Extracto
Evidencias recientes indican que la señalización de CXCR2 es crucial para la progresión del cáncer, y su antagonista SB225002 induce la apoptosis en células de tumor de Wilms. A continuación, se investigó el efecto de SB225002 en la progresión del ciclo celular y la inducción de apoptosis
in vitro
, utilizando líneas celulares Ovča CDDP-sensibles y resistentes con diferente estado de p53 (tipo salvaje, mutante o nulo). La infección por adenovirus de p53 de tipo salvaje o la transfección de p53 siRNA se utilizó para p53 sobre-expresa o knock-down. ciclo celular y la apoptosis se determinó por citometría de flujo o la tinción de Hoechst y la observación de la morfología nuclear. Nuestros datos demostraron que SB225002 indujo apoptosis tanto en células deficientes en p53 cáncer de ovario (OVCA) de tipo salvaje y a través de mecanismos alternativos. SB225002 promueve la catástrofe mitótica, como lo demuestra la acumulación de células mitóticas con anormalidades del huso, mala segregación de cromosomas, la división celular multipolar, múltiples núcleos, aneuploidía /poliploidía y posterior extensa apoptosis. SB225002 inducida por la catástrofe mitótica parecía estar mediado por la baja regulación de la quinasa Chk1 puesto de control y activación Cdk1-ciclina B. En las células que expresan p53 de tipo salvaje (OV2008 y C13 *), SB225002 aumentó los niveles totales de p53 y fosfo-Ser, y p53 knock-down disminución de la apoptosis SB225002 inducida, sin afectar la mitosis prematuro. Estos resultados sugieren que SB225002 induce la apoptosis dependiente de p53, y provoca la catástrofe mitótica de una manera independiente de p53 en las células p53 de tipo salvaje. Reconstitución con p53 de tipo salvaje en células SKOV3 P53 nulo atenuada catástrofe mitótica SB225002 inducida, lo que sugiere p53 evitó la catástrofe mitótica inducida por SB225002 en células Ovča deficientes en p53. Por último, el efecto de SB225002 no pudo ser impedido por el tratamiento previo con ligando CXCR2 o su anticuerpo neutralizante. Los presentes estudios demuestran por primera vez que SB225002 tiene acciones duales en células Ovča, induciendo apoptosis clásica a través de la activación de p53 y provocando la catástrofe mitótica, tanto en p53 de tipo salvaje y las células deficientes de inhibición de Chk1 y la activación de Cdk. Estos resultados plantean la posibilidad de SB225002 como una nueva molécula candidato para la terapia OVCA independiente del estado de p53
Visto:. Du M, Q Qiu, Gruslin A, Gordon J, Él M, CC Chan, et al. (2013) SB225002 promueve la catástrofe mitótica en células quimio-sensibles y resistentes a un cáncer ovárico independiente del estado de p53
in vitro
. PLoS ONE 8 (1): e54572. doi: 10.1371 /journal.pone.0054572
Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: Octubre 15, 2012; Aceptado: December 12, 2012; Publicado: 24 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Du et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Proyecto Principal Internacional Común de Investigación de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30910103909 con DJ Li), Nacional y Shanghai Leading disciplina académica Proyecto (211XK22 a DJL), Programa de Mejor Líder Médico Académico de Shanghai (a DJL), y Nacional Fundación de Ciencias naturales de China, (81070537 a MRD), Fundación de Ciencias naturales Nacional de China (31171437 a MRD), y Shanghai Programa Talento PuJiang (10PJ1401600 de MRD), y subvenciones de los Institutos canadienses de Investigación en Salud (RP-15691 de BKT) y la Universidad de Clase Mundial programa (WCU) a través del Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología de Corea y financiado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (R31-10056 a BKT). . Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Aunque dos de los autores (Miao Él y Chi Chung Chan) son empleados de la empresa Wuxi AppTech Co., Ltd., esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. La compañía no tiene declaraciones relativas al empleo, consultoría, patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados en relación con este proyecto /manuscrito. Otros autores de este manuscrito (Meirong Du, Qing Qiu, Andrea GRUSLIN, John Gordon, Dajin Li y Benjamin K. Tsang) no tienen intereses financieros o de otro tipo con la empresa y han confirmado su declaración de que no tienen intereses en competencia como se define en PLOS UNO.
Introducción
el cáncer de ovario (OVCA) es la neoplasia ginecológica más fatal que ha frustrado los clínicos y los investigadores desde hace varias décadas. Es la quinta causa principal de muerte por cáncer entre las mujeres, con un estimado de 21.990 nuevos casos diagnosticados y 15.460 muertes que se producen en los Estados Unidos en 2011 (http://seer.cancer.gov/statfacts/html/ovary.html). Aunque la quimioterapia y la cirugía citorreductora Actualmente modalidades estándar para el tratamiento OVCA, quimio-resistencia sigue siendo una causa importante de fracaso quimioterapéutico. Diversos mecanismos se han implicado para la quimiorresistencia, incluido el transporte alterado de drogas, la reparación del ADN mejorada y aumento de la tolerancia al daño del ADN [1], [2], [3]. Además, las células de mamífero exhiben respuestas celulares complejas a estrés genotóxico, incluyendo punto de control del ciclo celular, reparación del ADN y la apoptosis, y la activación de genes es un paso inicial crítico durante la respuesta celular al daño del ADN. Aunque la quimioterapia adyuvante con paclitaxel y cisplatino logra la respuesta clínica en un alto porcentaje de los casos, la toxicidad sistémica limita severamente oportunidad tratamiento [4]. Por lo tanto, se necesitan con urgencia estrategias terapéuticas más eficaces y seguros para combatir esta enfermedad.
La apoptosis se caracteriza morfológicamente por la contracción citoplasmática, la condensación de la cromatina y fragmentación nuclear con chromatinolysis [5], y bioquímicamente por la activación de caspasas y permeabilización de la membrana mitocondrial externa [6], [7], [8]. catástrofe mitótica es un caso especial de la apoptosis, y se produce durante la mitosis con una combinación de puntos de control del ciclo celular deficientes y daño celular [9]. daño en el ADN activa los puntos de control para retrasar la progresión del ciclo celular. P53 regula transición G1 /S (G1-puesto de control), mientras que CHK1 impide la entrada de células con el ADN dañado en la fase M (punto G2-check). En el caso de la quimiorresistencia, daño del ADN inducido por los agentes quimioterapéuticos no para detener las células cancerosas en la fase G1 y la promoción de la apoptosis debido principalmente a la señalización de p53 deficiente. Sin embargo, el daño del ADN puede activar la vía de CHK1, inducir S y G2-puestos de control de detención [10], [11] y facilitar la reparación del ADN antes de la entrada en mitosis (fase M). Por tanto, es concebible que los agentes capaces de inducir la apoptosis convencional (a través de daño en el ADN y la activación P53), y la promoción de la catástrofe mitótica (a través de la inactivación de CHK1 y la derogación de G /M detención) pueden ofrecer potencialmente nuevas ventajas terapéuticas.
Las quimiocinas , una superfamilia de proteínas pequeñas citoquina, son conocidos por su papel fundamental como reguladores de la migración celular, la comunicación intercelular y la progresión tumoral, ofreciendo un microambiente adecuado del tumor [12], [13], [14]. CXCR2, un receptor funcional para ELR
+ quimiocinas, se expresa predominantemente en células endoteliales y es un potente promotor de la angiogénesis en los cánceres sólidos. La evidencia indica que la transformación celular por ras oncogénico induce alta expresión de todos los ligandos CXCR2, y contribuye al desarrollo de tumores múltiples. En OVCA, ELR
+ quimiocinas, como la IL-8, GRO-1 y ENA-78, son significativamente hasta reguladas [15], [16], [17], [18]. El alto nivel de GRO-1 induce la senescencia de los fibroblastos y promueve la transformación maligna de las células epiteliales de ovario y el crecimiento celular OVCA [19] SB225002 [N- (2-hidroxi-4-nitrofenil) -N '(2-bromofenil) urea ] se cree que es un no péptido CXCR2 antagonista selectivo potente inhibiendo la unión de IL-8 y GRO-1 a CXCR2 [20]. Aunque SB225002 fue desarrollado por primera vez para el tratamiento de enfermedades inflamatorias [20], [21], estudios recientes sugieren que las infecciones por retrovirus, el tumor de Wilms y la enfermedad de Alzheimer pueden ser posibles indicaciones terapéuticas para CXCR2 antagonista [22] [23], [24, ]. SB225002 se ha informado de inducir la apoptosis en células de tumor de Wilms, aunque el mecanismo subyacente no está claro [23].
En el presente estudio, se examinó el efecto de SB225002 en la progresión del ciclo celular y la inducción de apoptosis
in vitro
, utilizando líneas celulares Ovča CDDP-sensibles y resistentes con diferente estado de p53 (tipo salvaje, mutante o nulo). Se encontró que SB225002, independiente de CXCR2, indujo apoptosis clásica a través de la activación de P53 y provocó la catástrofe mitótica, tanto en p53 de tipo salvaje y las células deficientes a través de la quinasa de punto de control 1 (Chk1) la inhibición y la activación de Cdk. Además de su acción inhibidora de la angiogénesis tumoral a través de la señalización celular mediada por CXCR2 (Matsuo
et al
., 2009), nuestro estudio demuestra que SB225002 podría ser un potencial de agentes terapéuticos para quimiorresistente OVCA a través de su acción sobre el ciclo celular la progresión y la apoptosis independiente de la señalización mediada por receptores.
Materiales y Métodos
Reactivos
Cis-diaminodicloroplatino (CDDP) y Hoechst 33258 se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). SB265610 se adquirió de Tocris Bioscience (EE.UU.). SB225002 se adquirió de Calbiochem (San Diego, CA, EE.UU.), RNA inhibidor pequeño (ARNip) para p53 eran de Señalización Celular Tecnología (Beverly, CA). Control de siRNA fue de Dharmacon inc. (Lafayette, CO, EE.UU.). reactivo de transfección siRNA Ribojuice era de Novagen Inc. (San Diego, CA, EE.UU.). Los anticuerpos primarios para Western blot fueron policlonal de conejo anti-PARP, anti-fosfo-Chk1 (S345) y fosfo-p53 (S15; Cell Signaling Technology), monoclonal de ratón anti-Chk1, anti-caspasa 3, anti-fosfo-histona H3 ( Serine 10), y anti-p21
WAF1 /CIP1 (Cell Signaling Technology), anti-p53 (DO-1, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-IL-8 y GRO-1 (R & amp; sistema D, Minneapolis, MN) y anti-GAPDH (ab8245, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante eran de Bio-Rad (Hercules, CA, EE.UU.). Los anticuerpos primarios para inmunocitoquímica fueron policlonal de conejo Alexa Fluor ® 488-conjugado anti-fosfo-histona H3 (Ser 10; Cell Signaling Technology,) y FITC-conjugado anti-β-tubulina (Clon TINA 2.1, Sigma). El monoclonal anti-humano CXCR2 -PE, IL-8 recombinante humana y GRO1 eran de I + amp; D System. normas pre-teñidas de electroforesis de gel de poliacrilamida eran de BioRad. Adenoviral p53 de tipo salvaje y LacZ ADNc fueron proporcionados por el Dr. Ruth Slack (Instituto de Investigación de Neurociencia de la Universidad de Ottawa). ELR-CXC CXCL8 antagonista de quimiocina (3-72) K11R /G31P (G31P) era del Dr. John R. Gordon (Universidad de Saskatchewan, Saskatoon, Canadá).
Cell Cultura y
cisplatino células sensibles Ovča (OV2008 y A2780s) y sus homólogos resistentes respectivos (C13 * y A2780cp, respectivamente), y células SKOV3 p53 nulos fueron cultivadas como se informó anteriormente por nuestro laboratorio [25] - [31]. Las células, en placas a una densidad de 5 × 10
4 células /cm
2, fueron infectadas con vectores de expresión adenovirales o transfectadas con siRNA o tratadas con SB225002 recién preparado bajo condiciones libres de suero. El medio acondicionado (10 ml) se concentraron con Amicon Ultra-4 filtro centrífugo (Millipore Corporation, Billerica, MA) a volumen final de 200 l para el análisis posterior.
Extracción de ARN, síntesis de ADNc y en tiempo real RT- PCR
ARN total fue extraído (RNeasy Mini Kit. Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Los ADN complementarios se generaron mediante el uso de oligo (dT) cebadores con MMuLV transcriptasa inversa (kit RETROscript; Ambion). PCR en tiempo real cuantitativa se realizó con los siguientes cebadores: GRO-1: F: TGCAGCTGTGTCTCTCTTTCCTCT y R: AAAGCTTGCCTCAATCCTGCATCC; IL-8: F: AGCCTTCCTGATTTCTGCAGCTCT y R: AATTTCTGTGTTGGCGCAGTGTGG; CXCR2: F: AGAAGTTTCGCCATGGACTCCTCA y R: AGTGGAAGTGTGCCCTGAAGAAGA; F: GGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCT y R: GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT para GAPDH. reacción de amplificación se realizó utilizando el kit QuantiTect SYBR Green PCR. Las condiciones de ciclado térmico incluyen una etapa inicial de desnaturalización (95 °, 15 min) y seguido por PCR (95 ° durante 15 min, 50 ciclos a 95 ° durante 15 s, 56 ° durante 20 segundos, y 72 ° durante 30 segundos). Los productos de PCR se fundieron posteriormente a 60 ° durante 30 seg y la abundancia de ARNm de IL-8, GRO-1 y CXCR2 se expresaron como una relación a los valores de GAPDH. Cada valor se comparó con la de OV2008.
La infección por adenovirus, el ARN de interferencia y tratamiento SB225002
SKOV3 se infectaron con p53 de tipo salvaje adenovirus o el control LacZ (MOI = 10) [25] . Veinticuatro horas después de la infección, las células fueron tratadas con SB225002 (750 nM, 24 h o 48 h). Las células OV2008 y C13 * fueron transfectadas con p53 siRNA (100 nmol /l; 36 h). scramble o secuencia (control) [26] y después se trata con SB225002
Análisis Western
Western Blot se realizó como se describe anteriormente [25], [26]. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C en anticuerpos primarios (anti-p53 1: 10.000; anti-fosfo-p53 (S15) 1:1,000; anti-Chk1 1: 1000; anti-fosfo-Chk1 (S345) 1:1,000; anti-fosfo-Chk1 (S317) 1:1,000; anti-caspasa 3 1: 1.000; anti-PARP, 1:1,000; anti-fosfo-histona 3 (S10; 1:1,000), anti-GAPDH, 1:20,000) , seguido de incubación (RT, 1 h) con rábano picante peroxidasa conjugada anti-conejo o anti-ratón anticuerpo secundario (1:5,000). actividad de la peroxidasa se visualizó con ECL kit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Los resultados fueron escaneados y analizados utilizando el software Scion Image (Scion, Inc., Frederick, MD).
yoduro de propidio tinción y citometría de flujo
flotante y se recogieron y se fijaron en etanol al 70% de células adherentes durante la noche. Fueron tratados con RNasa A y se incubaron con yoduro de propidio (50 mg /ml; PI) y se analizaron en un Beckman Coulter FC500. Para la identificación de las células de la mitosis, las células se incubaron (2 h, RT) con H3 anti-fosfo-histona (Alexa 488, 1:10, Señalización Celular) y se lavaron con PBS antes de la tinción PI. Para detectar la expresión de la expresión de CXCR2 en OVCAs, se recogieron las células y se lavaron en PBS, después se tiñeron inmediatamente por un ensayo de inmunofluorescencia estándar con ficoeritrina (PE) conjugado con CXCR2 mAb anti-humano o anticuerpo de isotipo anti-humano conjugado con PE (BD Pharmingen). El porcentaje de células CXCR2-positivas se determinó por citometría de flujo.
inmunofluorescencia
Las células se fijaron y se permeabilizaron, y luego se bloquearon con BSA al 2% seguido de incubación (durante la noche, 4 °) con FITC conjugado de ratón anti-beta-tubulina (01:50) o IgG de isotipo conjugado con FITC (control negativo). Después del lavado, se añadió Hoechst tinción nuclear (33258) a las células, que fueron montadas con Vectashied (Vector, Burlingame, CA, EE.UU.). Florescence imágenes fueron capturados utilizando un microscopio Leitz DMRX y analizados con Adobe Photoshop 7.01 (Adobe, Ottawa, Canadá).
Cromosoma Spread Ensayo
extensiones de cromosomas se prepararon usando el protocolo estándar [32] ; El ADN se tiñeron con 0,1% de verde SYTOX, y se obtuvieron imágenes con un microscopio Leitz DMRX.
Evaluación de la apoptosis
Se adjuntan las células flotantes y se volvieron a suspender en formalina tamponada neutra (4%) que contiene Hoechst 33258 tinte (3,75 ng /ml, 24 h). El porcentaje de apoptosis se determinó mediante morfología nuclear. Al menos 400 células fueron contados en cada grupo con el contador "cegado" para probar la identidad de evitar el sesgo experimental [25], [26].
Análisis estadístico
Todos los resultados se presentan como media ± SEM de al menos tres experimentos independientes. Los datos se analizaron por ANOVA de dos vías y después de la prueba de Bonferroni se utilizó para determinar la diferencia estadística entre los grupos experimentales (software Prism versión 5.0, GraphPad, San Diego, CA). La significación estadística se infiere en P & lt;. 0.05
Resultados
La expresión de CXCR2 y sus ligandos IL-8 y GRO-1 en células Ovča CDDP-sensibles y resistentes a
examinamos primero ARNm y proteínas contenido de CXCR2 y sus ligandos IL-8 y GRO-1 en dos pares de líneas de células Ovča CDDP-sensibles y resistentes. La citometría de flujo reveló que CXCR2 fue positivo en 9,08%, 5,87%, 6,66% y 7,63% de OV2008, C13 *, A2780s y A2780cp células, respectivamente, y no mostró significativamente diferencia entre las líneas celulares. Asimismo, no hubo diferencia significativa en la abundancia de ARNm CXCR2 (Fig. 1A). Por el contrario, la IL-8 se expresó principalmente en líneas de células OV2008 y C13 *, mientras GRO-1 era predominantemente en las células A2780s y A2780cp tanto a nivel de ARNm y proteína. La secreción de IL-8 fue 5 veces mayor en C13 * que en OV2008, mientras que la secreción de GRO-1 fue 5 veces mayor en A2780s que en las células A2780cp (Figura 1B, 1C.)
A:. CXCR2 ARNm y la expresión de proteínas en células Ovča chemosensitive (OV2008 & amp; A2780s) y su contraparte resistentes (C13 * & amp; A2780cp, respectivamente) se determinó mediante qPCR (izquierda) y citometría de flujo (a la derecha, la línea más oscura representa el control de isotipo, la línea más clara representa las células CXCR2-tinción). B & amp; C: la abundancia de ARNm y proteína de secreción de IL-8 (B) y GRO-1 (C) [Western blot (superior) y qPCR (inferior)]. Los datos se expresan como medias ± SEM de tres experimentos. se muestran imágenes representativas de FCM y Western blot.
SB225002 inducida por apoptosis y mitosis en las células Ovča CDDP-sensibles y resistentes a
Para determinar si el antagonista CXCR2 SB225002 causaría celular la muerte de las células Ovča cisplatino-sensibles y resistentes, se evaluó la apoptosis morfológicamente en OV2008 /C13 * (tanto de tipo salvaje de p53) y A2780s /A2780cp células (p53 de tipo salvaje y mutante p53, respectivamente) después del tratamiento con SB225002 o CDDP durante 24 marido. Como era de esperar, CDDP inducida por apoptosis (evidente por la contracción citoplasmática, la condensación de cromatina y fragmentación nuclear) en células quimio-sensible (OV2008 y A2780s) pero no en las células resistentes (C13 * y A2780cp). Por el contrario, SB225002 apoptosis inducida en todas las líneas celulares en una manera dependiente de la concentración (Fig. 2A), una observación apoyada por activación de caspasa 3 y la escisión de PARP (Fig. 2B). Curiosamente, las células "flor-como" con cromosomas grandes y no condensados fueron evidentes tras la exposición a SB225002 (≥500 nM; Fig. 2C)., Que se asocia con un aumento de la acumulación de células en G2 /M y sub-G1 fases (Figura 2D - Superior). La mayor parte de la población fase aumento de G2 /M era fosfo-histona H3 células positivas (Fig. 2D-bajo), lo que sugiere que SB225002 aumenta el número de células mitóticas, posiblemente por cualquiera de promover la entrada mitosis prematura o retrasar la salida mitosis.
a: CDDP (0-10 M, 24 h) la apoptosis inducida en OV2008 quimio-sensible y A2780s pero no sus contrapartes resistentes C13 * y A2780cp, mientras que SB225002 (0-1000 nM, 24 h) inducida por la apoptosis en células de todo líneas. Los OVCAs fueron tratados con diferentes concentraciones de SB225002 o de CDDP durante 24 h. El adjunto (viable) y flotante se agruparon las células (apoptosis), se lavaron y se resuspendieron en formalina tamponada neutra (4%) que contiene Hoechst 33258 tinte (3,75 ng /ml, 24 h). El porcentaje de apoptosis se determinó con base en la morfología nuclear. Al menos 400 células se contaron en cada grupo y el contador "cegado" para probar la identidad de evitar el sesgo experimental. B: SB225002 inducida por la activación de la caspasa 3 y la escisión de PARP (Western blot) en todas las células examinadas Ovča. C: SB225002 inducida por las características morfológicas de la apoptosis en OV2008, que fue acompañado por las células de la mitosis similares. análisis de citometría de flujo de distribución del ciclo celular de OV2008 después del tratamiento SB225002 a diversas concentraciones (0, 250, 500, 750 y 1000 nM) durante 24 h: D. Las células en fase M se identificaron con anti-fosfo-histona H3 (P-H3), como se muestra en los gráficos de puntos (más bajo). Las imágenes son representativos de al menos tres experimentos.
SB225002 inducida por la apoptosis en células de tipo salvaje a través de P53 Ovča p53 activación
P53 es esencial para la inducción de la apoptosis en células Ovča, y es un determinante de la sensibilidad CDDP [25]. Como se muestra en la Fig. 3A, SB225002 (≥500 nM) significativamente hasta reguladas p53 total y fosfo-p53 (Ser15) en todas las líneas celulares examinadas. Silenciamiento de p53 por siRNA el regulado apoptosis SB225002 inducida tanto en las células OV2008 y C13 * (Fig. 3B), sugiriendo que SB225002 induce la apoptosis a través de la activación de p53. Por el contrario, el número de células positivas H3-fosfato histona no fue afectada por p53 siRNA (Fig. 3C), lo que sugiere el papel de p53 en la apoptosis SB225002 inducida no depende de la acumulación de células mitótico.
R: SB225002 (0-1000 nM, 24 h) mayor total- y el nivel de fosfo-p53 (S15) en OV2008, C13 *, células A2780s y el aumento de fosfo-p53 en células A2780cp. SB225002 aumentó la proporción de fosfo-p53 /p53-total en todas las líneas celulares (Western blot). B: El silenciamiento de p53 [p53 siRNA (100 nM, 36 h, o scramble siRNA (control)] disminuido SB225002 (750 nM, 24 h) inducida por la apoptosis, pero no la mitosis en OV2008 y C13 * células C:. El silenciamiento de p53 no tuvo ningún efecto en el número de células de entrar en mitosis en las células OV2008 y C13 * tratados con SD225002 a 750 nm. celular en la mitosis fueron identificados por FCM, utilizando anti-fosfo-histona H3 (H3-P).
SB225005 inducida por acumulación de pre-madura de la mitosis y la subsiguiente apoptosis en p53 de tipo salvaje y deficiente Ovča células
Desde SB225002 inducida por la acumulación de la mitosis en tanto-p53 de tipo salvaje y las células deficientes Ovča, que determina además si el SB225002 acumulación celular mitótica inducida contribuyó a la apoptosis. SB225002 tratamiento causó un aumento dependiente del tiempo en el porcentaje de células mitóticas (fosfo-histona H3 positivo), que comenzó a las 6 h, el aumento y una duración de 24 h, a continuación, la disminución a partir de entonces. SB225002 indujo un aumento tarde en la población celular en la fase sub-G1 (apoptosis), a partir de las 12 h, y alcanzando un máximo a las 48 h. La pérdida dependiente del tiempo en células mitóticas después de la exposición 24 h de SB225002 se asoció con un aumento marcado en las células apoptóticas, lo que sugiere que SB225002 causada células OV2008 para detener en la mitosis antes de progresar en la apoptosis (Fig. 4A).
a: la inducción dependiente del tiempo de la mitosis (círculos rellenos) y posteriormente apoptosis (cuadrados rellenos) en células OV2008 por SB225002. B: 24 h después del tratamiento SB225002, husos mitóticos se visualizaron con un Alexa Fluor® conjugado con anti-α-tubulina (verde) y contratinción con Hoechst (azul). En las células de control, huso bipolar normal, estaba bien organizado con los cromosomas condensados altamente alineados a lo largo de las placas ecuatoriales durante cromátidas meta-fase y hermanas segregado en el inicio de la anafase (B-1). células SB225002 tratados muestran aberraciones mitóticas. Las frecuencias de material cromosómico de revestimiento, husos mitóticos multipolares y múltiples núcleos fueron aumentados en células SB225002 tratados (B-2, B-3). C:. Cromosoma extiende mostrando SB225002 inducida por aneuploidía /poliploidía
La morfología de las células en mitosis inducida por SB225002 fue confirmado, además de la formación del huso, condensación de la cromatina, y β-tubulina y la separación de ADN. En las células de control, huso bipolar normal se bien organizado en una forma oval, los cromosomas condensados altamente alineados a lo largo de las placas ecuatoriales durante cromátidas meta-fase y de la hermana segregados en el inicio de la anafase. SB225002 aumentó la formación de determinados tipos de husos multipolares, como en seudobipolar, tripolar y células multipolares. No hubo tampoco ninguna condensación de los cromosomas durante la profase, los cromosomas condensados o no para alinear correctamente a lo largo de las placas ecuatoriales durante la metafase sino que se extendió a lo largo de las células. Célula entre en la anafase mostró la pérdida de cromosomas obvio, indicativo de la segregación de cromosomas anormales en las células mitóticas detenidos-SB-225002. SB225002 también indujo la aparición de múltiples núcleos, que fue más frecuente con una exposición más larga (Fig. 4B). mitosis aberrante se asoció con células aneuploidía /poliploidía, como se verifica por el ensayo de propagación de cromosoma (Fig. 4C). En conjunto, nuestros datos demostraron que SB225002 causada husos mitóticos anormales, alteración de la segregación de cromosomas en las células mitóticas detenidos, y resultó en la división celular anormal y formación de múltiples núcleos, todos los cuales eran indicativos de mitosis prematuro, un evento finalmente condujo a la catástrofe mitótica.
SB225002 inducida mitótico catástrofe es a través de Chk1 descenso de regulación y Cdk1 activación
resultados de daño en el ADN en la activación de Chk1, lo que conduce a la degradación CDC25, disminución de la actividad Cdk1 y G2 detención [10]. Hemos demostrado que las células tratadas con SB225002 Ovča salieron fase G2 y entraron en la fase M, y se les realizó la mitosis prematuro, lo que sugiere G2 /M desregulación puesto de control de fase. Por lo tanto, se investigó si la inactivación y la activación de Chk1 Cdk1 estuvo involucrado en la acción SB225002. SB225002 disminuyó total y fosfo-Chk1 (S345) los niveles de una manera dependiente de la concentración (Fig. 5A), lo que sugiere que la promoción de la entrada prematura mitosis por SB225002 se asocia con la inhibición de Chk1 y activación prematura Cdk1. Esta idea fue apoyada por la observación de que el tratamiento previo con el inhibidor de la Cdk1 roscovotine impedía la acumulación de células mitótico SB225002 inducida y la apoptosis (Fig. 5B). Tomados en conjunto, estos resultados indican que SB225002 es capaz de promover la apoptosis a través de catástrofe mitótica probablemente a través de la activación Cdk1
A:. SB225002 (0-1000 nM, 24 h) disminuyó total y fosfo-Chk1 (S317 y S345 ) niveles en células OV2008. B: El tratamiento previo de las células OV2008 con roscovotine (12 h) atenuó SB225002 (750 nM, 24 h) inducida por la acumulación de la fase M y la reducción de la apoptosis posterior. * P & lt;. 0,05 (en comparación con SB225002 solo)
Reconstitución de p53 de tipo salvaje en P53 nulo OVCA célula atenuada catástrofe mitótica inducida por SB225002
Para determinar si p53 está implicado en SB225002 inducida mitótico catástrofe, la línea celular de cáncer de ovario p53 nula SKOV3 se trató con SB225002. SB225002 indujo una acumulación dependiente de la concentración celular mitótica y apoptosis en las células SKOV3 (Fig 6A & amp;. 6B). El aumento de la apoptosis fue dependiente del tiempo y en el tiempo en relación con la mitosis SB225002 inducida (Fig. 6 C), lo que sugiere que p53 es necesario para la catástrofe mitótica SB225002 inducida. A fin de evaluar la acción de p53 en la catástrofe mitótica inducida por SB225002, examinamos si la reconstitución de p53 de tipo salvaje en las células deficientes en p53 podría cambiar acumulación mitótico SB225002 inducida y la apoptosis. células SKOV3 se infectaron con p53 adenoviral de tipo salvaje (confirmado por Western blot; Fig. 6D). Como era de esperar, la exposición de SB225002 solo indujo notablemente la mitosis a las 24 h, y se marca la apoptosis a las 48 h. Reconstitución de p53 de tipo salvaje marcadamente impedido mitosis SB225002 inducida a las 24 h, y atenúa la apoptosis posterior inducida por SB225002 a las 48 h (Fig. 6D, 6E). La apoptosis se confirmó adicionalmente por escisión de PARP a las 24 h por Western blot (Fig. 6D). Nuestros resultados indican que p53 atenúa la apoptosis tardía SB225002 inducida a través de la supresión de la acumulación prematuro de las células en mitosis. En conjunto, estos hallazgos sugieren que p53 juega un papel opuesto en la apoptosis inducida por SB225002 de células Ovča, induciendo apoptosis clásica a través de la activación de p53 y la prevención de la apoptosis a través de la catástrofe mitótica
A:. SB225002 (0 a 1000 nM, 24 h) la apoptosis inducida en células SKOV3 (superior). B: SB225002 aumentó SKOV3 en la fase sub-G1 (células apoptóticas) y la mitosis (fosfo-histona H3-positivo; dot parcelas). C: El curso temporal de (cuadrados rellenos) SB225002 inducida por la mitosis (círculos rellenos) y la apoptosis [citometría de flujo]. Húmedo; E: infección p53 de tipo salvaje Adenviral (MOI = 10; LacZ adenoviral para igualar total de MOI en cada grupo experimental) de SKOV3 atenuada SB225002 (750 nM; DMSO como control) inducida por mitosis y la posterior apoptosis. contenido de p53 y la escisión de PARP se evaluaron a las 24 h (Western blot). la progresión del ciclo celular se evaluó por citometría de flujo. Los valores son medias ± SEM. * P £ 0,05 (en comparación con DMSO-control).
#P £ 0,05 (en comparación con las células tratadas con SB225002).
SB225002 inducida por apoptosis y la catastrófica La mitosis no fue a través de bloqueo de CXCR2 receptor de señalización
Desde SB225002 es una específica antagonista no peptídico de CXCR2, que a continuación se investigó si la acción de SB225002 está mediada a través de CXCR2. En primer lugar, nos pre-tratado con células OV2008 y C13 * con diferentes concentraciones de IL-8 durante 2 h antes cultivándolas con SB225002 (750 nM) durante 24 h más. Inesperadamente, el tratamiento previo con IL-8 o GRO-1 no inhibir la mitosis o apoptosis SB225002 inducida (Fig. S1A), indicando que la mitosis y apoptosis SB225002 inducida no pueden ser mediados a través de CXCR2. Además, el tratamiento previo de las células con CXCR2 anticuerpo neutralizante y otro antagonista de /CXCR2-G31P [33] CXCR1 no tuvo efecto sobre la apoptosis basal o inducida por SB225002 y la mitosis en OV2008 y C13 * (Fig. S1B y S1C). Por otra parte, otro inhibidor específico de CXCR2, SB265610 no tuvo efecto sobre basal y la apoptosis inducida por SB225002 y detención de la mitosis (Fig S2A & amp;. B & amp; C) y la activación de p53 y la inhibición de Chk1 en OV2008 (Fig S2D.). En conjunto, estos hallazgos apoyan la idea de que SB225002 induce la apoptosis y catástrofe mitótica en las células independientes de la Ovča CXCR2.
Discusión
En el presente estudio, hemos demostrado que SB225002, un no-péptido CXCR2 antagonista, es eficaz en la inducción de apoptosis en interfases de punto de control y la mitosis en ambas líneas celulares Ovča CDDP-sensibles y resistentes con diferente estado de p53. El tratamiento de las células de cáncer con SB225002 dio lugar a la apoptosis mediada por p53 clásica pero también provocó la catástrofe mitótica en p53 de tipo salvaje y las células Ovča deficientes. SB225002 inducida catástrofe mitótica mediante la promoción de husos mitóticos anormales, alteración de la segregación de cromosomas en las células mitóticas detenidos, y causó la división celular anormal y formación de múltiples núcleos. Estos cambios fueron abrogadas por roscovotine, lo que sugiere que la ciclina B /CDK1 se había activado a través de la baja regulación de la quinasa Chk1 puesto de control. Los efectos de SB225002 no fueron moduladas por el tratamiento previo con ligandos CXCR2 o su anticuerpo neutralizante, ni imitados por otra CXCR2 antagonista SB265610 o G31P. Nuestro estudio proporciona la primera demostración de que la muerte celular inducida por SB225002 no sólo a través de la apoptosis convencional, sino también a través de catástrofe mitótica de manera independiente CXCR2.
Nuestro estudio mostraron que tanto la p53 de tipo salvaje y las células deficientes Ovča responden a SB225002 en la inducción de apoptosis, aunque a través de diferentes mecanismos. P53 puede o bien activar la apoptosis a través de la activación de la intrínseca (mitocondrial) y extrínseca (muerte-receptor) vía apoptótica a través de genómica [33], [34] y [27], [28] mecanismos no genómicos.