Resumen
inhibidores de serina proteasa (serpinas) parecen expresarse de forma ubicua en una variedad de las especies y desempeñar papeles importantes en procesos fisiológicos fundamentales tales como la angiogénesis, la respuesta inmune, la coagulación sanguínea y fibrinolisis. De estos, antígeno de carcinoma de células escamosas 1 (SCCA1), también conocido como un SERPINB3, se identificó por primera vez en tejido de carcinoma de células escamosas del cuello uterino de la mujer. Sin embargo, no se sabe poco acerca de la expresión SERPINB3 en el cáncer de ovario epitelial humana (EOC). Por lo tanto, en el presente estudio, se investigó el papel funcional de los
SERPINB3
gen en EOC humano utilizando pollos, el modelo animal más relevante. En 136 pollos, EOC se encontró en 10 (7,4%).
SERPINB3
mRNA fue inducida en canceroso, pero no ovarios normales de pollos (P & lt; 0,01), y era abundante solamente en el epitelio glandular de ovarios cancerosos de pollos. Además, varios microARN, específicamente
miR-101, miR-1668
y
MIR-1681
fueron descubiertos para influir en
SERPINB3
expresión a través de su extremo 3 'UTR que sugiere que influencias de regulación post-transcripcional
SERPINB3
expresión en pollos. proteína SERPINB3 se localizó predominantemente en el epitelio glandular en los ovarios cancerosos de pollos, y era abundante en el núcleo de las dos líneas celulares de cáncer de ovario humano y de pollo. En 109 pacientes humanos con EOC, 15 (13,8%), 66 (60,6%) y 28 (25,7%) pacientes mostraron una expresión débil, moderada y fuerte de la proteína SERPINB3, respectivamente. Fuerte expresión de la proteína SERPINB3 era un factor pronóstico de resistencia de platino (OR ajustada; odds ratio, 5,94; 95% de los límites de confianza, 1.21-29.15), y por la pobre supervivencia libre de progresión (SLP; razón de riesgo, 2,07;; HR ajustado 95 IC%; intervalo de confianza, 1,03-4,41). Por lo tanto, SERPINB3 puede jugar un papel importante en la carcinogénesis de ovario y ser un nuevo biomarcador para predecir la resistencia de platino y un mal pronóstico para la supervivencia en pacientes con EOC
Visto:. Lim W, Kim SA, Jeong W, Ahn SE , Kim J, Kim YB, et al. (2012) SERPINB3 en el Modelo de pollo de cáncer de ovario: un factor pronóstico de resistencia de platino y la supervivencia en pacientes con cáncer ovárico epitelial. PLoS ONE 7 (11): e49869. doi: 10.1371 /journal.pone.0049869
Editor: Wendong Huang, Instituto de Investigación Beckman de la Ciudad de la Esperanza, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de abril, 2012; Aceptado: 15 Octubre 2012; Publicado: 21 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Lim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado por el programa de la Universidad de Clase Mundial (WCU) (R31-10056) y por el programa de Investigación de Ciencias básicas (2010 a 0013078) a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología, y también por una subvención del 21 BioGreen Programa de próxima generación (núm PJ008142), Administración de Desarrollo Rural, República de Corea. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de ovario
epitelial (EOC) es el 7
ª causa principal de muerte por cáncer en mujeres en todo el mundo [1], [2]. La importancia clínica ha crecido en mayor medida porque no hay síntomas relevantes y no existen métodos eficaces de detección para la detección temprana [3], lo que conduce a la Federación Internacional de Ginecólogos (FIGO) Etapas de la enfermedad III-IV en el momento del diagnóstico en más de 75 % de pacientes con EOC [4]. Aunque la enfermedad en estadio temprano, así la diferenciación, la sensibilidad al platino y cirugía citorreductora óptima se han sugerido como factores pronósticos favorables, pero su valor en el pronóstico no se ha mejorado notablemente [5]. Por lo tanto, la detección temprana del COE y la predicción de pronóstico para la supervivencia del paciente a través de biomarcadores específicos se reconoce cada vez más como un mejor enfoque para superar estas limitaciones. Para este propósito, modelos de roedores manipulados genéticamente se han desarrollado para elucidar la etiología y la patogénesis de EOC. Sin embargo, la naturaleza artificial de los tumores inducidos en ratones limita su relevancia clínica [6], [7], [8]. Mientras tanto, la gallina ponedora es bien conocido como el único animal que se desarrolla de forma espontánea tumores del epitelio superficial del ovario, y la gallina ponedora es un modelo único y adecuado para el desarrollo de nuevos biomarcadores y fármacos contra el cáncer para los pacientes con EOC [6], [7 ], [9].
inhibidor de serpina peptidasa, subtipo B, miembro de 3 gratis (
SERPINB3
) es un miembro de la superfamilia de la serpina de inhibidores de proteasas implicadas en la apoptosis, respuesta inmune, coagulación de la sangre, la migración celular y la invasividad de las células [10], [11]. También se conoce como antígeno de células escamosas carcinoma 1 (SCCA1) primero descubierto en el carcinoma de células escamosas del cuello uterino [12]. En los seres humanos, el gen para
SERPINB3
está situado en 18q21.3 del cromosoma, y que inhibe las proteasas lisosomales cisteína papaína-como, catepsina K (CTSK), CTSL y CTSS [10], [13]. Anteriormente, hemos identificado
SERPINB3 Hoteles en pollos y determinado que tiene homología moderada a su ortólogo de proteínas de mamíferos (aproximadamente 36-47%). SERPINB3 aviar se expresa en el oviducto en respuesta a los estrógenos de una manera de tejido y específica de la célula [14]. Sin embargo, poco se sabe acerca de la expresión y el valor pronóstico de
SERPINB3 Hoteles en cualquiera de los pollos o humanos con EOC.
Los microARN (miRNA) son pequeñas y los ARN de 18-23 nucleótidos no codificantes en longitud. Los que regulan la expresión de genes post-transcripcional y también son capaces de alterar el destino celular mediante el control de la traducción de ARNm diana en diversos tejidos y tipos celulares. Por lo tanto, los miRNAs juegan papeles cruciales en un varios procesos biológicos, incluyendo el crecimiento de los vertebrados, el desarrollo, la diferenciación y la oncogénesis mediante la regulación de la expresión de genes [15], [16], [17]. Sin embargo, no hay resultados publicados de la investigación relacionada con los genes miARN SERPINB3 en pollos. Con el fin de determinar el papel de SERPINB3 como un nuevo marcador biológico para el COE, se comparó la distribución y localización de SERPINB3 entre los ovarios normales y cancerosas de las gallinas ponedoras, y luego se realizó un ensayo de validación de los genes miARN objetivo de investigar la regulación post-transcripcional de
SERPINB3
expresión. Después de que se comparó la expresión SERPINB3 entre las células normales y cancerosas de los ovarios de las gallinas ponedoras, líneas celulares humanas (EOC OVCAR-3 y Skov-3) y una línea celular de teratocarcinoma de ovario humano (AP-1). Por último, se determinó los valores de diagnóstico y pronóstico de la expresión SERPINB3 en pacientes con EOC.
Resultados
expresión y localización de SERPINB3 ARNm y proteínas en condiciones normales y cancerosas Los ovarios de las gallinas ponedoras
Las comparaciones de expresión de
SERPINB3
mRNA entre ovarios normales y cancerosas de las gallinas ponedoras por RT-PCR reveló que se expresó en sólo ovarios cancerosas (Fig. 1A y 1B). Por otra parte, RT-PCR cuantitativa mostró que
SERPINB3
mRNA fue inducida sólo en los ovarios cancerosos (
P Hotel & lt; 0,01; Fig. 1C). Estos resultados sugieren que
SERPINB3
es un biomarcador para el cáncer de ovario epitelios derivados de las gallinas ponedoras.
análisis de RT-PCR se realizó utilizando moldes de cDNA de pollo
SERPINB3
y
GAPDH
cebadores específicos de. [A] Los carriles 1 a 4 muestran cuatro diferentes ovarios normales y N es el control negativo. [B] Lanes 1-10 muestran 10 ovarios cancerosos diferentes. Análisis [C] RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando moldes de cDNA a partir de ovarios normales y cancerosas de las gallinas ponedoras (media ± SEM; P & lt; 0,01).
In situ
análisis de hibridación demostraron que
SERPINB3
ARNm era abundante en el epitelio glandular de ovarios cancerosos de gallinas ponedoras (Fig. 2A), pero no era detectable en el estroma, los vasos sanguíneos o células inmunes de los ovarios cancerosos. De acuerdo con estos resultados, se detectó proteína SERPINB3 predominantemente en el citoplasma de epitelio glandular en canceroso, pero no ovarios normales de gallinas ponedoras (Fig. 2B). Estos resultados indican que SERPINB3 se expresa específicamente sólo en el epitelio glandular de ovarios cancerosos de las gallinas ponedoras.
[A]
In situ
análisis de hibridación de
SERPINB3
ARNm. Las secciones transversales de los ovarios normales y cancerosas de las gallinas ponedoras se hibridaron con sentido o antisentido de pollo
SERPINB3
cRNA sondas. [B] expresión inmunohistoquímica de la proteína SERPINB3: Para el control negativo, el anticuerpo primario fue sustituido con IgG purificada de ratón no inmune. F, folículo; GE, epitelio glandular; S, estroma;
La barra de escala representa
200 micras (los primeros paneles columnares y sentido) o 50 micras (los segundos paneles de columna).
después de la regulación transcripcional de microRNAs que afectan SERPINB3
Para investigar la posibilidad de que
SERPINB3
expresión está regulada a nivel post-transcripcional por miRNAs, se realizó un ensayo de validación de dianas miARN. El análisis de los posibles sitios de unión dentro de miARN la 3'-UTR de
SERPINB3
utilizando una base de datos de predicción de genes miARN objetivo (miRDB; http://mirdb.org/miRDB/) reveló tres putativo sitio de unión para
MIR -101, MIR-1668
y
MIR-1681 gratis (Figura 3A). Por lo tanto, a fin de determinar si estos tres miRNAs influenciados
SERPINB3
expresión a través de su extremo 3 'UTR. Un fragmento de la
SERPINB3
3'-UTR albergar sitios de unión para los miRNAs se clonó aguas abajo del marco de lectura proteína fluorescente verde (GFP), creando con ello un indicador fluorescente para la función de la región 3'-UTR. Además, SERPINB3 3'-UTR mutantes incluyendo mutado sitios de unión
miR-101
,
MIR-1668
y
MIR-1681
también fueron generados por mutación puntual en para confirmar la modulación de la expresión eGFP por cada miRNA (Figura 3B). Después de la co-transfección de EGFP-
SERPINB3
3'-UTR y DsRed-miARN, la intensidad de la expresión de GFP y el porcentaje de células que expresan GFP se analizaron por microscopía de fluorescencia y FACS (Figura 3C y 3D). En presencia de
miR-101, miR-1668
y
MIR-1681
, la intensidad y el porcentaje de células que expresan GFP (44,8% en el control frente a 27,5% en
miR-101
, 24,2% en
MIR-1668
, 14,8% en
MIR-1681
) disminuyó (P & lt; 0,01). Sin embargo, cuando no había co-transfección de EGFP
SERPINB3
mutantes 3'-UTR, la intensidad y el porcentaje de células que expresan GFP no cambiaron (14,8% en el control frente a 16,1% en
MIR -101
, 13,5% en
MIR-1668
, 14,3% en
MIR-1681
) como control (Figura 3D). Estos resultados indican que estos tres miRNAs se unen directamente a la
SERPINB3 Versión taquigráfica y regular
SERPINB3
la expresión de genes transcripcionalmente puesto.
[A] Diagrama de
miR 101, miR-1668
y
MIR-1681
sitios de unión en
SERPINB3
3'-UTR. [B] Expresión mapas vectoriales para eGFP con
SERPINB3
3'-UTR y mutado
SERPINB3
3'-UTR y Ds-rojo con cada uno de los genes miARN. La de tipo salvaje (WT) y mutantes de 3'-UTR de la
SERPINB3
transcripción se subclonaron entre el gen eGFP y la cola de poliA para generar la construcción de fusión de la transcripción del GFP después de la diana miRNA 3'- UTR (pcDNA-eGFP-3'UTR) (parte superior y panel central) y la expresión de los genes miARN vector fue diseñado para co-expresa DsRed y cada miARN (pcDNA-DsRed-miARN) (panel inferior). [C] Después de la co-transfección de pcDNA-eGFP-3'UTR para el
SERPINB3 Versión taquigráfica y pcDNA-DsRed-miARN para el
miR-101, miR-1668
y
MIR-1681
, se detectaron las señales de fluorescencia de GFP y DsRed mediante microscopía fluorescente. [D] La tasa de inhibición de la expresión eGFP de la modulación de los genes miARN se calculó por células activadas por fluorescencia (FACS). Las barras sólidas representan WT de
SERPINB3
3'-UTR y bares vacíos muestran la mutante de
SERPINB3
3'-UTR para cada miARN. Las barras de error indican analiza el error estándar de tres ejemplares. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre WT vs mutantes (*** P & lt; 0,001).
Detección de inmunofluorescencia de la proteína SERPINB3 de pollo y cáncer de ovario humano Las células
Para comparar el los patrones de expresión de la proteína SERPINB3 entre el pollo y las células de cáncer de ovario humano, se realizó un análisis de inmunofluorescencia. proteína SERPINB3 rara vez se detectó en las células normales, pero abundante en el núcleo de las células de cáncer de ovario de gallinas ponedoras (Fig. 4A). Del mismo modo, la proteína SERPINB3 era abundante en el núcleo de tres líneas celulares de cáncer de ovario humano, células OVCAR-3, SKOV-3 y PA-1 (Fig. 4B).
[A] proteína SERPINB3 rara vez se detecta en las células normales, pero abundante en los núcleos de las células de cáncer de ovario de pollo. [B] SERPINB3 proteína se expresó en los núcleos de, Skov-3 y PA-1 en las células OVCAR-3 humana. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). Todas las imágenes fueron capturadas a un aumento de 40X objetivo.
Protein Expression SERPINB3 se asocia con resistencia de platino y la supervivencia en pacientes con cáncer de ovario epitelial
Un total de 109 pacientes con una edad media de 52 años (rango, 23-82 años) se inscribieron en el estudio actual. Entre todos los pacientes, 38 (34,9%) se encontraban en estadio I FIGO, 20 (18,3%) en la fase II, y 51 (46,8%) en el estadio III. El grado del tumor fue G1 en 21 (19,3%), G2 en 41 (37,6%) y G3 en 47 pacientes (43,1%). Histológicamente, 62 tumores (57%) fueron diagnosticados con carcinoma seroso, 17 (15,6%) con carcinoma mucinoso, 12 (11%) con carcinoma de células claras, 9 (8,3%) con carcinoma endometrioide, 4 (3,6%) con carcinoma indiferenciado y 3 (2,7%) con endometrioide y el carcinoma de células claras, y 2 (1,8%) con carcinoma de células serosas y claras. cirugía citorreductora óptima se realizó en 65 pacientes (59,6%), mientras que 44 (40,4%) fueron sometidos a cirugía de citorreducción subóptima. Noventa pacientes (82,6%) recibieron la quimioterapia adyuvante después de la cirugía, y 84 (93,3%) recibieron paclitaxel /carboplatino mientras paclitaxel /cisplatino se administró a 6 (6,7%) pacientes. Los resultados del análisis de inmunohistoquímica revelaron que la proteína SERPINB3 fue detectado principalmente en el epitelio glandular que para el modelo de gallinas ponedoras, y 15 (13,8%), 66 (60,6%) y 28 (25,7%) pacientes tenían expresión débil, moderada y fuerte de la proteína SERPINB3 en el epitelio glandular de ovario, respectivamente (Fig. 5).
se detectó (ay a ') débil, (b') y moderada (C y C ') fuerte expresión de la proteína en las mujeres con SERPINB3 cáncer de ovario epitelial. No hubo tampoco ninguna expresión de muy débil expresión de SERPINB3 en los ovarios normales, mientras que protine SERPINB3 era fácilmente detectable en los ovarios cancerosos de las mujeres. El control negativo usado fue IgG de ratón en lugar de anticuerpo primario.
La barra de escala representa
200 micras (los primeros paneles horizontales y IgG) o 50 micras (los segundos paneles horizontales).
El tiempo medio de seguimiento fue de 69,2 meses (rango , 2-88 meses) y 70 pacientes (77,8%) mostraron sensibilidad al platino, mientras que 20 (22,2%) mostraron resistencia de platino. Fuerte expresión de la proteína SERPINB3 fue más frecuente en pacientes con resistencia de platino (n = 11, 55%) que en aquellos con sensibilidad al platino (n = 17, 24,3%) (
P
= 0,01). Fuerte expresión de la proteína SERPINB3 también fue un factor pronóstico independiente de resistencia de platino después de los ajustes utilizando factores clínico-patológicos (OR ajustada; odds ratio, 5,94; IC del 95%, 1,21-29,15) (Tabla 1). Fuerte expresión de SERPINB3 se asoció con PFS más cortas que la expresión débil o moderada (media PFS fueron 25,7 vs 47,8 meses;
P
= 0,03), a pesar de diferencias en OS (sistema operativo quiere decir; la supervivencia global, 49,5 vs . 60.9 meses;
P Hotel & gt; 0,05). Por otra parte, SERPINB3 era un factor de mal pronóstico para la SLP (supervivencia libre de progresión), utilizando análisis multivariante de riesgos proporcionales de Cox (HR ajustada; razón de riesgo, 2,07; IC del 95%; intervalo de confianza, 1,03 a 4,41; Tabla 2), mientras que no hubo factor de valor pronóstico para el sistema operativo, excepto citorreducción subóptima (HR ajustado, 6,83; IC del 95%, 2,34-20,02).
Discusión
La gallina ponedora es un conocido modelo para la investigación de la carcinogénesis ovárica y para el desarrollo de agentes anti-cáncer para las mujeres debido a la similitud en los carcinomas que surgen espontáneamente a partir de células epiteliales de ovario [18]. Histología, metástasis y etapas del COE en las gallinas ponedoras son similares a los de los humanos, que indica la posibilidad de utilizar el modelo de gallinas ponedoras para la investigación de la carcinogénesis de ovario [6]. Por otra parte, varios biomarcadores, incluyendo CA-125, normalmente se expresan y se utilizan para la detección de la enfermedad en etapa temprana y monitorización de la respuesta terapéutica en mujeres con CEO y son de reacción cruzada con los biomarcadores de EOC en las gallinas ponedoras [18], [19].
en general, una serie de arquitecturas complejas glandulares se encuentran generalmente en varios carcinomas que surgen en diversos órganos, como el estómago, bronquios, más alegre, próstata, testículo y ovario debido a la naturaleza ubicua de las glándulas. Especialmente, en los ovarios de las especies tanto de aves como de mamíferos, estas estructuras glandulares son principalmente en tumores de tipo endometrioide con varias características como la atipia nuclear, focos cribiforme y atresia de los folículos del estroma. Además, las glándulas de adenocarcinomas en mujeres consisten en una sola capa de células epiteliales en mitosis y márgenes luminales afilados [6]. Nuestros resultados preliminares también mostraron que la arquitectura glandular en carcinomas epiteliales de ovario primarios de gallinas ponedoras se compone de un laberinto de glándulas o papilar lacelike plegables con núcleos grandes plieomorphic que contiene figuras mitóticas como [6] se informó anteriormente. El estudio actual para encontrar un nuevo biomarcador pronóstico para los pacientes con EOC utilizando el modelo de gallina ponedora identificado una alta expresión de
SERPINB3
génica en el epitelio glandular de ovarios cancerosos en comparación a la de los ovarios normales de gallinas. Los resultados sugieren que SERPINB3 puede estar asociado con la carcinogénesis de ovario a través de la activación de factores de transcripción o la inhibición de la apoptosis. Nuestros resultados también revelaron que
SERPINB3
la expresión génica es post-transcripcionalmente regulada por varios miRNAs críticas para el desarrollo de la carcinogénesis de ovario de pollo. Por otra parte, la fuerte expresión de la proteína SERPINB3 estaba relacionada con la resistencia de platino y la supervivencia libre de progresión más corta en pacientes con EOC. Estos resultados apoyan nuestra hipótesis de que SERPINB3 juega un papel en el desarrollo del tumor y la proliferación de las células epiteliales de ovario.
A pesar de que el papel funcional de
SERPINB3
gen en biología EOC no se conoce, los resultados del presente estudio indican claramente que
SERPINB3
se asocia con la morfogénesis glandular que afecta a la carcinogénesis de ovarios de las gallinas y las mujeres con EOC. En mujeres y gallinas, SERPINB3 se expresa en el epitelio glandular, pero hay poca o ninguna expresión SERPINB3 en otros tejidos y células del estroma incluyendo los vasos sanguíneos y del ovario. Estos resultados indican que la proteína SERPINB3 puede activar factores de transcripción o inhibir la apoptosis que conduce al desarrollo de EOC en las gallinas ponedoras y mujeres. En estudios previos, se encontró SERPINB3 para regular la muerte celular programada por diferentes mecanismos en varios tipos de cáncer y su sobre-expresión era característica de las células cancerosas de origen epitelial. Además, SERPINB3 atenúa la apoptosis mediada por fármacos contra el cáncer de las células NK y mediante la inhibición de la liberación del citocromo c de la mitocondria [20], [21], [22] Por otra parte, la morfogénesis glandular relacionado con
SERPINB3
puede contribuir transición epitelial-mesenquimal, que puede desregular el proceso de adhesión para permitir metástasis y aumentar el potencial de invasividad de las células tumorales en las mujeres [23].
fuerte expresión de SERPINB3 también se asoció con resistencia de platino y la SSP más corto en pacientes con EOC. El mecanismo responsable del desarrollo de quimiorresistencia y un papel potencial para SERPINB3 no se ha establecido en EOC. Sin embargo, la permeabilización disfuncional de los lisosomas contribuye al desarrollo de quimiorresistencia en células de cáncer de ovario [24], y SERPINB3 confiere resistencia a la apoptosis inducida por fármacos mediante la inhibición de las proteasas catepsina lisosómicas en células de cáncer [25]. Por lo tanto, SERPINB3 puede contribuir a la resistencia de platino siguiente desestabilización lisosomales inducida por quimioterapia. Aunque fuerte expresión de SERPINB3 se asoció con PFS más cortos, es posible que la resistencia de platino asociado con SERPINB3 conduce a PFS más cortos. Este hecho se apoya en un estudio previo en el que se encontró la expresión SERPINB3 estar asociado con una baja supervivencia en pacientes con cáncer de mama [26].
SERPINB3 o SCCA1 se ha investigado en varios tipos de carcinoma de células escamosas [27 ], [28], [29], [30], pero sólo ha sido sugerido como un factor pronóstico para el cáncer de mama y el adenocarcinoma de pulmón [26], [31]. A nuestro entender, los resultados del presente estudio son significativos en ser los primeros en establecer la probabilidad de un papel funcional para SERPINB3 en EOC de las gallinas ponedoras. Estos resultados validan la gallina ponedora como modelo para la investigación sobre EOC humano. Además, los resultados sugieren fuertemente que SERPINB3 tiene funciones importantes en el desarrollo del COE en las gallinas ponedoras y que se trata de un nuevo biomarcador para predecir la resistencia de platino y la SSP pobres en pacientes con EOC. Nuestra hipótesis de que SERPINB3 tiene un papel específico en el desarrollo de EOC humano requiere una evaluación adicional en estudios clínicos prospectivos.
Materiales y Métodos
Animales Experimentales y Cuidado de Animales y utilizar
La uso experimental de pollos en el presente estudio fue aprobado por el Instituto de Recursos animales de laboratorio, Universidad Nacional de Seúl. White Leghorn (WL) gallinas ponedoras fueron manejados de acuerdo con las normas aprobadas para el funcionamiento de la Universidad Animal Farm, de la Universidad Nacional de Seúl, Corea. Todas las gallinas tenían libre acceso
ad libitum
al alimento y al agua.
Muestras de Tejido de pollo Modelo
Un total de 136 gallinas ponedoras (88 más de 36 meses y 48 más de 24 meses de edad), que había dejado de poner huevos, se sacrificaron para la biopsia y la recogida de n = 10) ovarios (cancerosos. Como control, normal (n = 5) se recogieron ovarios de las gallinas ponedoras de huevos de la misma edad. Examinamos etapas tumorales en 10 gallinas con ovarios cancerosas basado en rasgos característicos de cáncer de ovario de pollo [6]. Tres gallinas tenían Etapa III EOC como células tumorales de ovario habían hecho metástasis en la superficie del tracto gastrointestinal y el hígado con ascitis profusas en la cavidad abdominal. En cinco gallinas, sus tumores se habían hecho metástasis en órganos distantes tales como el parénquima del hígado, pulmón, tracto gastrointestinal y el oviducto con ascitis profusas que es indicativo de la etapa IV EOC. Los otros dos gallinas no tenían tumores en cualquier otro órgano; Por lo tanto, sus tumores ováricos se clasificaron como estadio I EOC. Los subconjuntos de estas muestras se fijaron en paraformaldehído al 4% para análisis adicionales. Después de 24 h, los tejidos fijados se cambiaron a 70% de etanol durante 24 h y después se deshidrató y se embebieron en Paraplast-Plus (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Las gallinas con EOC fueron clasificados de acuerdo con sus subtipos celulares y los patrones de diferenciación celular, con referencia a los tipos de tumores malignos de ovario humano [6].
Aislamiento de ARN
El ARN celular total se aisló de los tejidos congelados utilizando reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las recomendaciones del fabricante. La cantidad y calidad de RNA total se determinó por espectrometría y desnaturalización electroforesis en gel de agarosa, respectivamente.
Análisis Semi-RT-PCR cuantitativa
La expresión de
SERPINB3
mRNA en ovarios normales y cancerosas de las gallinas se evaluó mediante semi-cuantitativos RT-PCR como se describe anteriormente [32]. ADN complementario (ADNc) se sintetizó a partir de ARN celular total (2 ug) usando hexámero aleatorio (Invitrogen, Carlsbad, CA) y cebadores oligo (dT) y AccuPower® RT premezcla (Bioneer, Daejeon, Corea). se diluyó la cDNA (01:10) en agua estéril antes de su uso en PCR. Después de la PCR, cantidades iguales de producto de la reacción se analizaron usando un gel de agarosa al 1%, y los productos de PCR se visualizaron usando tinción con bromuro de etidio.
RT-PCR cuantitativa Análisis
niveles de expresión génica se midieron utilizando SYBR Green (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) y un StepOnePlus ™ sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). [33] El
GAPDH
gen se analizó de forma simultánea como control y se utiliza para la normalización a la cuenta de la variación en la carga. Cada gen diana y
GAPDH
se analizó por triplicado. colorante ROX (Invitrogen) se utilizó como un control negativo para las mediciones de fluorescencia. Específicos de secuencia productos fueron identificados mediante la generación de una curva de fusión en la que el C
valor T representa el ciclo en el cual una señal fluorescente fue estadísticamente mayor que el fondo, y la expresión génica relativa se cuantificó utilizando el método 2
-ΔΔCT [34]. Para el control, la cuantificación relativa de la expresión génica se normalizó a la C
T del ovario control.
Hibridación in situ Análisis
Para sondas de hibridación, los productos PCR fueron generados y eran gel extraído y después se clonó en pGEM-T vector (Promega) como se describe anteriormente [35]. Después de la verificación de las secuencias, los plásmidos que contienen las secuencias de genes correctos se amplificaron con cebadores T7 y SP6-específico, entonces digoxigenina (DIG) sondas de ARN marcado con se transcribieron usando un kit de marcaje de ARN DIG (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Después de la hibridación y de bloqueo, las secciones se incubaron durante la noche con anticuerpo de oveja anti-DIG conjugado con fosfatasa alcalina (Roche). La señal se visualizó mediante exposición a una solución que contiene 0,4 mM 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato, 0,4 mM de nitroazul de tetrazolio, y levamisol 2 mM (Sigma).
MicroARN Target validación de un ensayo
El 3'-UTR de
SERPINB3
se clonó y se confirmó mediante secuenciación. El 3'-UTR se subclonó entre el gen eGFP y la hormona de crecimiento bovino (BGH) cola poli-A en pcDNA3eGFP (Clontech, Mountain View, CA) para generar el objetivo eGFP-miARN 3'-UTR (pcDNA-eGFP-3 "-UTR) construcciones de fusión. Además, los mutantes de SERPINB3 3'-UTR para cada miARN se generaron por mutación puntual y después se clonó en el mismo tipo de plásmidos. Para el ensayo de indicador de fluorescencia dual, las construcciones de fusión que contienen el gen y DsRed o bien
miR-101
,
MIR-1668
y
MIR-1681
fueron diseñados para ser co -expresada bajo el control del promotor de CMV (pcDNA-DsRed-miARN). El pcDNA-eGFP-3'-UTR y pcDNA-DsRed-miARN (4μg) fueron co-transfectadas en 293FT células utilizando el método de fosfato de calcio. Cuando la DsRed-miARN se expresa y se une al sitio de destino de la 3'-UTR de aguas abajo de la transcripción de GFP, la intensidad de fluorescencia verde disminuye debido a la degradación de la transcripción GFP. A las 48 h después de la transfección, la fluorescencia dual se detectó mediante microscopía de fluorescencia y se calcula por citometría de flujo FACSCalibur (BD Biosciences). Por citometría de flujo, las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% y se analizaron utilizando el software FlowJo (Árbol Star Inc., Ashland, Oregón).
Cultivo de células
Un total de cinco líneas celulares, incluyendo tres cáncer epitelial de ovario humano y dos células de ovario primarios de pollo, se utilizaron en este estudio. líneas celulares de cáncer de ovario humano (OVCAR-3, Skov-3, y PA-1) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron según las instrucciones del proveedor. Dos células epiteliales de pollo superficie del ovario diferentes (células normales y cancerosas) se aislaron y cultivaron como se ha descrito anteriormente con algunas modificaciones [36], [37].
Microscopía de inmunofluorescencia para la detección de activación SERPINB3
células de ovario de cáncer y células de ovario normales obtenidos de gallinas ponedoras, y tres líneas celulares de cáncer de ovario humano, OVCAR-3, SKOV-3, y PA-1, se examinaron para los patrones de expresión SERPINB3 por microscopía de inmunofluorescencia como se describió anteriormente. Cada tipo de células se sembró en Lab-Tek cámara de diapositivas (Nalge Nunc International, Rochester, NY). Después de 24 h, las células se fijaron con metanol -20 ° C y la tinción de inmunofluorescencia se realizó con un anticuerpo monoclonal anti-SERPINB3 humana (número de catálogo: ab55733; Abcam plc, Cambridge, Reino Unido). Las células fueron incubadas con Alexa Fluor 488 de conejo anti-IgG de cabra anticuerpo secundario (A21222, Invitrogen). Los portaobjetos se cubrieron con DAPI ante las imágenes fueron capturados utilizando un Zeiss LSM710 microscopio confocal (Carl Zeiss) equipado con una cámara AxioCam microscopio digital y software de Zen de 2009.
Humano población de estudio
Los datos clínicos fueron recuperados a partir de una base de datos de los pacientes con EOC entre junio de 2003 y marzo de 2009. se obtuvo la aprobación por la Junta de Revisión Institucional del hospital Bundang Universidad Nacional de Seúl con antelación para el estudio actual. Los criterios de selección fueron los siguientes para los pacientes: se les diagnosticó el EOC; que fueron tratados con cirugía citorreductora seguida de máxima adyuvante taxanos y quimioterapia basada en platino si está indicado; que tenían el estado funcional del Eastern Cooperative Oncology Group de 0-2; y que no tenían la enfermedad subyacente que afecta a la supervivencia. _ENREF_4Optimal Cirugía citorreductora se definió como un tumor residual ≤1 cm, mientras que la cirugía citorreductora subóptima se definió como un tumor residual & gt; 1 cm de diámetro máximo. Todos los pacientes excepto aquellos con enfermedad en estadio temprano de bajo riesgo tales como la FIGO estadio IA o IB con grado 1 o 2 de la enfermedad recibido quimioterapia adyuvante utilizando paclitaxel (175 mg /m
2) /carboplatino (AUC 5.0) o paclitaxel (175 mg /m
2) /cisplatino (75 mg /m
2) durante 1-2 semanas después de la cirugía, la quimioterapia y la se repitió cada 3 semanas durante 6 ciclos. La supervivencia libre de progresión (SLP) se define como el tiempo transcurrido desde la fecha de finalización de la quimioterapia adyuvante primaria a la fecha de agravamiento clínicamente probado. La supervivencia global (OS) se calculó a partir de la fecha de la laparotomía de clasificación a la fecha de la muerte relacionada con el cáncer o el final del estudio. resistencia de platino se define como la respuesta a la quimioterapia basada en platino con un intervalo mínimo libre de tratamiento de menos de 6 meses mientras que la sensibilidad de platino se define como la respuesta a la quimioterapia basada en platino con un intervalo mínimo libre de tratamiento de más de o igual a