Extracto
activación aberrante y estado de la mutación de las proteínas de la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) /Akt /objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR) y la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) vías de señalización han sido relacionado con la tumorigénesis en diversos tumores incluyendo el carcinoma urotelial (UC). Sin embargo, la terapia anti-tumor con inhibidores de molécula pequeña contra mTOR resultó ser menos éxito del esperado. Nos caracteriza el mecanismo molecular de esta vía en el carcinoma urotelial interfiriendo con diferentes componentes moleculares utilizando inhibidores químicos pequeños y la tecnología de siRNA y efectos analizados en el estado de activación molecular, el crecimiento celular, la proliferación y la apoptosis. En la mayoría de las líneas celulares ensayadas se observó la activación constitutiva de la PI3K. La manipulación de mTOR o expresión o la actividad de Akt sólo se regula la fosforilación de S6K1 pero no 4E-BP1. En su lugar, nos proporcionan la prueba de una alternativa mTOR regulación dependiente de PI3K independiente, pero de 4E-BP1. Sólo la inhibición simultánea de S6K1 y 4E-BP1 suprimió el crecimiento de células de manera eficiente. Diafonía entre PI3K y la vía de señalización MAPK está mediada por PI3K e indirecta por la actividad S6K1. La inhibición de MEK1 /2 da como resultado la activación de Akt, pero no mTOR /o S6K1 4E-BP1. Nuestros datos sugieren que 4E-BP1 es una potencial nueva molécula diana y la estratificación marcador para la terapia contra el cáncer en la Universidad de California y apoyan la consideración de un enfoque multi-dirigido contra PI3K, mTORC1 /2 y MAPK
Visto:. Nawroth R, F Stellwagen, Schulz WA, Stoehr R, Hartmann A, Krause BJ, et al. (2011) S6K1 y 4E-BP1 son independientes Regulado y control celular El crecimiento en el cáncer de vejiga. PLoS ONE 6 (11): e27509. doi: 10.1371 /journal.pone.0027509
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Agosto 2011; Aceptado: October 18, 2011; Publicado: 15 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Nawroth et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por la Fundación Siegfried Gruber. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es en todo el mundo el quinto cáncer más común con un estimado de 357.000 nuevos casos y 145.000 muertes en 2010 [1]. carcinoma urotelial (UC) que representa 90% de todos los tumores de vejiga son una entidad heterogénea compuesta de tumores papilares y carcinomas invasivos sólidos que requieren un tratamiento radical, una vez que han progresado en la capa muscular de la vejiga. Si no se trata, aproximadamente el 85% de los pacientes con tumor de vejiga invasivo morirán de progresión de la enfermedad dentro de los dos años desde el diagnóstico [2]. La cistectomía radical con linfadenectomía pélvica es el tratamiento estándar para el cáncer vesical infiltrante. Con este enfoque a 5 años las probabilidades de supervivencia libre de progresión de 65-68% se puede lograr a través de todas las fases del tumor [3], [4]. A pesar de los avances en la quimioterapia basada en cisplatino para pacientes con enfermedad metastásica, el tiempo de supervivencia global a 5 años la mediana se limita a 14-15 meses [5]. Por lo tanto, los nuevos enfoques terapéuticos son altamente deseables. Un mejor conocimiento acerca de la activación aberrante de las vías de señalización celular que están implicados en la tumorigénesis de la vejiga podrían proporcionar dianas moleculares adecuados para las terapias innovadoras [6], [7], [8]. Uno de tales vía es la vía de señalización de PI3K /Akt /mTOR que se ha relacionado con la tumorigénesis en muchos tejidos [9], [10].
Normalmente, tras la activación por tirosina quinasas receptoras o proteínas RAS PI3K convierte fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP
2) en phosphatidylinsositol-3,4,5-trifosfato (PIP
3). Esta reacción puede ser revertido por el antagonista PI3K PTEN (fosfatasa y homólogo de tensina suprimido en el cromosoma 10). PIP
3 PDK1 reclutas (quinasa dependiente de la proteína 1) a la membrana celular donde se une y fosforila Akt en T308 residuo de aminoácido. Akt es considerado como el nodo de señalización más crítica en esta vía la regulación de diversos sustratos que afectan a los procesos celulares implicados en el control del crecimiento celular y la supervivencia [11]. la señalización de Akt converge a través de las proteínas de la esclerosis tuberosa medio (TSC1 /2) y la pequeña GTPasa Rheb en mTOR, una serina /treonina quinasa que forma dos complejos de proteínas distintas, ya sea con raptor (proteína reguladora asociada de mTOR) dando mTORC1 o Rictor (rapamicina compañero insensible de mTOR) produciendo mTORC2 [10]. mTORC2 puede ser activado por PI3K directamente y fosforila Akt en S473, que junto con la fosforilación en T308 resulta en la activación completa de Akt [12], [13]. Akt fosforilada en S473 se ha asociado con un mal pronóstico en muchos tipos de cáncer, incluidos los del páncreas, hígado, próstata y de mama [13]. Los sustratos mejor definidas de mTORC1 son las quinasas p70S6K1 (S6K1) y proteína de unión eIF4E-1 (4E-BP1), ambos de los cuales son importantes en el control de iniciación de la traducción de proteínas [14], [15], [16]. Desfosforilado 4E-BP1 puede unirse al complejo de proteínas elF4E para evitar traducción cap-dependiente y juega un papel importante en la mediación de eventos de señalización de la vía PI3K y MAPK en tumores [15]. Fosforilada S6K1 se requiere para la traducción de 5 'terminal de oligopyrimidine ARNm (TOP). La desfosforilación de los resultados de S6K1 en un bucle de retroalimentación que da como resultado la regulación positiva de los receptores de tirosina quinasas o proteínas sustrato receptor de insulina (IRS), que luego activan la PI3K y también la señalización de MAPK vía [17], [18]. Diafonía entre la PI3K y la red de señalización MAPK se produce también a través de RAS y ERK1 /2, la activación de PI3K y, además, a través mTORC1 TSC1 /2 [19], [20], [21], [22].
mTORC1 se puede inhibir selectivamente por rapamicina, un antibiótico macrólido, que en un complejo con FKBP12 la proteína citosólica inhibe mTORC1 y en concentraciones más altas también mTORC2 [23], [24]. inhibidores de mTOR novedosos en uso clínico como everolimus (RAD001) o temsirolimus (CCI-779) son derivados de rapamicina. Administrado como fármacos anti-tumorales, las tasas de respuesta en los pacientes difieren 0-30% depende de la del tumor [25]. Se sospecha que la principal limitación en la aplicación clínica de mTOR inhibidores de resultados desde el bucle de realimentación mTORC1-S6K1-PI3K. Esto resultó en el desarrollo de inhibidores que se dirigen a ambos, PI3K y mTOR, tales como NVP-BEZ235 una imidazo [4,5-c] quinolina derivado [24].
En UC, alteraciones genéticas en la vía PI3K son comunes y ocurren principalmente en PIK3CA, PTEN, Akt o TSC1 /2 [26]. deleciones y mutaciones PTEN, así como la expresión de proteínas disminuido se encuentran sobre todo en las etapas de tumores mayores y grados. Fosforilada S6K1 es un predictor independiente de la supervivencia específica de la enfermedad [27], [28]. En estudios preclínicos con líneas celulares de la UC, la inhibición de PI3K por LY294002 mostró depende de la línea celular utilizada mínima al 40% de reducción en los efectos proliferativos y bloqueó la invasión de células [29], [30], [31]. Reconstitución de PTEN suprimió el crecimiento del tumor y el silenciamiento genético de Akt consecuencia un aumento de la radiosensibilidad de las células tumorales [27], [32]. La aplicación potencial de los derivados de rapamicina en la terapia UC fue apoyada por su capacidad para reducir la viabilidad celular en diversas líneas de células de cáncer derivadas de la vejiga y en un modelo de ratón de cáncer de vejiga progresivo en el que p53 y PTEN se eliminan en el urotelio de la vejiga [9], [33], [34], [35], [36]. A pesar de estas observaciones preclínicos prometedores, los resultados preliminares de un solo brazo, la fase II de ensayos con everolimus como monoterapia sólo mostró actividad antitumoral modesta en pacientes con metástasis UC [37]. Los datos sobre el papel funcional y el mecanismo molecular de la vía PI3K /Akt /mTOR y MAPK vías de señalización en la UC son muy limitados hasta la fecha y no pueden explicar los resultados clínicos. Por lo tanto, que caracteriza el mecanismo molecular de la vía de señalización de PI3K /AKT /mTOR y su regulación cruzada con la vía MAPK in vitro en líneas celulares que albergan mutaciones típicas de la UC. Las consecuencias funcionales de la señalización de eventos y el crecimiento celular de células se estudiaron después de la interferencia farmacológica o genética con diferentes componentes moleculares de esta vía a través de inhibidores de moléculas pequeñas u oligonucleótidos siRNA /shRNA. Nuestros resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre la red molecular de las vías de señalización examinaron ese resultado en un argumento para nuevas estrategias de tratamiento y sugiere proteínas candidatas para la estratificación molecular para los pacientes que sufren de metástasis UC.
Materiales y Métodos
líneas celulares y reactivos
Las líneas de células RT4, HT1376, 647V, 486p, J82, 253J, EJ28, T24 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EE.UU.) y RT112 (Colección alemana de microorganismos y cultivos de Células) se mantuvieron a 37 ° C en medio RPMI 1640 o DMEM suplementado con 10% de FCS en una atmósfera humidificada que contiene 5% o 7,5% de CO
2. NVP-BEZ235 y RAD001 fueron amablemente proporcionados por Novartis Pharma. U0126 fue adquirido de Señalización Celular Tecnología y LY294002 de Promega. Las soluciones madre se prepararon en DMSO. Las soluciones de trabajo se preparan en medio de cultivo celular a concentraciones representadas.
Las construcciones, transfección e infección
siRNA oligonucleótidos contra 4E-BP1, S6K1 y control fueron diseñados por y adquiridos de Qiagen GmbH y Akt 1, -2, -3 siRNA oligonucleótidos de ocultación de Invitrogen. Las transfecciones transitorias se realizaron con X-treme transfección de genes o el reactivo Lipofectamina (Roche Diagnostics, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando 2 g /siRNA /6 pocillos. Para el triple transfección de adenovirus mTOR shRNA y el control shRNA fue adquirido de SIRION Biotech. 1,5 × 10
5 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos un día antes de la infección se añadieron partículas de adenovirus y a una multiplicidad de infección de 30. La supresión de la expresión de proteínas se analizó mediante inmunotransferencias 2-6 días después de la transfección o infección.
inmunotransferencia y anticuerpos
Las células se lisaron en tampón RIPA (NaCl 150 mM, 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 1% de Triton X-100, 0,1% de SDS, cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Diagnostics ), inhibidor de la fosfatasa Mix (SERVA) durante 20 min en hielo. el material insoluble se sedimentó por centrifugación durante 30 min a 4 ° C, 30.000 g. la concentración de proteína se cuantificó con la proteína BCA ™ de ensayo (Pierce). cantidades iguales de proteína fueron . sometió a SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 7,5 a 12% y se transfirió a una membrana de PVDF (Zefa) para la inmunotransferencia, los anticuerpos utilizados fueron: Akt (C67E7), Akt1, Akt2, Akt3, fosfo-Akt (Ser473), fosfo-Akt (Thr308), GSK3, fosfo-GSK3 (Ser9), mTOR, fosfo-mTOR (Ser2448), 4E-BP1, fosfo-4E-BP1 (Thr37 /46), S6K1, fosfo-S6K1 (Thr389), S6RP, fosfo- S6RP, p44 /42 MAPK, fosfo-p44 /42 MAPK, c-Raf, fosfo-c-Raf (Ser338) (Tecnologías de señalización celular). Secundaria anticuerpos conjugados HRPO se adquirieron de Dianova. La inmunotransferencia se realizó como se describió anteriormente o modificada de acuerdo con la recomendación del fabricante [38]. ECL-reacción fue visualizado utilizando películas de autorradiografía Hyperfilm ECL (GE Healthcare). Para la cuantificación, la señal de quimioluminiscencia se analizó mediante el XRS ChemiDoc ™ y Cantidad One® software de Bio-Rad Laboratories, Inc.
El crecimiento celular
Para evaluar el crecimiento celular, las células se sembraron en 1000 células /96 pocillos y se trataron como se describe. Después de la cosecha, las células se tiñeron con azul células y viven de tripano se contaron en una cámara de Neubauer.
La proliferación celular
La proliferación celular se midió 24 h después del tratamiento de las células con RAD001, NVP-BEZ235 y U0126 o 48-72 h después de la transfección /infección con siRNAs /shRNAs. Bromodesoxiuridina (BrdU) incorporación para la detección de ADN recién sintetizado y 7-amino-actinomicina D (7-AAD) tinción para la detección de ADN de doble cadena se realizó utilizando un flujo Kit BrdU APC (BD Biosciences) por las células pulsantes para dos horas de acuerdo con el protocolo del fabricante seguido por citometría de flujo análisis.
apoptosis ensayo
la apoptosis se detectó midiendo la actividad de la caspasa 3/7 usando el caspasa-Glo 3/7 ensayo de Promega GmbH, de acuerdo con la el protocolo del fabricante.
la viabilidad celular
Las células fueron tratadas con RAD001, NVP-BEZ235 y U0126 en placas de 96 pocillos. A las 36 h, las células se incubaron durante 3 h con XTT. La reacción enzimática se analizó a 450 y 650 nm en un lector de ELISA.
El análisis estadístico se utilizó
t de Student para comparar las medias de los diferentes grupos. Los cálculos estadísticos se realizaron utilizando Microsoft Office Excel.
Resultados
Expresión y estado de activación de la vía PI3K /Akt /mTOR en líneas celulares de carcinoma urotelial
Se analizó la expresión y activación estado de los componentes claves moleculares en la vía PI3K en un panel de 9 líneas celulares derivadas de la UC. Las células se recogieron y lisaron para el análisis de proteínas en una etapa subconfluentes. se detectó la expresión de Akt, mTOR, S6K1, S6RP, 4E-BP1 y PTEN en todas las líneas celulares (Figura 1A). Se observó la fosforilación de Akt en T308 y S473 y mTOR, 4E-BP1, S6K1 y S6RP en 7 de 9 líneas celulares. No activación de Akt podría ser detectada en las células RT4 y 647V. En estas dos líneas celulares mTOR, S6K1 y la fosforilación S6RP se redujo significativamente, mientras que 4E-BP1 todavía estaba fosforilado en células RT4. Por lo tanto, la mayoría de las líneas celulares examinadas exhibió una ruta de señalización de PI3K /Akt /mTOR constitutivamente activado. La expresión de PTEN no impide que esta activación en las condiciones de cultivo examinadas. Para experimentos adicionales, decidimos trabajar con las dos líneas celulares UC RT112 (sobreexpresión de FGFR3) y T24 (oncogénico H-Ras, homocigotos mutación PTEN), ambos exhiben con frecuencia encontraron alteraciones genómicas en el cáncer de vejiga [39], [40], [41 ]
a:. para el análisis de proteínas, las células se lisaron en tampón RIPA aplicó a SDS-PAGE y transferidos a una membrana de PVDF. La fosforilación y la expresión estado de proteínas se analizaron en inmunotransferencias. B, C: Las líneas celulares se trataron durante 1 h con las concentraciones indicadas de RAD001 y NVP-BEZ235. El control (0) contenía mismas concentraciones de DMSO como en muestras con compuestos químicos. Se muestra un resultado representativo de 3 experimentos independientes. D: La concentración inhibidora del 50% (IC50) se determinó para las proteínas diana de PI3K y mTORC1. señales de quimioluminiscencia se cuantificaron utilizando el sistema de imágenes ChemiDoc (BioRad Laboratories) y normalizado a nivel de expresión de la proteína. Los valores promedio de tres o más experimentos se muestran independientes
RAD001 /CCI-779 y NVP-BEZ235 PI3K y mTOR bloque de abajo objetivos de una manera dependiente de la dosis -. MTORC1 regulación independiente de 4E-BP1
con el fin de caracterizar la relevancia funcional de esta vía en la UC que utiliza los derivados de rapamicina RAD001 y CCI-779 y la vía PI3K-inhibidor NVP-BEZ235. Puesto que los efectos de CCI-779 y el tratamiento RAD001 eran idénticos que sólo representan los resultados RAD001. En primer lugar, se llevaron a cabo ensayos de respuesta a la dosis para evaluar la actividad de RAD001 y NVP-BEZ235 1 h después del tratamiento celular. Actividad de los compuestos se caracteriza por el patrón de fosforilación de S6K1 /S6RP /4E-BP1 para ambas sustancias y, además, para Akt utilizando NVP-BEZ235. intensidad de la señal se midieron mediante un sistema de imágenes de quimioluminiscencia y las concentraciones inhibidoras de 50% (IC50) para el nivel de fosforilación normalizado a nivel de la proteína se calcularon (Figura 1B, D). RAD001 inhibe la fosforilación de S6K1 y S6RP pero no de 4E-BP1 (Figura 1B). Al exponer las células a NVP-BEZ235, la inhibición de S6K1 /S6RP se observó a concentraciones de IC50 inferiores que las necesarias para la inhibición de la fosforilación de Akt en T308 /S473 (Figura 1C, D). fosforilación de 4E-BP1 fue disminuido en gran medida a las concentraciones que se correlacionaron con las necesarias para la inhibición de Akt. Por lo tanto, la inhibición de mTORC1 por los derivados de rapamicina reguladas tan sólo fosforilación S6K1 /S6RP mientras que la inhibición de PI3K y mTORC1 /2 inhibió tanto, S6K1 y 4E-BP1 /S6RP fosforilación. células T24 respondieron a una concentración similar al tratamiento RAD001 como RT112 pero 3 veces más sensibles al tratamiento con NVP-BEZ235.
tratamiento
a largo plazo con RAD001 y NVP-BEZ235 resultados en S6K1 hiperactivación mediada por PI3K /Akt
se ha descrito que los resultados de la activación de S6K1 en un bucle de retroalimentación negativa que regula no sólo la actividad de PI3K que es probablemente responsable del éxito limitado de los derivados de rapamicina en uso clínico [17]. Por lo tanto, hemos abordado el efecto de los compuestos utilizados en este bucle de realimentación. Se utilizaron tres concentraciones diferentes de RAD001 y NVP-BEZ235 que dieron como resultado la inhibición de aproximadamente 50% a 100% de sus dianas moleculares y analizaron los efectos sobre PI3K de señalización activación de la vía durante un período de 72 horas. tratamiento RAD001 resultó en S6K1 desfosforilación y se indujo la hiperfosforilación de Akt en T308 y S473 de una manera dependiente de la concentración a lo largo del período de observación (1-72 h) en las células RT112 mientras que en las células T24 hiperactivación Akt se indujo solamente 24 a 72 h después del tratamiento (Figura 1B /C, 2A, los datos de 72 h no mostrados). El estado de activación de la Akt objetivo abajo GSK3-β se correlacionó con el nivel de fosforilación de Akt en ambas líneas celulares (Figura 2A). fosforilación o proteína nivel 4E-BP1 no se vio afectada por el tratamiento RAD001. Cuando se utiliza NVP-BEZ235 la desfosforilación inicial de Akt 1 h después del tratamiento invertido después de 24 h, e incluso concentraciones 100 veces por encima de la CI50 no fuera suficiente para evitar la fosforilación de T308 y sólo parcialmente en S473 (Figura 2B). En correspondencia con el estado de activación de Akt, se observó la fosforilación del sustrato Akt GSK3-β. En particular, el tratamiento con recién preparada NVP-BEZ235 1 h repite antes de recoger las células no impidió esta hiperactivación de Akt (datos no mostrados). La fosforilación de 4E-BP1 permaneció suprimida a lo largo del período de observación (Figura 2C)
A, B:. Efecto de RAD001 o NVP-BEZ235 el tratamiento de más de 24 horas en el nivel de fosforilación de Akt, S6K1, 4E-BP1 y GSK3 -β en células RT112 y T24. Lisados de células enteras se aplicaron a SDS-PAGE y se transfirieron sobre membranas de PVDF, seguido de inmunotransferencias para detectar la expresión y la fosforilación nivel de proteínas representadas. El control (0) contenía misma concentración de DMSO como en muestras con compuestos químicos. C: RT112 células fueron transfectadas con siRNA dos oligonucleótidos específicos independientes de S6K1 y un oligonucleótido siRNA al azar como control (CTR siRNA). Tres días después de la transfección, la expresión y el nivel de fosforilación de S6K1, Akt y GSK3-β se analizaron en inmunotransferencias.
Ya sea S6K1 /Akt actividad PI3K inducida directamente fue dirigido por silenciamiento de la expresión S6K1 utilizando dos siRNAs específicas dirigidas contra S6K1. Dos días después de la transfección, los análisis Western Blot demostraron una reducción de 90-96% en el nivel de la proteína S6K1 (Figura 2C). La regulación a la baja de la expresión de S6K1 correlacionado con la hiperfosforilación de Akt en S473 y T308 y GSK3-β, el apoyo a la S6K1-PI3K bucle de retroalimentación descrito /Akt.
regula la inhibición de PI3K /mTOR pero tampoco silenciamiento de la expresión de Akt mTOR ni 4E-BP1 fosforilación
nos Estos resultados llevó a caracterizar los circuitos de señalización de PI3K, mTOR, Akt y 4E-BP1 en mayor detalle. En modelos más sugeridas, S6K1 y 4E-BP1 son objetivos de abajo Akt y fosforilación mTORC1 y en la mayoría de los informes se regula de forma simultánea [14], [15]. Nuestros resultados demuestran que sólo las células UC tratados con NVP-BEZ235 pero no exhibieron RAD001 supresión tanto de S6K1 y la fosforilación de 4E-BP1 lo que sugiere que 4E-BP1 se regula de manera diferente que S6K1. Ya que los objetivos NVP-BEZ235 miembros de la familia de la proteína PI3K, PI3K o su destino corriente abajo Akt mTOR o podrían estar involucrados en la regulación de la fosforilación de 4E-BP1. Primero probamos si pudiéramos verificar los efectos de NVP-BEZ235 utilizando el LY293002 bien caracterizado inhibidor de quinasa que fue diseñado originalmente como un inhibidor de PI3K específica, sino que muestra también actividad hacia otras quinasas no relacionadas con PI3K [42], [43]. fosforilación S6K1 se redujo con una CI50 de 3 nM mientras que el IC50 doble a 7 nM para inducir una reducción de la Akt (S473 /T308) y 4E-BP1 fosforilación, se asemeja por lo tanto la cinética de la actividad de NVP-BEZ235 sobre la fosforilación de Akt /4E-BP1 (Figura 3A y 1B)
A:. ensayo de respuesta a la dosis con las células tratadas 24 horas con el inhibidor de PI3K LY294002. Los lisados celulares se analizaron en inmunotransferencias que muestran los efectos dependientes de la dosis en la expresión y la fosforilación de Akt nivel, S6K1 y 4E-BP1 en las células RT112. B: El silenciamiento de la expresión de mTOR 3 días después de la infección con adenovirus mTOR shRNA o control shRNA (shRNA ctr). lisados de células enteras fueron analizados en inmunotransferencias para la fosforilación y la expresión nivel de S6K1, S6RP, Akt y 4E-BP1. C: Akt expresión regula la fosforilación de S6K1 pero no 4E-BP1. La transfección de las células con oligonucleótidos específicos siRNA sigilo o controlar la expresión de siRNA silenciada de las tres isoformas de Akt. 3 días después de la transfección las células se lisaron aplican a SDS-PAGE se transfirieron a una membrana de PVDF y el nivel de expresión de isoformas de Akt y la expresión y el nivel de fosforilación de 4E-BP1 y S6K1 se analizaron.
Con el fin de examinar más a fondo esta observación, hemos utilizado un enfoque shRNA adenoviral para silenciar la expresión de proteína mTOR, que debe dar lugar a la inactivación específica de ambos, complejos de proteínas y mTORC1 mTORC2. Dos días después de la infección, análisis de Western blot confirmó una caída 85-96% en el nivel de proteína mTOR que se mantuvo estable durante 5 días (Figura 3B). La caída resultó en la desfosforilación de S6K1 y S6RP sin afectar el nivel de expresión de proteínas. Sólo se detectó efectos menores sobre 4E-BP1 fosforilación en relación con el nivel de proteína 4E-BP1. En particular, la fosforilación de Akt se redujo en un 40 a 60% en los residuos T308 y S473.
pasado, la influencia de Akt en la fosforilación de 4E-BP1 se caracterizó por el uso de siRNAs dirigidos contra los tres diferentes isoformas de Akt. Tres días después de la transfección, el golpe combinado hacia abajo de las tres isoformas resultó en & gt; expresión de la proteína reducida 90% de todas las tres isoformas de Akt (Figura 3C). Sólo fosforilación S6K1 pero no nivel de fosforilación 4E-BP1 se redujeron sin afectar el nivel de proteína que indica que 4E-BP1 a diferencia de S6K1 no es aguas abajo de Akt en las líneas celulares examinadas.
Crosstalk entre la vía de señalización de PI3K y MAPK se produce en pasos para múltiples
Dada la importancia de PI3K y MAPK vía la biología, se analizó la interacción de las dos vías en el cáncer de vejiga. Las células se trataron con RAD001, NVP-BEZ235 o con el U0126 inhibidor de la activación y el estado de MEK1 /2 de las proteínas clave tanto en las vías 1 a 72 h después del tratamiento fueron analizados en transferencias de Western. La inhibición de la activación inducida por mTORC1 RAD001 de ERK1 /2 fosforilación 24-72 h después del tratamiento (Figura 4A, panel superior). Se observó el mismo efecto cuando silenciamiento de la expresión de proteína S6K1 que resultó en un aumento /ERK1 /2 fosforilación Raf1 (Figura 4B). Sin embargo, la inhibición tanto de PI3K y mTOR por NVP-BEZ235 inducida rápidamente ERK1 /2 fosforilación durante todo el periodo observado de 1 a 72 h (Figura 4A, panel inferior). Se concluye que la supresión de la actividad /mTOR PI3K /Akt generalmente resulta en la activación de la vía de señalización de Raf /MEK /ERK, pero la cinética del proceso depende de la diana molecular en la antigua vía se inhibe
A.: células RT112 y T24 fueron tratados con RAD001 o NVP-BEZ235 durante 1 h o 24 h. Expresión y la fosforilación estado de ERK1 /2 se analizó en inmunotransferencias de lisados de células enteras. B: Dos días después de la transfección con oligonucleótidos siRNA contra S6K1 o control siRNA (siRNA ctr), se lisaron las células y la fosforilación y la expresión estado de Raf y ERK1 /2 se analizó en inmunotransferencias. C: Las células fueron tratadas durante 24 h con RAD001, NVP-BEZ235 y U0126 solo o en combinación y efectos sobre la expresión y la fosforilación de Akt nivel, S6K1 y ERK1 /2 se analizó en inmunotransferencias
. después se analizan las consecuencias bioquímicas al inhibir tanto la vía PI3K /Akt /mTOR y la vía MAPK, utilizando RAD001, NVP-BEZ235 o U0126 U0126 en combinación o solos. Cuando las células se trataron con U0126 solo, ERK1 /2 fosforilación fue completamente abolida mientras que la fosforilación de Akt en S473 y T308 se upregulated (Figura 4C). Curiosamente, no hemos podido demostrar ningún cambio en la fosforilación de S6K1. Cuando se combinan U0126, ya sea con o RAD001 NVP-BEZ235, Akt hiperfosforilación se incrementó significativamente en comparación con el tratamiento con cualquiera de estas sustancias solo en células T24.
PI3K /Akt /mTOR y señalización MAPK regulan la proliferación celular, la viabilidad y la apoptosis
a continuación se determina cómo la manipulación de PI3K y MAPK influye en la proliferación celular en la Universidad de California señalización. En primer lugar, las células se trataron con RAD001, NVP-BEZ235 y U0126 solo o en combinación y la proliferación celular se controló con el tiempo. Tres días después del tratamiento, RAD001 inhibió la proliferación celular en un 62% en RT112 y 40% en las células T24 en relación con el disolvente de control (Figura 5A). El tratamiento con NVP-BEZ235 proliferación celular completamente inhibida en las células RT112 y lo redujo en un 66% en las células T24. tratamiento U0126 inhibió la proliferación en un 70% y 76% en las células RT112 o T24, respectivamente. La combinación de RAD001 o NVP-BEZ235 con U0126 cedido efectos aditivos, con la combinación de NVP-BEZ235 /U0126 ser más eficaz (Figura 5A). Con el fin de caracterizar estos efectos en más detalle, el análisis del ciclo celular se midió mediante la combinación de la incorporación de BrdU y la tinción 7-AAD, la respuesta apoptótica mediante la medición de la actividad de caspasa y la viabilidad /metabolismo por XTT-ensayos. Como para el análisis del ciclo celular, el tratamiento RAD001 disminuye la fracción de las células sometidas a la fase S por 11% en ambas líneas celulares (Figura 5b). NVP-BEZ235 redujo células en fase S en un 84% en RT112 y un 22% en T24, mientras que las células U0126 reducidos en la fase S en un 97% en T24 pero sólo en un 52% en las células RT112. La combinación de inhibidores de la señalización de PI3K y MAPK tenía efectos aditivos sobre la proliferación celular con la combinación de NVP-BEZ235 /U0126 ser más eficaz en la reducción del número de células en la fase S por 94 a 98%. Todas las sustancias inducen un aumento en las células detenidas en la fase G1 que se correlaciona con la disminución de las células que entran en la fase S, lo que indica que la inhibición de cualquiera de los resultados de la vía en la detención en G1 en las líneas celulares de la UC (Figura 5B). La apoptosis se mide por la actividad de caspasa (Figura 5C) [11]. Ambos, RAD001 y tratamiento NVP-BEZ235 disminución de la activación de caspasas en células RT112 por 32-45%. En las células T24, RAD001 y NVP-BEZ235 reducen la actividad de caspasa por 43-48%. U0126 no tuvo ningún efecto significativo sobre la actividad de la caspasa y no aumentó la actividad de RAD001 o NVP-BEZ235 cuando se combinan juntos. Para la medición de la viabilidad celular, los mismos números de células se analizaron usando un ensayo XTT. En función de los antecedentes celular, se observó una reducción del 30-50% con RAD001 y 70-85% con NVP-BEZ235 (Figura 5D). Curiosamente, no hemos podido detectar efectos aditivos por la inhibición combinada de la vía PI3K /Akt /mTOR y las vías de MAPK. Se concluye que la actividad de la vía PI3K /mTOR y MAPK en UC proliferación de las células control, la apoptosis y la célula de vitalidad y que ambas vías puede sustituir parcialmente por la pérdida de uno al otro con respecto a la proliferación.
células RT112 y T24 fueron tratados con RAD001 (5 nM), NVP-BEZ235 (100 nM para T24, 500 nM para RT112) y U0126 (25 nM) solo o la combinación indicada y un control de DMSO (CTR). R: Para los recuentos de células, las células se tiñeron con azul de tripano y el número de células vivas fueron determinados. Análisis del ciclo celular después de 24 h de tratamiento con compuestos químicos, mediante la incorporación de BrdU en combinación con tinción 7-AAD: B. C: Medida de la actividad de la caspasa 3/7 como parámetro para la apoptosis y D: XTT-test para la detección de la viabilidad celular realizó 24 h después del tratamiento. Los valores mostrados son la media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes. Se realizó la prueba t de Student para el análisis estadístico. (*: p & lt; 0,05) guía empresas
La actividad combinada de S6K1 y 4E-BP1 a regular la proliferación celular en el carcinoma urotelial
Por último , se abordó la cuestión de por qué NVP-BEZ235 afecta el crecimiento celular más eficazmente que RAD001. Hemos demostrado que NVP-BEZ235 a diferencia de RAD001 influye tanto, S6K1 y la fosforilación de 4E-BP1. Por lo tanto, se utiliza tanto siRNA oligonucleótidos dirigidos contra S6K1 o 4E-BP1 o combinados con RAD001 4E-BP1 siRNAs para imitar el efecto adicional presume de NVP-BEZ235. Dos días después de la transfección siRNAs contra 4E-BP1 o S6K1 reducen la expresión de proteínas de 80-96% (Figura 6A, 2C). Las células silenciadas para S6K1 o expresión 4E-BP1 exhibieron reducen significativamente la proliferación celular en un 40% (RT112) a 60% (T24) en comparación con los controles (Fig. 6B), produciendo efectos comparables a los observados después del tratamiento everolimus (Figura 5A). Sin embargo, la combinación de 4E-BP1 siRNA y tratamiento everolimus reduce el crecimiento celular por 80 a 85%, el mismo grado que la observada con NVP-BEZ235. Análisis de la proliferación celular demostró que el efecto fue de nuevo mediada por la detención del ciclo celular en la fase G1 /G0 (datos no mostrados). En resumen, tanto el blanco de abajo mTORC1 S6K1 y 4E-BP1 son en un grado similar implicado en la regulación de la proliferación celular mediante el control de UC la progresión del ciclo celular de G1 /S a 0 viabilidad de fase y de células
A:. Dos días después de la transfección con ARNip contra 4E-BP-1, la expresión de proteínas en RT112 y células T24 se detectó en inmunotransferencias. β-actina se utilizó como control de carga. B: Crecimiento de las células vivas, silenciados para S6K1 o expresión 4E-BP1 o células silenciadas para la expresión 4E-BP1 y se incubaron con everolimus (RAD001) fueron controlados a través del tiempo. Se muestran los valores medios ± desviación estándar; las comparaciones estadísticas se realizaron mediante el test t de Student. (*: p & lt; 0,05) guía empresas
Discusión
A pesar de una mejor comprensión de la biología del cáncer de vejiga en los últimos años, de menor importancia mejoras en el manejo terapéutico de esta enfermedad se han alcanzado durante las dos últimas décadas. Las PI3K /Akt /mTOR y MAPK vías de señalización son propensos a las mutaciones y la activación aberrante de esta entidad tumoral y pueden proporcionar dianas adecuadas para las terapias más eficaces [44]. En consecuencia, hemos caracterizado ambas vías de señalización en relación con el estado de activación, el mecanismo molecular y relevancia para la proliferación celular en la Universidad de California. Pudimos confirmar trazados de circuito de regulación descritos anteriormente que controlan la activación de estas vías. Nuestros datos sugieren fuertemente un nuevo mecanismo que controla la activación del elemento de aguas abajo 4E-BP1 dentro de esta red de señalización.