Extracto
Los datos recientes apoyan el papel de SHARP1, una hélice-bucle-hélice represor de la transcripción básica, en la regulación del comportamiento de las células malignas en varios cánceres humanos. Sin embargo, la expresión y el papel de SHARP1 durante el desarrollo de cáncer de endometrio (CE) siguen sin estar claros. Aquí mostramos que la regulación positiva de SHARP1 suprime la angiogénesis tumoral por la disminución de la hipoxia-inducible factor 1α (HIF-1α), la viabilidad celular y el crecimiento tumoral inhibido en CE. La tinción inmunohistoquímica demostró que la expresión de SHARP1 se correlacionó negativamente con el estadio del tumor, el grado histológico, la invasión del miometrio, metástasis en los ganglios linfáticos, la permeabilidad de los vasos sanguíneos en el miometrio y la expresión de HIF-1α. Estudios mecanicistas mostraron que SHARP1 interactuó con HIF-1a físicamente, y el nivel de proteína de HIF-1α y el nivel de mRNA de sus genes diana (
VEGFA, ANGPTL4
y
CA9
) se redujeron SHARP1 en condiciones de hipoxia. La regulación positiva de SHARP1 en CE impide la angiogénesis inducida por hipoxia mediante la reducción de la secreción de VEGF. El análisis inmunohistoquímico se verifica una correlación entre la disminución de la expresión SHARP1 y el aumento de la densidad de microvasos en los tejidos de la CE. Además, SHARP1 inhibe la viabilidad celular en las líneas celulares de la CE. La sobreexpresión de SHARP1 in vivo inhibe el crecimiento del tumor y la angiogénesis, y la disminución de la expresión de HIF-1α. En este estudio, hemos establecido SHARP1 como un nuevo supresor de tumores de CE y arrojar luz sobre los mecanismos de cómo SHARP1 inhibe la progresión de la CE. Por lo tanto, SHARP1 puede ser una valiosa biomarcador pronóstico para la progresión CE y se muestra prometedor como un nuevo objetivo potencial para la terapia antiangiogénica en CE humana
Visto:. Liao Y, Lu W, Q Che, Yang T, H Qiu, Zhang H, et al. (2014) SHARP1 Suprime La angiogénesis del cáncer endometrial al disminuir inducible por hipoxia nivel de factor-1α. PLoS ONE 9 (6): e99907. doi: 10.1371 /journal.pone.0099907
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Febrero, 2014; Aceptado: 19-may de 2014; Publicado: 11 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Liao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81272885, 81172476, 81072139, 81072140), el Proyecto de la Fundación de Ciencia y Tecnología Comisión Municipal de Shanghai (núm 13JC1404500) y el Ph.D. Fundación programas del Ministerio de Educación de China (Nº 20120073110090). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de endometrio (CE) es una causa importante de morbilidad relacionada con el cáncer y la mortalidad entre las mujeres. Es el cuarto cáncer más común entre las mujeres en los Estados Unidos, con un estimado de 49.500 nuevos casos y 8.200 muertes en 2013 [1]. Aunque las primeras etapas del CE es a menudo tratada con éxito con la intervención quirúrgica, el tratamiento de avanzada CE puede ser difícil y su pronóstico es malo [2], [3], en particular en el contexto de la enfermedad metastásica o recurrente, con una supervivencia media de sólo el 7 -12 meses [4]. Las opciones terapéuticas actuales, tales como la histerectomía, la terapia hormonal, y combinaciones de radioterapia y la quimioterapia son eficaces para las primeras etapas de la CE; Sin embargo, las terapias diana eficaces para los pacientes con EC metastásica o recurrente no están disponibles [5], debido a la etiología y los mecanismos biológicos de esta enfermedad heterogénea no se entienden completamente. Por lo tanto, más elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión de la CE es urgente.
La angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes, tiene un papel importante en el crecimiento del tumor, progresión y metástasis [6], [7 ]. Inicialmente, la actividad angiogénica está ausente en los primeros neoplasias. Sin embargo, como los tumores crecen más allá de la velocidad de suministro existente, el oxígeno se agota dentro del núcleo. La condición hipóxica resultante (PO
2 & lt; 10 mmHg [~ 1,5% de O
2]) evita la degradación del factor-1α inducible por hipoxia (HIF-1α) a través del supresor tumoral VHL, permitiendo que trans-activación de pro- factores angiogénicos, entre los cuales el más notable es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [8] - [11]. La investigación reciente ha demostrado que la vía de señalización de HIF-1α /VEGF está implicado en la proliferación endotelial celular, la diferenciación, la migración, y la permeabilidad vascular [12]. Por otra parte, la inhibición de la neovascularización por la supresión de la vía de señalización de HIF-1α /VEGF puede retrasar la progresión del tumor y tal vez incluso morir de hambre las células tumorales a la muerte [13] - [15]. Como otros tumores sólidos, el crecimiento y la metástasis de las células de la CE dependen de la angiogénesis [16]. El mecanismo subyacente a la regulación de la angiogénesis se ha descrito ampliamente en otros tipos de cáncer, pero sólo escasamente estudiado en CE [15].
SHARP1 (también conocido como bHLHE41 o DEC2), un miembro de la subfamilia represor transcripcional de la hélice básica -loop-hélice (bHLH) factores de transcripción [17], [18], se expresa en diversos tejidos embrionarias y adultas [19], [20]. Amplia evidencia sugiere que es un regulador clave de la progresión del tumor en el cáncer oral y de mama, donde sus efectos sobre la apoptosis de las células del cáncer, la proliferación y la metástasis han sido ampliamente investigado [21] - [24]. Además, SHARP1 regula negativamente la expresión del VEGF [25], y un estudio reciente muestra que SHARP1 suprime la metástasis del cáncer de mama [23]. Sin embargo, aún se desconoce si y, en caso afirmativo, cómo SHARP1 contribuye al desarrollo y progresión de la CE, especialmente con respecto a la angiogénesis, en el que participa la vía HIF-1α /VEGF.
En el presente estudio , hemos demostrado que la disminución de la expresión de SHARP1 se correlacionó significativamente con un mal resultado clínico en CE. Además, por primera vez, hemos demostrado que SHARP1 tiene un papel de supresión durante la progresión del CE; en particular, inhibe la angiogénesis SHARP1 de manera HIF-1α-dependiente y podría ser un marcador útil para la selección de la terapia antiangiogénica.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio fue aprobado por el Comité ético de Investigación humana de la Paz & amp maternidad Internacional; El Hospital de Niños afiliado a la Universidad Shanghai Jiao Tong. Las muestras de la CE y los tejidos normales del endometrio se recogieron después de recibir el consentimiento informado por escrito de los pacientes. La investigación con animales se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de China. Los procedimientos fueron aprobados por el Departamento de Animales de Laboratorio de Ciencias de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales.
Pacientes y muestras
muestras de tejidos
embebidos en parafina-se obtuvieron de 110 pacientes con cáncer de endometrio y 52 pacientes con endometrio normal que se sometieron a resección quirúrgica para el tratamiento de otra enfermedades como el mioma o adenomiosis en el Peace Maternity & amp Internacional; Hospital de Salud Infantil afiliado a la Universidad Shanghai Jiao Tong de 2009 a 2013. La edad media de los pacientes con EC fue de 56,9 ± 8,8 años (media ± DE; mediana, 57 años, rango, 33-78 años). La edad media de los pacientes con endometrio normal era de 53,9 ± 8,6 años (media ± DE; mediana, 53 años, rango, 34-70 años). No hubo diferencia significativa con respecto a la edad del paciente cuando las muestras CE y de control se compararon (
P
= 0,054). En el grupo de control, todas las muestras fueron pieza de histerectomía, entre los cuales 16 casos fueron de mujeres posmenopáusicas, 17 casos fueron de mujeres perimenopáusicas y los otros eran de mujeres premenopáusicas. Las etapas (I-IV) y grados histológicos (G1-G3) de estos tumores se establecieron de acuerdo con los criterios de la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia del sistema (FIGO) quirúrgica puesta en escena (2009) [26]. Ninguno de los pacientes había sufrido la terapia hormonal, radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía.
La inmunohistoquímica (IHC) y las secciones de tejido evaluaciones
(4 m de espesor) se prepararon a partir de muestras de tejido incluidas en parafina. Las secciones se eliminó la cera con xileno seguido de rehidratación clasificado en el alcohol. La recuperación del antígeno se llevó a cabo en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; pH 9,0) durante 20 minutos por calentamiento en un horno de microondas. A continuación, la actividad de peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación de las secciones con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min, y la tinción no específica fue bloqueada por incubación con suero normal de cabra 10% durante 30 min. Las secciones se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo contra SHARP1 (una relación de dilución de 1:100 a 10 mg /ml; Novus, Littleton, CO), el anticuerpo monoclonal de ratón contra HIF-1α (una relación de dilución de 1:50 a 5 mg /ml ; BD Biosciences, Bedford, MA), anticuerpo monoclonal de conejo contra CD34 (una relación de dilución de 1:100 a 5 mg /ml; Abcam, Cambridge, Reino Unido), y el anticuerpo policlonal de conejo contra Ki67 (una relación de dilución de 1:100 a 5 g /ml; Epitomics, Burlingame, CA) en una cámara humidificada a 4 ° C durante la noche y luego se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado (una relación de dilución de 1:1000 a 1 mg /ml; Beyotime, Nanjing, china) para 30 min, seguido por estreptavidina peroxidasa durante 15 min. Se utilizó solución tamponada con fosfato (PBS) para diluir los anticuerpos. actividad peroxidasa se detectó mediante la aplicación de tetracloruro de 3,3'-diaminobencidina. Cada etapa de incubación se realizó a 37 ° C y fue seguido por tres lavados secuenciales con PBS durante 5 min cada uno. Por último, las secciones se deshidrataron en alcohol y se aclaró en xileno.
La puntuación se realiza por dos patólogos independientes que fueron cegados a los datos clínicos y patológicos. tinción SHARP1 se evaluó considerando tanto el número de células con nuclear positiva y tinción citoplásmica y la intensidad de la tinción en cada núcleo positivo y el citoplasma. El número de células positivas se calificó como sigue: 0 (& lt; 5%); 1 (5-25%); 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 (& gt; 75%). La intensidad se calificó como sigue: 0 (negativo); 1 (débil); 2 (moderado); 3 (fuerte). Una puntuación final se calcula multiplicando las dos puntuaciones más arriba. Decenas de 0-2 se definieron como '' expresión negativa ''; decenas de 3-8 como '' la expresión débilmente positivo '', y las puntuaciones de 9-12 como '' la expresión fuertemente positiva '' [27]. Para la tinción de HIF-1α, solamente se evaluó el porcentaje de núcleos oscuros, homogéneamente manchadas, y tinción citoplásmica fue ignorada. Se consideró positivo cuando & gt; 1% de los núcleos se tiñeron [28]. La densidad microvascular (MVD) fue evaluada por tinción inmunohistoquímica para CD34, lo que pone de relieve la vascularización del tumor /tejido. Los microvasos se contaron en tres campos diferentes por sección como sigue: diapositivas fueron escaneados primero a baja potencia (× 100) para determinar tres '' puntos calientes '' o áreas con el número máximo de microvasos, a continuación, los vasos sanguíneos positivos de colores en el áreas seleccionadas se analizaron a 400 × magnificación [29].
Cell Culture, hipóxicas, Condiciones y reactivos
líneas celulares CE humano (Ishikawa y RL95-2) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). las células endoteliales vasculares umbilicales humanas (HUVEC) se obtuvieron de Key-GEN Biotech (Nanjing, China). células de Ishikawa y RL95-2 se cultivaron en DMEM /F12 (Gibco, Auckland, Nueva Zelanda) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco, Carlsbad, CA). HUVECs se cultivaron en RPMI1640 (Gibco) suplementado con suero bovino fetal 10%. Las células fueron cultivadas en un 5% de CO
2 humidificado incubadora a 37 ° C. Para los experimentos de hipoxia, las células fueron cultivadas en un hipóxica in vitro (& lt; 0,1% O
2) sistema de recipiente (BD Diagnostics, Sparks, MD). El medio condicionado (CM), proteínas y ARN se recogieron inmediatamente cuando se eliminaron las células hipóxicas del recipiente.
transfecciones transitorias y estables para SHARP1-sobreexpresión
La expresión SHARP1 plásmido Pez-M02-SHARP1 y plásmido vacío Preceiver-M02-NEG se adquirieron de GeneCopoeia (Guangzhou, china). La transfección transitoria se realizó en células de Ishikawa confluentes 70% utilizando Lipofectamine 2000 reactivo (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para la expresión estable en células de Ishikawa, el gen SHARP1 humana se clonó en vectores lentivirales con Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP usando la tecnología Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el manual de operación (http: //products.invitrogen. com /IVGN /producto /12538120).
pequeños ARN de interferencia (siRNA)
siRNAs fueron sintetizados por GenePharma Biotech (Shanghai, china). Las secuencias se presentan en la Tabla 1. El siRNA se transfectó en las células utilizando Lipofectamine reactivo de 2000 como se ha descrito anteriormente.
El aislamiento de ARN y Cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)
El ARN total se extrajo a partir de células cultivadas utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). La primera cadena de ADNc fue inverso-transcrito a partir de 1 g de ARN total usando el kit de reactivos de secuencias de comandos Prime RT (Takara, Dalian, China), y el ADNc se analizó mediante qPCR utilizando SYBR Premezcla Ex Taq (Takara). Para los experimentos de qPCR, valores en el
y
eje representan 2
(- ΔΔCt), donde Ct es la diferencia entre el Ct para el gen de interés y la del gen que codifica la β-actina y ΔΔCt es la diferencia entre el Ct del grupo de grupo y control experimental o primero carril [30]. Los conjuntos de cebadores se muestran en la Tabla 2. Los datos fueron obtenidos por triplicado a partir de tres experimentos independientes.
Western Blot
Las células se lisaron en tampón de lisis RIPA (Beyotime, Nanjing, China) con proteasa fluoruro de fenilmetanosulfonilo inhibidor (PMSF; Beyotime). La concentración de proteína se determinó mediante un kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime). Igual cantidad de proteína fueron cargados en cada carril de un gel SDS-PAGE para la separación de proteínas y se transfieren al fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA). Las membranas se bloquearon y después se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo contra SHARP1 (una relación de dilución de 1:500 a 2 mg /ml; Novus), anticuerpo monoclonal de ratón contra HIF-1α (una relación de dilución de 1:200 a 5 mg /ml; Abcam), y anticuerpo policlonal de conejo contra la β-actina (una relación de dilución de 1:5000 a 0,2 mg /ml; Epitomics) individualmente a 4 ° C durante la noche. anticuerpos anti-conejo y anti-ratón secundaria Entonces enlaces con peroxidasa (una relación de dilución de 1:5000 a 0,2 mg /ml; Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Se utilizaron para detectar los anticuerpos primarios consolidados
co-inmunoprecipitación (co-IP) Ensayo
para estudiar la unión endógena SHARP1 /HIF-1α, se incubaron células de Ishikawa en condiciones de hipoxia durante 24 h antes de la cosecha. Luego se lisaron dos platos confluentes de 10 cm de células como se describe anteriormente. Antes de la inmunoprecipitación, los lisados de células totales se incubaron con 1 mg de IgG de ratón y 20 l de una proteína A + G-agarosa suspensión de perlas (Beyotime) a 4 ° C durante 2 h para eliminar la unión no específica. La centrifugación se lleva a cabo entonces y se recogió y se incubó con el ratón HIF-1α anti-humano el sobrenadante (concentración final: 10 mg /ml; Abcam) o IgG control de ratón (concentración final: 10 mg /ml; Beyotime) durante la noche. El día siguiente, 40 l de una proteína A + G-agarosa suspensión de perlas se añadió a las mezclas de reacción y se incubó durante 4 horas a 4 ° C con rotación. co-proteínas inmunoprecipitadas se analizaron por Western Blot como se describió anteriormente
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
kit de VEGF humano
Quantikine se adquirió de I + amp;. D Systems (Minneapolis, MN). Las células se sembraron en placas de 12 pocillos. A las 24 h después de la transfección, el medio se reemplazó por DMEM /F12, y las células se cultivaron en condiciones de hipoxia o normoxia durante otras 24 h. Entonces se recogieron los sobrenadantes y se cuantificó VEGF extracelular en el medio de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
endotelial tubo Cell Formación Ensayo
Una placa de 96 pocillos se recubrió con 100 l de Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA) por pocillo y se mantuvieron a 37 ° C durante 30 minutos. Luego, 2 × 10
4 HUVECs se suspendieron en 1 ml diluidos medio acondicionado (CM; 1:10) y se aplicó a la placa de 96 pocillos pre-recubierto a una densidad de 2000 células /pocillo. CM se recogió a partir del sobrenadante de las células de Ishikawa cultivadas en hipoxia o normoxia durante 24 h. Después de incubación a 37 ° C durante 14 h, la longitud total de los tubos de tipo capilar que se habían formado se contaron y se promediaron en seleccionados al azar tres campos microscópicos. No se observaron cambios morfológicos en el microscopio, y se fotografiaron las células a un aumento de 100x.
Desnudo xenoinjertos de tumores de ratón Ensayo
Diecinueve 6 semanas de edad, los ratones BALB /c desnudos femeninos se obtuvieron de Shanghai Instituto de Ciencias de la vida (Slac animales de laboratorio Co, Ltd, china). Para establecer un modelo de ratón desnudo que lleva CE, Ishikawa células transfectadas con el vector lentiviral que lleva el gen humano SHARP1 (Lenti-SHARP1) o con el vector vacío solo (Lenti-Control) se utilizaron. Todos los ratones fueron divididos aleatoriamente en dos grupos de cinco ratones (los otros nueve ratones fueron utilizados para el ensayo de tapón de Matrigel; véase más adelante). Las células fueron inyectadas por vía subcutánea en el flanco de cada ratón (1 × 10
7 células por inyección). la formación de tumor subcutáneo fue monitorizada en todos los ratones nude cada 7 días a partir de 14 días después de la inyección. Los diámetros de corta y larga de los tumores se midieron utilizando un calibrador y del tumor volúmenes (cm
3) se calcularon utilizando la siguiente fórmula estándar: volumen del tumor (cm
3) = (el diámetro más largo) x (las de diámetro más corto)
2 × 0,5. Los ratones se sacrificaron 6 semanas después de la inyección, después de lo cual los tumores se retiraron cuidadosamente, y sus pesos y volúmenes se midieron antes de continuar con la evaluación histológica.
Mouse Matrigel plug Ensayo
Nueve desnudos BALB /c los ratones fueron divididos aleatoriamente en tres grupos de tres ratones. factor de crecimiento reducido Matrigel (BD Biosciences) (300 l) se mezcló con Ishikawa células transfectadas con el plásmido vacío bajo normoxia o hipoxia o SHARP1 de larga duración plásmido en condiciones de hipoxia, o mezclado con correspondientes CMS (100 l) de las mismas células mencionadas encima. Las células o los CM correspondientes se recogieron en el mismo tiempo después cultivadas en las condiciones indicadas por 24 h. Las mezclas se inyectaron por vía subcutánea en el flanco de cada ratón (lado derecho, mezcla con células; lado izquierdo, mezcla con la correspondiente CM). Los ratones se sacrificaron y se eliminaron tapones de 14 días después de la inoculación y se fotografiaron. tapones de Matrigel se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) para examen histológico y se analizaron por IHC como se describe anteriormente usando anticuerpos contra CD34 de ratón (1:100, Abcam)
Trans-bien Migración Los ensayos
.
para los ensayos de migración trans-así HUVEC, 1 × 10
4 células en suspensión en 200 l de RPMI1640 que fueron sembradas en la cámara superior y media (CM) de diferentes fuentes como se describe en los Materiales y Métodos esta en condicionadas la cámara inferior, donde las células de Ishikawa se cultivaron bajo normoxia o hipoxia durante 24 h antes se recogió CM. Cada muestra se sembró por triplicado. Después de 24 h de incubación, las células en el lado superior de la cámara superior se retiraron con un hisopo de algodón. Las células que migran (en el lado inferior del filtro) se fijaron en paraformaldehído al 4% y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta, y después se contó el número de células que migran. Un total de seis campos fueron contados para cada filtro trans también. Cada campo se contó con un microscopio y fotografiado a 200 × magnificación.
Metil tiazolilo tetrazolio (MTT) Ensayos
Las células transfectadas fueron sembradas en placas de 96 pocillos a 5000 células /pocillo y se cultivaron para 1 a 4 d. Durante la final de 4 horas de cultivo, el metil tiazolil tetrazolio (MTT; 5 mg /ml) de reactivo (Sigma, St. Louis, MO) se añadió al medio de cultivo. Los valores de absorbancia se midieron a 490 nm con un lector de microplacas (modelo 680; Bio-Rad, Hercules, CA). Para la detección de la viabilidad de HUVEC, 2 × 10
4 HUVECs fueron suspendidos con 1 ml diluidos CM (relación de dilución 1:10) y se sembraron en placas de 96 pocillos a 2000 células /pocillo. Después de 24 h de incubación, la viabilidad de HUVEC se detectó mediante el ensayo MTT como se describió anteriormente. En cada experimento y en cada condición, la viabilidad celular se evaluó por triplicado, y los experimentos se repitieron tres veces.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS versión 17.0 (Chicago, IL ). Los valores representan la media ± SD. Los datos se analizaron por de Student no apareado
t-test
o por análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) para comparaciones múltiples. La χ
2 test para las tablas se utilizó para comparar los datos categóricos. Se utilizó la prueba coeficiente de correlación de Spearman para la detección de correlación. Un
P-valor de
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
SHARP1 es downregulated en la CE y se correlaciona con las características clinicopatológicas
Para determinar el efecto de la expresión SHARP1 el desarrollo de la CE y la progresión, elegimos 52 casos de tejido endometrio normal, 97 casos de tejido endometrioide cáncer de endometrio (CEE) y 13 casos de EC seroso papilar o de células claras CE tejido como representantes de tipo I y tipo II CE, respectivamente. CE de tipo I, que ocurre en aproximadamente el 85% de los pacientes, a menudo muestra ER positivo. Los tumores con este tipo tienden a ser bien diferenciados, de bajo grado y buen pronóstico. Por el contrario, el tipo II, que consiste principalmente de carcinoma de células serosas y clara, por lo general surge en el endometrio atrófico mediante un mecanismo no relacionado con la exposición a estrógenos. Este tipo suele ser RE negativo y poco diferenciado, de alto grado y mal pronóstico. Aunque tipo II ECs representan aproximadamente el 15% de los casos, que son responsables de aproximadamente el 50% de todas las recaídas [31]. La tinción inmunohistoquímica reveló que SHARP1 se expresa fuertemente en el citoplasma y en el núcleo de la mayoría de las células en el endometrio normal, pero demostraron una reducción significativa en la expresión CE (
P = 0,00046
, la Tabla 3. La figura 1A-C).
microfotografías representativas de SHARP1 y tinción de HIF-1α en los tejidos del endometrio (aumento original: 400 × para las inserciones, 200 × para todos los demás; barra de escala, 100 micras). Los paneles A-C muestran la tinción inmunohistoquímica para SHARP1 en el endometrio normal (A), cáncer endometrial endometrioide (CEE) (B), y seroso papilar CE (C). Paneles D-F muestran tinción inmunohistoquímica para SHARP1 en grado histológico 2 (G2) CEE (D), G3 CEE (E) y de células claras CE (F). Paneles G-muestro tinción inmunohistoquímica para HIF-1α en el G2 CEE (G), G3 CEE (H), y de células claras CE (I) en las mismas áreas correspondientes de los mismos casos a tinción SHARP1.
las características clínico-patológicas de los 110 pacientes de la CE se resumen en la Tabla 4. en comparación con la CEE, la expresión SHARP1 se redujo significativamente o se pierde en CE seroso papilar o de células claras CE (
P = 0,017
), que da cuenta de los tipos más agresivos de la CE. Por otra parte, la expresión SHARP1 disminuyó notablemente en la fase final del (estadio III o IV) o de alto grado (G3) CE en comparación con estadio temprano (estadio I o II) o de bajo grado (G1, G2) CE (
P = 0,017
y
P = 0,001
, respectivamente). Además, también hemos encontrado una fuerte correlación inversa entre la expresión SHARP1 y la invasión del miometrio (
P
= 0,002), la metástasis de los ganglios linfáticos (
P
= 0,005), y la permeabilidad de los vasos sanguíneos en el miometrio (
P = 0,021
). Nosotros no hicimos, sin embargo, encontró relación significativa entre SHARP1 y otras variables clínico-patológicas, incluyendo la edad y la expresión del receptor de estrógeno, receptor de progesterona, y p53.
Expresión de SHARP1 se correlaciona inversamente con HIF-1α en el caso CE
Para determinar si la expresión reducida SHARP1 se correlaciona con la expresión de HIF-1α en los tejidos tumorales, la tinción inmunohistoquímica de HIF-1α se realizó en 104 de las 110 muestras de tejido de la CE (el resto seis especímenes fueron faltan o están dañados ). Entre ellos, 31 fueron fuertemente positivos para SHARP1 (29,8%), y 77 de 104 especímenes fueron positivos para HIF-1α (74,0%). Sólo 16 casos fueron fuertemente positivas para SHARP1 y positivo para HIF-1α (15,4%). Nuestros datos clínicos proporcionan la primera evidencia de que existe una fuerte correlación inversa entre SHARP1 y la expresión de HIF-1α en la CE (
P = 0,003
, la Tabla 5. La figura 1D-I).
SHARP1 Atenúa la Expresión de la proteína HIF-1α y sus genes abajo en líneas celulares de la CE
sobre la base de los hallazgos clínicos, hemos propuesto una relación potencial entre SHARP1 y HIF-1α. El uso de qPCR y el Western Blot, se encontró que el
nivel SHARP1
fue elevado dos veces en la línea celular CE RL95-2 en comparación con la línea celular Ishikawa, ambos de los cuales se originó a partir de un adenocarcinoma de endometrio (Figura 2A) . Para investigar más a fondo la función SHARP1 y su correlación con HIF-1α, que Upregulated SHARP1 usando plásmidos de expresión en células de Ishikawa SHARP1 y cayó al suelo SHARP1 utilizando siRNA en células RL95-2. La eficacia de transfección se confirmó a las 48 hy 72 h después de la transfección de ARNm y los niveles de proteína, respectivamente (Figura S1)
.
(A) Expresión de SHARP1 en las células de Ishikawa y RL95-2 según lo determinado por qPCR (izquierda ) y el Western Blot (derecha). (B) Análisis de transferencia Western de control y SHARP1 sobreexpresan Ishikawa células cultivadas en los niveles de oxígeno indicado para 24 h. (C) Análisis de transferencia Western de los efectos del agotamiento SHARP1 en RL95-2 células después de 24 horas a los niveles de oxígeno indicados. (D) Análisis de qPCR de
HIF-1α
mRNA en el control y las células de Ishikawa SHARP1 sobreexpresan (izquierda), y en las células RL95-2 que habían sido transfectadas con el control o SHARP1 siRNAs (derecha) se incubaron a la indicada los niveles de oxígeno durante 24 h. (E) Co-inmunoprecipitación (Co-IP) de HIF-1α endógena con SHARP1 endógena a partir de extractos de células de Ishikawa. El asterisco indica una banda de fondo resultante de la reacción cruzada de las inmunoglobulinas (IgG). (F) qPCR (izquierda) y el análisis de Western Blot (derecha) de
SHARP1 Hoteles en Ishikawa células se incubaron a los niveles de oxígeno indicado para 24 h. análisis (G) qPCR de
VEGFA
,
ANGPTL4
, y
Hoteles en CA9 de control y SHARP1 sobreexpresan Ishikawa células se incubaron a los niveles de oxígeno indicados durante 24 h. análisis (H) qPCR de
VEGFA
,
ANGPTL4
, y
CA9 Hoteles en RL95-2 células que habían sido transfectadas con siRNAs control o SHARP1 y se incubaron a que el oxígeno indicada los niveles de 24 h. Para las transfecciones transitorias, se utilizaron plásmido (1,6 mg /ml) y siRNA (40 pmol /ml). Los datos representan la media ± SD de un experimento representativo de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado (*
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P
& lt; 0,001; NS, no significativo). Para todos los análisis qPCR, los niveles de expresión se compararon con ß-actina, y los datos se normalizaron a la expresión se muestra en la primera columna.
sobreexpresión SHARP1 disminuyó significativamente el nivel de proteína HIF-1α en células de Ishikawa en condiciones de hipoxia (Figura 2B). A continuación, examinó si SHARP1 endógena era un inhibidor correspondiente de los niveles de proteína HIF-1α. el agotamiento SHARP1 utilizando siRNA se incrementó el nivel de proteína HIF-1α en las células RL95-2 en condiciones de hipoxia (Figura 2C). Sin embargo, la proteína HIF-1α apenas se detecta en ambas líneas celulares cultivadas en normoxia. Mientras tanto, no se observó ningún cambio significativo en el
HIF-1α
nivel de ARNm en células Ishikawa SHARP1 o células RL95-2 sobreexpresados con el agotamiento de SHARP1 (Figura 2D). También se detectó una asociación física entre HIF-1α y SHARP1 en los niveles endógenos en las células de Ishikawa en condiciones de hipoxia utilizando un ensayo de co-inmunoprecipitación (Figura 2E). Curiosamente,
SHARP1
expresión fue elevado en las células Ishikawa después de que se cultivaron en condiciones de hipoxia durante 24 h (Figura 2F). Por otra parte, HIF-1α desmontables utilizando siRNA disminución de la expresión SHARP1 en condiciones de hipoxia (Figura S2A).
Para probar si SHARP1 afecta funcionalmente la actividad de HIF-1α, qPCR se utiliza para detectar diferencias en los niveles de HIF-1α destino seleccionado transcripciones de genes. Se evaluaron los genes que codifican vascular endotelial factor de crecimiento A (
VEGFA
, una isoforma de VEGF que es crucial para la angiogénesis tumoral y desempeña un papel clave en la proliferación de células endoteliales, la supervivencia, y la permeabilidad [7], [10 ], [12], [16], [32]), angiopoyetina 4 (
ANGPTL4
), y la anhidrasa carbónica 9 (
CA9
). Cabe destacar que estos genes se transcriptionally upregulated en condiciones de hipoxia en las células Ishikawa, mientras que la expresión SHARP1 humedecido estas inducciones (Figura 2G). A la inversa, SHARP1 knockdown estimuló la transcripción de estos genes en las células RL95-2 en condiciones de hipoxia (Figura 2H). La expresión de estos genes era, sin embargo, no se ve afectado de manera significativa por SHARP1 upregulation o downregulation bajo normoxia. Además, la regulación negativa de HIF-1α utilizando siRNA atenuó la expresión del ARNm de
VEGFA
,
ANGPTL4
y
CA9 Hoteles en Ishikawa células en condiciones de hipoxia (Figura S2 B).
SHARP1 inhibe la angiogénesis
HIF-1α es un regulador maestro de la angiogénesis del tumor [33], y SHARP1 inhibida (panel de la figura 2G, izquierda)
VEGFA
la expresión de ARNm en nuestro estudio. Por otra parte, se realizó un ELISA para detectar la secreción de VEGF en el medio acondicionado (CM) de células de Ishikawa. SHARP1 sobreexpresión redujo parcialmente la secreción de VEGF inducida por hipoxia en las células Ishikawa (Figura 3A). Por lo tanto, se consideró que si el choque del SHARP1 sobre la expresión /VEGF HIF-1α afecta a la angiogénesis hipoxia-desencadenó en la CE. Utilizamos varios enfoques para investigar si y cómo SHARP1 podría regular el comportamiento de las células endoteliales. CM se recogió a partir de células de Ishikawa transfectadas con el plásmido vacío o SHARP1 de longitud completa plásmido bajo normoxia o hipoxia durante 24 h. En particular, la capacidad de la viabilidad y la migración de HUVEC se estimularon por CM a partir de células de Ishikawa hipóxicas, mientras que CM a partir de células de Ishikawa hipóxicas que sobreexpresa SHARP1 inhibió estos efectos (Figura 3B y C). Como no hay efectos obvios de SHARP1 sobre la secreción de VEGF, HUVEC viabilidad y la migración se observaron bajo normoxia, se utilizó CM de Ishikawa células transfectadas con SHARP1 vacíos o con plásmidos en condiciones de hipoxia para los siguientes experimentos, y CM de Ishikawa células transfectadas con plásmidos vacíos cultivadas en normoxia como un control negativo. Para determinar si SHARP1 alteró el comportamiento funcional de las células endoteliales, HUVECs se colocaron en una matriz de membrana basal para inducir la formación de tubos de tipo capilar en presencia de los CM se ha mencionado anteriormente. la formación del tubo se cuantificó por un promedio de la longitud total de tubos en tres campos elegidos al azar. Del mismo modo, CM de SHARP1 sobreexpresan las células Ishikawa formación del tubo hipoxia estimulada significativamente inhibido y de ramificación (Figura 3D).