Extracto
Tanto S100A14 y S100A16 son miembros de la familia de proteínas S100 multifuncional. La formación de homo /heterodímeros se considera que es uno de los principales mecanismos de proteínas S100 para ejecutar sus diversas funciones celulares. Mediante el empleo de una pantalla clásica dos híbridos de levadura (Y-2 H), identificamos S100A16 como la pareja de interacción única de S100A14. Esta interacción se verificó por co-inmunoprecipitación, inmunofluorescencia indirecta y doble doble inmunotinción de especímenes de carcinoma de células escamosas oral y mucosa oral normal. La importancia funcional de esta interacción se examinó mediante el empleo mediada por retrovirus sobre-expresión y knock-down de estas proteínas en varios líneas de células cancerosas. El exceso de expresión y knock-down de S100A14 llevó a arriba concomitante y la baja regulación de la proteína S100A16 en las líneas celulares examinadas. Sin embargo, no había ninguna regulación de S100A16 ARNm en S100A14 sobre-expresión, lo que indica que la modulación de la expresión de S100A16 no se debió a una mayor actividad transcripcional pero posiblemente por la regulación post-transcripcional. Por el contrario, la sobreexpresión de S100A16 se asoció ni con la sobre regulación de mRNA ni su S100A14 proteína, lo que sugiere una regulación unidireccional entre S100A14 y S100A16. tratamiento celular con la síntesis de proteínas cicloheximida inhibidor demostró una degradación intracelular dependiente del tiempo de ambas proteínas S100A16 y S100A14. Además, se encontró que la regulación de la S100A16 y S100A14 degradación para ser independiente de las proteasomal y lisosomales clásicos vías de degradación de proteínas. por lo tanto, serán necesarios más estudios para comprender el significado funcional de esta interacción y los mecanismos sobre cómo S100A14 está implicada en la regulación de la expresión S100A16
Visto:. Sapkota D, DE Costea, Ibrahim SO, CA Johannessen, Bruland O (2013) Interactúa con S100A14 S100A16 y regula su expresión en células de cáncer humano. PLoS ONE 8 (9): e76058. doi: 10.1371 /journal.pone.0076058
Editor: Zhihua Liu, de la Academia China de Ciencias Médicas, China
Recibido: 14 de marzo de 2013; Aceptado: August 20, 2013; Publicado: 27 de septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Sapkota et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por la Universidad de Bergen (fondo de post-doctorado, DS) y la Fundación de Investigación médica de Bergen (DEC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La familia de proteínas S100 es un grupo multifuncional de proteínas de unión a calcio EF-mano. Esta familia consta de pequeñas proteínas ácidas (10-12 kDa) que se expresan sólo en vertebrados de una manera específica de células y tejidos. Hasta la fecha, 25 miembros de proteínas S100 se han descrito en los seres humanos. Los miembros de la proteína S100 se han demostrado para regular una serie de procesos biológicos como la del ciclo celular, la motilidad celular, la transducción de señales, la fosforilación de proteínas, la transcripción, la supervivencia celular y la apoptosis, en relación con el desarrollo normal y la carcinogénesis [1,2]. A pesar de estos diversos roles funcionales, proteínas S100 no poseen ninguna actividad enzimática para dar cuenta de sus actividades celulares [3,4]. Uno de los mecanismos para sus diversas funciones celulares es la capacidad de la mayoría de las proteínas S100 para interactuar directamente con un número de otras proteínas celulares, modulando de esta manera sus funciones [3]. Varios miembros de las proteínas S100 pueden formar homodímeros /oligómeros (por ejemplo: S100A4 [5], S100B [6]) o heterodímeros (por ejemplo: las interacciones entre S100A8 y S100A9 [7], entre S100A4 y S100A1 [8], entre S100B y S100A6 [6]) y estos homo /formación heterodimer- se considera que es importante para sus funciones celulares.
S100A14 es una adición reciente a la familia de proteínas S100 [9,10]. Expresión diferencial de S100A14 ha sido reportado en un número de cánceres humanos [9,11]. Recientemente hemos informado de un papel de S100A14 en la regulación de la proliferación e invasión de carcinomas de células escamosas orales (OSCCs) [12,13]. S100A14 se encontró para modular la expresión de varias moléculas, incluyendo p21, MMP1 y MMP9 en células derivadas-OSCC [12,13]. Además, la función biológica de esta proteína se ha informado en otros cánceres humanos, tales como esófago [14] y los cánceres de colon [15]. Sin embargo, el mecanismo exacto y la señalización molecular de S100A14 en el cáncer humano no se entiende completamente. Al ser predominantemente una proteína membranosa [12] con el sitio de N-miristoilación en el extremo N-terminal [9], se puede especular que S100A14 podría interactuar con otras proteínas potencialmente implicadas en la transducción de señales. En consecuencia, S100A14 se ha demostrado que interactúan de una manera dependiente de calcio con nucleobindin [10], una proteína sugiere que participen en G acoplado a la proteína de transducción de señales [16]. Sin embargo, la capacidad de S100A14 para formar heterodímeros con otras proteínas S100 no se ha examinado. En este estudio, mostramos que S100A14 interactúa con otra proteína S100, la S100A16, y modula su expresión en líneas celulares de cáncer humano.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y tratamientos
Los orales de células escamosas de carcinoma derivado de líneas celulares: CaLH3 [17], H357 [18], VB6 [19] y OSCC1 [13] se cultivaron como se ha descrito anteriormente [12]. células HeLa (ATCC, CCL-2
TM) se mantuvieron rutinariamente en medio de Eagle modificado por Dulbecco (cat no: D6429, Sigma) suplementado con 10% FCS. Todas las líneas celulares se cultivaron en medio ambiente humidificado con 5% de CO
2 a 37 ° C. Veinticuatro horas antes del tratamiento con inhibidores, 1.0x10
5 a 1.5x10
5 células por pocillo en placas de 6 pocillos. Las células se trataron con 0, 50, 100 o 150 mM inhibidor proteosomal MG-132 (cat no: C2211, Sigma) durante 5 y 10 horas; 0, 50, 100 o 150 mM lisosomal cloroquina inhibidor (cat no: C6628, Sigma) durante 24 horas y 200 g /ml de cicloheximida inhibidor de la síntesis de proteínas (cat no:#239763, Calbiochem) durante 0, 3, 5, 7 y 8 horas. Después de los tratamientos, las células se lisaron con tampón RIPA 1X y se utilizaron para la inmunotransferencia. Expresión de la proteína S100A16 se calculó con relación a la expresión de los niveles de GAPDH (utilizando software Gauge Multi, Versión 3.2, Fujifilm Corporation) y se representan como porcentaje de la proteína S100A16 restante después del tratamiento con cicloheximida (datos no mostrados). S100A16 vida media (
t
1/2) se calculó mediante el GraphPad Prism 5.03 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU., www.graphpad.com).
levadura de dos híbridos de pantalla (pantalla de Y-2H)
las secuencias codificadoras de S100A14 humana se fusionaron en el marco con el dominio GAL4 de unión al ADN del vector pGBT9 para generar pGBT9-S100A14 construcción de cebo. servicio de detección Y-2H fue adquirido de Alemán de Investigación del Cáncer Center, Heidelberg, Alemania. En pocas palabras, pGBT9-S100A14 construcción fue co-transfectadas con bibliotecas de cDNA de queratinocitos humanos en
Saccharomyces cerevisiae
. Los clones positivos se identificaron por selección TRP1 en 0 mM 3-aminotriazol. Todos los clones positivos se secuenciaron por secuenciación de Sanger. Los detalles de la construcción de cebo pGBT9-S100A14 y protocolos de cribado Y-2H están disponibles bajo petición.
Co-inmunoprecipitación (Co-IP)
CaLH3 células se lisaron en tampón de lisis frío hielo ( 1X tampón RIPA, cat no: 89901, Pierce Biotechnology), suplementado con proteasa (kit cóctel inhibidor de la proteasa Halt, cat no: 78410, Pierce Biotechnology) y fosfatasa (cóctel inhibidor de fosfatasa 2, gato no p 5726, Sigma) inhibidores. Los extractos celulares se precleared por incubación con Proteína A /G PLUS-agarosa (cat no: sc-2003, Santa Cruz) durante 30 minutos. Quinientos microgramos de extracto celular precleared se incubó con 3 g de conejo policlonal anti-humano S100A14 (nº de cat: 10489-1-AP, Proteintech) o anticuerpo anti-humana S100A16 policlonal de conejo (AP-11456-1, Proteintech) durante 1 horas a 4 ° C en una rueda giratoria en la presencia de mM CaCl
2 o CaCl 2 mM con mM EDTA
2 5 0-2. Sólo lisado (sin anticuerpo) y el anticuerpo anti-MMP9 policlonal (cat no: sc-10737, Santa Cruz; isotipo IgG) se utilizaron como controles para el Co-IP. A partir de entonces, 70 l de resuspendido proteína A /G PLUS-agarosa (cat no: sc-2003, Santa Cruz) se añadió a la mezcla de lisado-anticuerpo y se incubó durante la noche a 4 ° C en una rueda giratoria. Después de la incubación, las perlas se centrifugaron a 1000xg durante 5 minutos a 4 ° C y el sobrenadante se descartó. Las perlas se lavaron 4 veces con PBS, se resuspendieron y se hierven a 90 4 ° C durante 5 min en 30 l de tampón de muestra SDS y a inmunotransferencia con policlonal de conejo anti (11456-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, EE.UU., 1 S100A16 humano- : 500 diluciones) o anticuerpo policlonal de conejo anti-humana S100A14 (AP-10489-1, Proteintech, 1: 1000 diluciones) guía
Construcción y transfección de vectores de expresión y shRNA
S100A14 vector de expresión. se construyó como se describe anteriormente [12]. cDNA humano que codifica S100A16 se amplificó usando pares de cebadores (F: 5 '-ATCCCGCGGCAGGGAGATGTCAGACTGCTA-3' y R: 5'-TGAGGATCCCTAGCTGCTGCTCTGCTG-3 ') y se subclonó en el vector de expresión retroviral pRetroX-IRES-ZsGreen1 (Clontech Laboratories, Inc., CA , ESTADOS UNIDOS). shRNA orientación
S100A14
ARNm se construyó utilizando los siguientes oligonucleótidos: shRNA1 (F: 5 'GATCCCCTTGTGTAAGAGCCAAAGAATTCAAGAGATTCTTTGGCTCTTACACAATTTTTGGAAA-3'; R: 5'-AATTTTTCCAAAAATTGTGTAAGAGCCAAAGAATCTCTTGAATTCTTTGGCTCTTACACAAGGG-3 '), shRNA2 (F: 5'-GATCCCCAGGGTCTTTAAGAACCTACTTCAAGAGA GTAGGTTCTTAAAGACCCTTTTTTGGAAA- 3 '; R: 5'-AATTTTTCCAAAAAAGGGTCTTTAAGAACCTAC TCTCTTGAAGTAGGTTCTTAAAGACCCTGGG-3'), shRNA3 (F: 5'-GATCCCCGAACCTACTTCCTAATCTCTTCAAGAGAGAGATTAGGAAGTAGGTTCTTTTTGGAAA-3 '; R: 5'-AATTTTTCCAAAAA GAACCTACTTCCTAATCTCTCTCTTGAAGAGATTAGGAAGTAGGTTCGGG-3'). Los oligonucleótidos fueron recocidos y se insertan en el RNAi-Ready-Psiren RetroQ-DsRed-Express vector de expresión (cat. No: 632487, Clonetech). shRNA orientación
lacZ
gen se utilizó como control para la S100A14-shRNAs. líneas celulares de cáncer fueron infectadas con los retrovirus derivados de células de empaquetamiento (Phoenix A), clasificado (GFP /DsRed como un marcador), propagada, verificado por la sobre expresión y desmontables de las respectivas proteínas y se utilizan para ensayos funcionales.
la extracción de RNA, síntesis de cDNA y cuantitativos RT-PCT (QRT-PCR)
ARN total fue extraído de las líneas celulares de cáncer utilizando RNeasy protocolo de tejido fibroso mini kit (cat no: 74704, Qiagen Inc. , Valencia, CA, EE.UU.). Siguiendo las instrucciones del fabricante, a 600 nanogramos de ARN total fue convertido a cDNA utilizando el sistema de alta capacidad de cDNA Archivo Kit (nº de catálogo: 4368814, Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Todas las amplificaciones QRT-PCR se realizaron en ABI Prism 7900 Sequence Detector HT (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.) como se describe anteriormente [12]. ensayo TaqMan para
S100A16 gratis (Hs00293488_m1) y verde SYBR basado QRT-PCR (utilizando los mismos pares de cebadores que para la construcción del vector de expresión de S100A14) se realizó para cuantificar
S100A16
y
S100A14
ARNm en las líneas celulares de cáncer. Comparativo 2
método -ΔΔ Ct se utilizó para cuantificar la expresión de mRNA relativa.
inmunotransferencia
Veinte y cinco a cuarenta g de proteína se resolvió en NuPAGE® Novex 4-12% o el 10 % Bis-TrisTris gel (Life Technologies, NY, EE.UU.) en NuPAGE® MOPS /MES SDS funcionamiento de amortiguación (Life Technologies, NY, USA) y immunoblotted con conejo policlonal anti-humano S100A14 (AP-10489-1, Proteintech, Chicago, IL, EE.UU., 1: 1000 diluciones), policlonal de conejo anti-humana S100A16 (AP-11456-1, Proteintech, Chicago, IL, EE.UU., 1: 500 diluciones monoclonal de ratón) y anti-p53 humana (sc-263, Santa Cruz Biotecnologías, CA, EE.UU., 1: 1000 diluciones) siguiendo el protocolo de transferencia Western estándar. se utilizó como control de carga: Anti-GAPDH (5000 diluciones sc-25778, Santa Cruz, 1). Las transferencias se visualizaron utilizando un aumento de quimioluminiscencia (Supersignal
® West Pico; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE.UU.) y las imágenes fueron detectados en un escáner Fujifilm Las-4000
Doble inmunofluorescencia indirecta (DIF)
el uso de OSCCs y su correspondiente mucosa normal para el DIF y la inmunohistoquímica fue aprobado por el Comité regional de Medicina y Salud Ética de la Investigación, Western-Noruega. Se obtuvo consentimiento escrito del participante del estudio. Cinco micras secciones de OSCCs y las correspondientes mucosas normales fueron de-con parafina, rehidratadas siguiendo los procedimientos estándar y recuperación del epítopo inducida por calor se llevó a cabo en tampón Tris-EDTA (pH 9,0) mediante el uso de microondas (cat no: NN-L564W, Panasonic, Osaka , Japón). Después, primero anticuerpo primario (anticuerpo policlonal de conejo anti- S100A16, 11456-1-AP, Proteintech, diluciones 1:50) se aplicó durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavó. Las muestras se incubaron con el fragmento Fab de cabra anti-IgG de conejo (cat no 111-007-003, Jackson ImmunoResearch, diluciones 1:50) durante 2 horas, para permitir la conmutación de la IgG de conejo de cabra a Fab [20]. A partir de entonces, las muestras se incubaron con anti-ratón GoatDyLight 488IgG (cat no 205-485-108, Jackson ImmunoResearch, diluciones 1:50) anticuerpo secundario durante 1 hora, se lavaron, se bloquearon con suero de cabra al 10% durante 1 hora y el segundo anticuerpo primario , policlonal de conejo anti-S100A14 (cat no: 10489-1-AP, Proteintech, 1: 600 diluciones), se aplicó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, el anticuerpo secundario de cabra anti-conejo Alexa Fluor
® 568 (cat no: A-11011, Invitrogen, 1: 200 diluciones) se aplicó durante 1 hora, se lavó y los portaobjetos se montaron en prolongar
® Gold antifade reactivo con DAPI (nº de cat: P36935, Invitrogen). Las muestras fueron examinadas usando Leica TCS SP2 AOBS (Leica Microsystems, Alemania) microscopio láser confocal.
simple y doble inmunohistoquímica (IHC)
simple y doble IHC se realizaron en las secciones seriadas de OSCCs y las correspondientes mucosas normales. IHC único para S100A16 y S100A14 se llevó a cabo como se describe anteriormente [12]. Por doble IHC, se-con parafina des cinco micras secciones, rehidratada siguiendo los procedimientos estándar y recuperación del epítopo inducida por calor se llevó a cabo en tampón Tris-EDTA (pH 9,0) mediante el uso de microondas (cat no: NN-L564W, Panasonic, Osaka, Japón) . Después de bloquear con el bloque de peroxidasa y suero de cabra al 10%, las secciones se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-S100A16 (cat no: 11456-1-AP, Proteintech, las diluciones 1: 200) durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó y secundario anti-conejo anticuerpo conjugado con polímero marcado con peroxidasa de rábano (nº de cat: K4011, Dako, Golstrup, DK) se aplicó y la reacción se visualizó usando IMMPACT VIP (cat no: SK-4605, Vectorlabs, California, EE.UU.) como sustrato de la enzima, lo que resulta en una producto de reacción de color púrpura. Para evitar la reactividad cruzada con la reacción inmunohistoquímica subsiguiente, los anticuerpos de las primeras reacciones se desnaturalizaron por calentamiento de las muestras en pH 6.0 Objetivo de Recuperación de Buffer (cat no: S1699, DAKO, Golstrup, DK) utilizando microondas (1.000 vatios durante 2 minutos y 250 vatios para cinco minutos y medio; NN-L564W, Panasonic, Osaka, Japón) [21]. Posteriormente, las secciones se incubaron con peroxidasa de bloque y suero de cabra al 10% una vez más y el segundo anticuerpo primario (policlonal de conejo anti-S100A14, 10489-1-AP, Proteintech, diluciones 1: 1400) se aplicó y se lavó. A partir de entonces, anti-anticuerpo secundario de conejo conjugado con polímero marcado con peroxidasa de rábano picante (cat no: K4011, Dako, Golstrup, DK) se aplicó y se visualizó con IMMPACT SG (cat no: SK-4705, Vectorlabs, California, EE.UU.), resultando en un gris producto de reacción. Las muestras fueron counterstained con hematoxilina (nº de cat: S3301, DAKO, Golstrup, DK), se deshidrataron y se montaron con medio de montaje EuKit. Las muestras fueron examinadas usando el microscopio Leica DMLB.
Estadísticas
Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). Para los análisis estadísticos, Student's-
t
prueba (emparejado) se realizó utilizando GraphPad Prism 5.03 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU., www.graphpad.com), con el nivel de significación de 5% .
Resultados
S100A16 fue identificado como un compañero de interacción de S100A14 tanto
in vivo
en las células de levadura y
in vitro
en el cáncer- orales células derivadas
Para identificar socios que interactúan de S100A14, una biblioteca de cDNA de queratinocitos humanos se proyectó con el cebo pGBT9-S100A14 construyen en
Saccharomyces cerevisiae
. De 54 clones positivos secuenciados, S100A16 humano fue identificado 53 veces. DCAF8 se identificó como un socio interacción positiva falsa de S100A14. La interacción entre las proteínas S100A14 y S100A16 se verificó por co-inmunoprecipitación usando el cáncer oral derivado CaLH3 línea celular (Figura 1A). Aunque los informes anteriores mostraron una mayor interacción entre las otras proteínas S100 en presencia de aumento de Ca
2 + concentraciones, no hemos podido detectar el aumento de inmunoprecipitación entre S100A14 y S100A16 con el aumento de Ca
2 + concentraciones (0,5 y 2 mM de CaCl
2) (Figura 1A). Sin embargo, no se observó interacción entre la S100A14 y S100A16 cuando se utilizó 5 mM de metal divalente EDTA quelante de iones a lo largo con 2 mM de CaCl
2 (Figura 1A). ensayo de co-inmunoprecipitación inversa usando anticuerpo específico para S100A16 confirmó además la interacción entre S100A14 y S100A16 proteínas (Figura 1B).
Quinientos microgramos de extracto de células pre-aclarado a partir de células CaLH3 se incubó con anticuerpo anti-S100A14 en la presencia de mM CaCl 0-2
2 o 2 CaCl mM
2 con EDTA 5 mM (A) o anti-S100A16 anticuerpo (B), seguido de incubación con proteína A /G PLUS-agarosa. Los complejos inmunes se inmunotransferencia con anti-S100A16 (A) o el anticuerpo anti-S100A14 (B). Sólo lisado (sin anticuerpo) y el anticuerpo anti-MMP9 se utilizaron como controles para el Co-IP. (A) M, marcador de peso molecular; carril 1, de entrada; carril 2, sólo el lisado; carril 3, el control de anticuerpo anti-MMP9; carriles 4-7 (anti-anticuerpo S100A14): carril 4, 0 mM CaCl
2; carril 5, 0,5 mM CaCl
2; carril 6, CaCl 2 mM
2; carril 7, CaCl 2 mM
2 con EDTA 5 mM. (B) el carril 1, de entrada; carril 2, sólo el lisado; carril 3, el control de anticuerpo anti-MMP9; carril 4, anti-anticuerpo con S100A16 0 mM CaCl
2.
S100A14 co-localiza con S100A16 de especímenes de OSCCs y la mucosa oral normal
DIF y doble IHC eran realizan en OSCCs y las correspondientes mucosas normales para examinar la localización subcelular de la S100A14 y S100A16. DIF mostró membranosa co-localización de las proteínas S100A16 y S100A14 en las células epiteliales tanto de mucosa oral normal (Figura 2A1-A4) y OSCC (Figura 2B1-B4). Paralelamente a estos resultados, membranosa co-localización de estas proteínas también se observó en las secciones seriadas de mucosa oral normal (Figura 2C1-C3) y en la isla invasora de CCCA (lesión bien diferenciado) (Figura 2D1-D3) por sola y doble IHC.
localización celular de S100A14 y S100A16 se examinó mediante la realización de DIF y IHC en las secciones de formalina fijo y OSCC embebido de parafina y tejidos de la mucosa oral normal. Predominantemente localización membranosa de S100A16 (verde), S100A14 (rojo) y S100A16 /A14 (amarillo) se visualizó en las células epiteliales de la mucosa normal (A1-A4) y OSCC (B1-B4) tejidos por DIF (Epth, epitelio; CT , tejido conectivo). Del mismo modo, con IHC simple y doble en las secciones de serie, la expresión predominantemente membranosa de S100A16 (púrpura), S100A14 (gris) y S100A16 /A14 (color mezclado) se detectó en la mucosa normal (C1-C3) y en la CCCA (D1 -D3).
proteína S100A16, pero no la expresión del ARNm está regulada por S100A14 en diferentes líneas celulares de cáncer humano
la importancia biológica de la interacción entre S100A14 y S100A16 a continuación se examinó por sobre-expresión de S100A14 en un número de líneas celulares de cáncer humano (CaLH3, VB6, H357, OSCC1 y HeLa) utilizando una estrategia de la expresión génica mediada por retrovirus. Se encontraron niveles de proteína S100A16 ser aumentado en todas las líneas celulares examinados después de la expresión sobre-de S100A14 (Figura 3A). Además, shRNA mediada derribo de S100A14 se asoció con la supresión de la proteína S100A16 en CaLH3 y OSCC1 líneas celulares (Figura 3B). Sin embargo, no hubo un aumento en los niveles de expresión de ARNm de S100A16 en estos S100A14 que sobre-expresan el cáncer de líneas celulares (Figura 3C).
(A) mediada por retrovirus sobre-expresión de S100A14 se asoció con arriba concomitante regulación de la proteína S100A16 en CaLH3, VB6, H357, OSCC1 y líneas celulares HeLa (-, construcción de control; +, S100A14 construcción de expresión). (B) Además, shRNA mediada knock-down de S100A14 en CaLH3 y OSCC1 líneas celulares se asoció con baja regulación de la proteína S100A16 (-, construcción de control; +, S100A14 shRNA construye). (C) Sin embargo, no hubo ningún efecto en los niveles de expresión de ARNm de
S100A16 fotos: por sobre-expresión de S100A14 en CaLH3, VB6 y H357 líneas celulares.
S100A14
y
S100A16
los niveles de expresión de ARNm se normalizaron a
GAPDH
la expresión del ARNm. Las barras de error representan SEM de 3 réplicas biológicas realizadas en 3 repeticiones técnica. Student's-
t
prueba (emparejado) se llevó a cabo para el análisis estadístico.
S100A16 no regula la expresión de
S100A14
ARNm o proteína en el cáncer humano por células líneas
a continuación examinó si S100A16 sobreexpresión también se asocia con el cambio concomitante en la expresión de S100A14 en líneas celulares de cáncer. No hubo ningún cambio apreciable ni en el mRNA (Figura 4A) ni los niveles de proteína (Figura 4B) de S100A14 siguientes la expresión sobre-de S100A16 usando construcciones de expresión retrovirales.
No hubo efecto en el ARNm (A) o proteína (B) niveles de expresión de S100A14 por mediada por retrovirus sobre-expresión de S100A16 en CaLH3 y H357 líneas celulares (-, construcción de control; +, S100A16 construcción de expresión).
S100A14
y
S100A16
los niveles de expresión de ARNm se normalizaron a
GAPDH
la expresión del ARNm. Las barras de error representan SEM de 3 réplicas biológicas realizadas en 3 repeticiones técnica. Student's-
t
prueba (emparejado) se llevó a cabo para el análisis estadístico.
Tanto las proteínas S100A16 y S100A14 se degradan de forma intracelular por el mecanismo (s) independiente de proteasomal lisosomales y vías
Uso cycloheximide tratamiento, se observó la degradación dependiente del tiempo de S100A16 y S100A14, tanto en el control y la S100A14 sobre-expresión de células CaLH3 (Figura 5A). No había una diferencia significativa en la vida media de S100A16 (
t
medio) entre el control y la S100A14 sobre-expresión de células CaLH3 (~ 4,8 horas frente a ~ 5,0 horas) (Figura 5A). Proteasomal y lisosomales vías están implicadas en la degradación de la mayoría de las proteínas intracelulares. El inhibidor de proteasoma MG-132 bloquea eficazmente la actividad proteolítica del proteasoma [22] y la cloroquina inhibe inhibidor lisosomal hidrolasas lisosomales mediante la reducción de la acidificación de endosomal /compartimentos lisosomales [23]. Al tratar las células HeLa con CaLH3 y proteasomal (MG-132) y los inhibidores lisosomales (cloroquina), el próximo examinó si estas vías estaban implicados en la degradación de S100A16. No se observó ningún aumento apreciable de los niveles de S100A16 después de la inhibición de la proteasomal (datos para el tratamiento de 10 horas con MG-132 no se muestra) (Figura 5B) o de las vías lisosomales (Figura 5C). El nivel de p53, que se utiliza como control positivo para los experimentos de inhibición proteasomal, se aumentó como se esperaba con el tratamiento MG-132 (Figura 5B). Además, no se observó una apreciable sobre regulación de S100A16 y S100A14, ya sea en el control o en el S100A14 sobre-expresión de las células CaLH3 con MG-132 (Figura 5D) o tratamientos de cloroquina (Figura 5E).
(A ) células CaLH3 que sobre-expresan control y S100A14 se trataron con la síntesis de proteínas cicloheximida inhibidor en un transcurso de tiempo (0, 3, 5, 7 y 8 horas) y los extractos celulares totales se inmunotransfirieron con anti-S100A16 y -S100A14 anticuerpos. expresión S100A16 relativa (normalizada a la expresión de proteínas GAPDH) se representó frente a tiempo de curso y la vida media (
t
medio) se calculó para ambos el control y la S100A14 sobre-expresión de células CaLH3 (datos no mostrados). -, Construcción de control; +, S100A16 construcción de expresión. Cyclo, cicloheximida.
(B) CaLH3 y HeLa líneas celulares se trataron con varias concentraciones de inhibidor proteasomal MG-132 (0 a 150 mM) durante 5 y 10 horas (datos de 10 horas no presentados) y lisados de células enteras se inmunotransfirieron con anti-S100A16 y -p53 anticuerpos. El tratamiento con MG-132 se asocia con la regulación de p53 (utilizado como control positivo para los experimentos de inhibición proteasomal), pero no en ambos S100A16 las líneas celulares.
(C) CaLH3 y HeLa líneas celulares fueron tratados con varias concentraciones de cloroquina inhibidor lisosomal (0-150 mM) durante 24 horas y los lisados de células enteras se inmunotransfirieron con anticuerpo anti-S100A16. tratamiento cloroquina no está asociado con el cambio en la expresión S100A16 tanto en las células de las líneas. Concentraciones superiores a 50 mM de cloroquina resultó en la muerte de células HeLa excesiva y por lo tanto no se utilizan en el experimento. Cloro, cloroquina.
(D) Control y S100A14 sobre-expresión de células CaLH3 fueron tratados con varias concentraciones de inhibidor proteasomal MG-132 (0 a 150 mM) durante 5 horas y los lisados de células enteras se sometieron a inmunotransferencia con anti S100A16 y -S100A14 anticuerpos
.
(e) control y S100A14 sobre-expresión de células CaLH3 fueron tratados con varias concentraciones de cloroquina inhibidor lisosomal (0-150 mM) durante 24 horas y los lisados de células enteras se sometieron a inmunotransferencia con anti S100A16 y -S100A14 anticuerpos. Cloro, cloroquina.
Discusión
A pesar de los diversos roles funcionales jugados por las proteínas S100, estas proteínas no poseen ninguna actividad enzimática para dar cuenta de sus diferentes funciones celulares [3,4 ]. Uno de los mecanismos por los que las proteínas S100 llevan a cabo sus funciones celulares variados es a través de la interacción con y la modulación de las funciones de otras proteínas efectoras. Recientemente, hemos [12,13] y otros [14,15] han demostrado un papel funcional de S100A14 en la carcinogénesis humana. Participación de S100A14 en la regulación de la proliferación de células de cáncer oral y la invasión, por modulación de la expresión de varias moléculas, incluyendo p21, MMP1 y MMP9, se informó a los recientes estudios [12,13]. Estos resultados nos llevaron a investigar los posibles socios de la interacción de S100A14, que podrían modular sus funciones celulares. El uso de la pantalla Y-2H, hemos identificado S100A16, otro miembro de la familia de proteínas S100, como el único compañero de interacción verdadera de S100A14. Este hallazgo fue sorprendente por varias razones. En primer lugar, teniendo en cuenta sus múltiples funciones en la tumorigénesis con la modulación concomitante de la expresión de varios otras moléculas, se esperaba que S100A14 para interactuar con muchas proteínas celulares para ejecutar sus diversas funciones. En segundo lugar, la presencia de sitio de N-miristoilación en el extremo N-terminal de la proteína S100A14 sugiere que esta proteína puede interactuar con otras proteínas potencialmente implicados en la transducción de señales [9]. En tercer lugar, S100A14 ya se ha demostrado que la interacción con otras proteínas celulares, tales como nucleobindin [10] y la rabia [14], pero estas proteínas no se detectaron en la pantalla actual Y-2H. Sin embargo, los hallazgos de nuestra actual pantalla de Y-2H son consistentes con anteriores pantallas de Y-2H para diferentes proteínas S100. Similares a nuestros hallazgos, interactuando socios de otras proteínas S100 desde las pantallas anteriores Y-2H también están dominados en gran medida por la isoforma de proteína S100 (s) (revisado en 24). Una de las razones sugeridas para S100 isoforma interacción dominado en Y-2H podría ser una función de estrechamente controlada Ca intracelular
2 + concentración (200 nM) en células de levadura [25], que es muy inferior a la de calcio
K
d valores de muchas proteínas S100 (10-50 m) y que podría limitar la interacción entre S100 presas y sus compañeros de interacción no-S100 que requieren un estricto Ca
2 + concentración para la interacción tenga lugar. Sin embargo, en contraste con muchas otras proteínas S100, análisis estructurales han sugerido que tanto la S100A14 y S100A16 son de baja afinidad Ca
2 + aglutinantes de iones con un mínimo de cambios conformacionales después de la unión con Ca
2 + [26,27] y por lo tanto estricta Ca
2 + concentración podría no ser necesario para la interacción entre estas dos proteínas. De hecho, al aumentar el Ca
2 + concentración, no se observó aumento de la inmunoprecipitación entre S100A14 y S100A16 en el estudio actual (Figura 1A). Sin embargo, no se detectó interacción entre S100A14 y S100A16 cuando se utilizó 5 mM de metal divalente EDTA quelante de iones (Figura 1A). En conjunto, estos resultados sugieren que la interacción entre S100A14 y S100A16 depende de los niveles basales de Ca
2 + y, posiblemente, otros iones de metales divalentes en las células y el aumento de la concentración de Ca
2 + no aumenta necesariamente la posiblemente debido a la interacción tanto S100A14 y S100A16 son pobres Ca
2 + aglutinantes con semiabierto conformación incluso en estado apo y esta conformación no necesariamente podría cambiar incluso después de Ca
2 + iones de unión.
consistente con los hallazgos de y-2H y co-inmunoprecipitación, se observó co-localizada expresión de S100A14 y S100A16 en los OSCCs y mucosa normal (Figura 2) correspondiente, indicando una posible importancia funcional de esta interacción. De hecho, la sobre expresión y knock-down de S100A14 en varias líneas celulares de cáncer se asoció con arriba concomitante y la baja regulación de la proteína S100A16 (Figura 3A y B), pero no ARNm (Figura 3C). Estos hallazgos indican que la S100A14 regula la expresión de S100A16 no a nivel transcripcional, pero posiblemente por el post-transcripcional o la regulación de traducción. Por el contrario, no se observó ningún efecto apreciable tanto en el ARNm y los niveles de proteína de S100A14 cuando S100A16 estaba sobreexpresado en el cáncer de líneas celulares (Figura 4A y B), lo que sugiere una regulación unidireccional entre S100A14 y S100A16 donde sólo S100A14 regula la abundancia de proteínas de S100A16. Similar a la S100A14, estudios recientes han demostrado la expresión diferencial de S100A16 en diferentes tumores malignos humanos, lo que sugiere un papel de esta proteína en los cánceres humanos [28]. Teniendo en cuenta el papel de la S100A14 en la proliferación de células de cáncer oral y la invasión [12,13] y su capacidad para regular la expresión de S100A16, se puede especular que el heterodímero S100A14 \\ S100A16 podría tener un significado funcional en células de cáncer humano.
Después de haber observado un aumento sólo en la proteína S100A16 y no en
S100A16
cuando la expresión del ARNm S100A14 fue sobre-expresado en las células cancerosas, especuló que S100A14 podría estar implicada en la regulación de la degradación de la proteína S100A16.