Redox Energía
Hemos demostrado previamente que rosamines localizan principalmente en la mitocondria [10] y que la acumulación de DLC citotóxico se conocen para alterar potenciales transmembrana mitocondrial [24], [25]. Por lo tanto, alteraciones de potencial de membrana mitocondrial causadas por rosamines 2 y 5 fueron controlados en base a la acumulación de potencial dependiente de JC-1 colorante que resultó en un cambio de la emisión de fluorescencia de verde (~525 nm) al rojo (~590 nm) debido a la formación de J-agregados. A partir del estudio, las células HSC-2 tratados con 2 a 0,1 M, 9% de la población celular mostró la aparición de la transmembrana mitocondrial pérdida potencial dentro de 1 h después del tratamiento y gradualmente aumentado a 19% (
P
& lt; 0,05) en 8 h (Fig. 4). Mientras tanto, la pérdida de potencial de membrana mitocondrial fue más prominente en las células HSC-2 tratados con 5 a 0,1 mM. Aproximadamente el 21% (
P Hotel & lt; 0,05) de la población celular se vio afectada en la primera hora y el porcentaje aumentó drásticamente a 34% en 8 h. Para las células de control sin tratar, la población de células despolarizadas a las 8 h se mantuvo en aproximadamente 8%. Mientras tanto, las células tratadas con 5 M de CCCP por 5 min dio lugar a la pérdida de potencial de membrana en 70% (
P
& lt; 0,05) de la población celular. CCCP es un agente de desacoplamiento de la fosforilación oxidativa, que actúa como control positivo para el experimento.
evento Representante de transmembrana pérdida potencial mitocondrial en las células HSC-2 tratados con 2 y 5 en 0,1 M. Después de 8 h de tratamiento con 2 y 5, el porcentaje de población de células con potencial transmembrana mitocondrial pérdida aumentó a 19% y 34%, respectivamente. La célula despolarizada porcentaje de control no tratado a las 8 h se mantiene en 8%, mientras que para control positivo, las células tratadas con 5 M de carbonilo cianuro 3-clorofenilhidrazona (CCCP) durante 5 min Resultados en la población de células despolarizada 70%. * Diferencia con
P-valor
. & Lt; 0,05 comparado con el control a las 0 h
Para comprender mejor la inhibición mitocondrias ofrecido por los rosamines, se investigó su efecto sobre la vía de la fosforilación oxidativa . El uso de inmunocaptura microplaca de ensayo ELISA, la cinética enzimática de los transportistas redox mitocondrial complejo I, II Complex, complejo IV y ATP-sintasa fueron controlados por tratamiento con 2 o 5. La actividad del complejo II (Fig. 5B) se inhibió parcialmente por 5 con IC
50 valor de 9,6 ± 0,1 M, mientras que para 2, se observó una inhibición pero no alcanzó el 50% hasta concentraciones máximas estudiadas. Mientras tanto, ambos a 2 y 5 muestran la inhibición de la actividad de la ATP sintasa (Fig. 5D) con IC
50 valores de 3,9 ± 0,3 M y 3,0 ± 0,8 mM, respectivamente. La actividad del complejo I y IV Complex (Fig. 5A y 5C) no se vieron afectados por las rosamines en concentraciones de hasta el máximo utilizado, 10 mM. Estos datos sugieren que rosamines 2 o 5 bioenergética mitocondrial compromiso principalmente mediante la inhibición de la ATP sintasa, una enzima de protones impulsada que produce ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico. se observó similares interacción bioquímica en rodamina-123 y se espera que este efecto que el compuesto tiene una estrecha similitud estructural con los rosamines [26].
La inhibición dosis-respuesta de la fosforilación oxidativa mitocondrial Complejo 1 (A), Complex