Extracto
localización tisular de la expresión génica es cada vez más importante para la interpretación precisa de grandes conjuntos de datos a escala a partir de expresión y análisis mutacional . Con este fin, hemos (1) desarrollado un procedimiento robusto y escalable para la generación de sondas de ARNm de hibridación, proporcionando & gt; 95% de éxito de primer paso en la generación de sonda a un gen diana humana y (2) adoptó un procedimiento de tinción automatizada para los análisis de los tejidos incluidos en parafina y fijados en formalina microarrays de tejidos. El
In situ
patrones de ARNm y la expresión de proteínas de los genes con los conocidos, así como los patrones de expresión de tejidos desconocidos se analizaron en los tejidos normales y malignos procedimiento para evaluar la especificidad y si
In situ
hibridación se pueden utilizar para la validación de nuevos anticuerpos. Demostramos concordancia entre
In situ Versión taquigráfica de expresión de proteínas y los patrones de los biomarcadores de patología conocidos
KRT17
,
CHGA
,
MKI67
,
PECAM1
y
VIL1
, y proporcionar una validación independiente de nuevos anticuerpos para los biomarcadores
BRD1
,
EZH2
,
JUP
y
SATB2
. El presente estudio proporciona una base para la amplia
In situ
conjunto de genes o análisis del transcriptoma de los tejidos normales y tumorales humanos
Visto:. Kiflemariam S, S Andersson, Asplund A, Pontén M, T Sjöblom (2012) Escalable
hibridación In Situ
en matrices tisulares para la validación de biomarcadores del cáncer Novel y tejidos específicos. PLoS ONE 7 (3): e32927. doi: 10.1371 /journal.pone.0032927
Editor: Rakesh K. Srivastava, de la Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 19 de septiembre de 2011; Aceptado: 5 Febrero 2012; Publicado: 8 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Kiflemariam et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de cáncer de Suecia [11 0186] y la Fundación Beijer de TS, y de la Fundación Wallenberg Knut y Alice [2002,0087] para FP. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
precisa y específica de localización de tejido de la expresión génica es instrumental para la interpretación correcta de los datos del transcriptoma de tejidos complejos tales como los tumores de pacientes. La rápida acumulación de datos de mutación exoma de tumores también produce nuevos objetivos terapéuticos putativos, y es por lo tanto valioso para investigar la expresión del gen de tejido para predecir los efectos y efectos secundarios de nuevas terapias contra el cáncer. validación de la especificidad de los anticuerpos de diagnóstico y terapéuticos es otra aplicación en la que
In situ
expresión génica análisis podrían aportar conocimiento esencial. Para hacer un uso óptimo de tales
In situ
análisis de la expresión génica en la biología del cáncer, uno necesita (1) Los métodos para la generación fácil y eficiente de sondas a cualquier gen diana, y (2) procedimientos automatizados y robustos para la tinción de (FFPE) los tejidos incluidos en parafina y microarrays de tejidos (TMA).
la hibridación in situ fijado en formalina (ISH) Emplear técnicas de etiquetado sondas de ARN para analizar la expresión y localización de las transcripciones de ARNm específicos en los tejidos a una resolución de tipo celular . Tales sondas se generan normalmente por
in vitro
la transcripción a partir del plásmido o de los productos de RT-PCR en presencia de una base conjugado hapteno tal como digoxigenina-UTP. Después de la hibridación, las sondas unidas se detectan por cromogénico inmunohistoquímica anti-hapteno. Mientras que las secciones de tejido congeladas se utilizan con mayor frecuencia en mRNA ISH, archivos tejidos FFPE y microarrays de tejidos También se pueden emplear [1]. Como mRNA ISH es técnicamente difícil y abarca muchas etapas experimentales, varios formatos de automatización se han desarrollado diferentes. El sistema Tecan GenePaint es un sistema robótico abierto que con éxito se ha utilizado para trazar el transcriptoma del ratón en los tejidos congelados [2], [3]. Brevemente, las reacciones de prehibridación, hibridación y detección de señales se llevan a cabo en una cámara de paso de flujo donde un sistema disolvente automatizado añade soluciones diferentes en paralelo. Este sistema, junto con la tecnología de detección permite un rendimiento diario de hasta doscientos diapositivas [4]. esfuerzos de todo el proteoma ya han demostrado la viabilidad de gran escala inmunotinción FFPE [5], [6]. La correlación de la expresión de proteína y ARNm proporcionará una herramienta de validación independiente tanto para inmunohistoquímica (IHC) e ISH, y permitir el descubrimiento de falsos positivos de uno u otro método.
Para obtener una forma flexible para analizar la expresión de tejido de grandes conjuntos de genes en microarrays de tejidos FFPE, creamos un procedimiento basado en la PCR simple y escalable para la generación de sondas de ARNm a cualquier gen diana en la misma biblioteca de cDNA y desarrollado, además, un sistema de tinción automatizado, en el 48 genes pueden ser procesados en 48 tejidos o TMA en una una sola carrera. a continuación, se validó la especificidad y la escalabilidad de este enfoque por ISH paralelo y IHC focalización biomarcadores conocidos en la patología. Por último, demostrar la especificidad de anticuerpos frente a nuevos biomarcadores específicos de tejido o cáncer utilizando
In situ
hibridación.
Resultados
Tecnología de optimización
Diecisiete genes fueron elegidos para representar biomarcadores de patología bien establecidos o nuevos biomarcadores específicos de tejido o de cáncer descubiertos dentro del proyecto Human Protein Atlas [5]. Estos bromodomain incluido que contiene 1 (
BRD1
), cromogranina A (
CHGA
), histona-lisina N-metiltransferasa (
EZH2
), de la familia con la similitud de secuencia 174 miembro B (
FAM174B
), glutamato descarboxilasa 1 (
GAD1
), Janus quinasa 3 (
JAK3
), plakoglobina unión (
JUP
), queratina 17 (
KRT17
), v-yes-1 sarcoma viral de Yamaguchi homólogo de oncogén relacionado (
LYN
), MIX 1 homeobox tipo 1 (
MIXL1
), el antígeno Ki 67 (
MKI67
), 6A fosfodiesterasa (
PDE6A
), plaquetas molécula de adhesión celular endotelial 1 (
PECAM1
), la proteína tirosina fosfatasa de tipo C (
PTPRC
), especial rica en AT secuencia de la proteína de unión 2 (
SATB2
), villin1 (
VIL1
) y la proteína 473 (dedo de zinc
ZNF473
). Se obtuvieron productos de PCR deseados y sondas de ARN para todos los genes (Figura S1).
A continuación se determinó si la longitud de la sonda de ARN afecta a la sensibilidad o especificidad de las señales ISH utilizando dos enfoques diferentes. En el primer enfoque, sondas de ARN para
CHGA
y
KRT17
fueron fragmentados por duplicado utilizando métodos alkaline- y de iones metálicos catalizados por investigar si más corta longitud de la sonda daría una señal más alta debido a una mejor penetración en el tejido. Ambos protocolos se han adaptado para su uso con sondas de ARN marcadas con DIG-UTP. No hay diferencia significativa en la señal podría ser visto entre las sondas fragmentados y no fragmentados en la evaluación de la tinción en normal de colon, riñón, hígado, bazo y amígdalas (datos no mostrados). El segundo enfoque fue investigar si las sondas más largas tendrían un impacto en la señal de ISH. Tres sondas diferentes focalización
PDGFRB
(derivado de plaquetas factor de crecimiento de receptor beta) con longitudes de 500 pb, 1000 pb y 1500 pb se generaron. No hay diferencia significativa en la señal entre las longitudes de la sonda podría ser visto en la evaluación de la tinción en los glomérulos del riñón, sin embargo, el fondo se aumentó para 1000 pb y 1500 pb sondas cuando se comparan sondas sentido y antisentido de ARN (datos no mostrados) [7].
se llevó a cabo la adopción del sistema GenePaint para las matrices de tejido humano
para facilitar un enfoque a gran escala, la optimización de proteinasa K concentración. Tres genes con diferentes niveles de expresión,
PDGFRB, KRT17
y beta actina (
Actb
), fueron elegidos y evaluados en un microarray de tejido con normalidad colon, riñón, hígado, bazo y amígdalas. Las concentraciones ensayadas fueron 2,5, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 mg /ml. Para
Actb
una concentración de 40 mg /ml era suficiente para proporcionar señales claras y distintas, sin afectar la morfología del tejido. Para
KRT17
y
PDGFRB
, una concentración de proteinasa K de 60 mg /ml fue óptima cuando se comparan los diferentes tejidos de la matriz y por lo tanto fue elegida para experimentos adicionales. Para visualizar los genes expresados a niveles bajos, se introdujo ciclos dobles de amplificación de la señal basada en tiramida. Por otra parte, la importancia de las secciones de tejido fresco ha sido comprobada ya débil o ninguna señal fue visto en secciones de tejido de más de 3 semanas (datos no mostrados).
Validación de tinción ISH en matrices tisulares
secciones de tejido consecutivos se tiñeron usando el sentido ISH sonda, sonda antisentido ISH e inmunohistoquímica para comparar la expresión génica en el ARNm y proteínas. Para un subconjunto de los genes analizados (
CHGA
,
KRT17
,
LYN
,
MKI67
,
PDE6A
,
PECAM1
,
PTPRC
y
VIL1
), los patrones de expresión de proteínas a base de inmunohistoquímica son bien conocidos y establecidos. Estos objetivos se utilizaron para comparar la expresión de la proteína y las transcripciones correspondientes para la validación del procedimiento de ISH escalable. La proteína de filamentos intermedios KRT17 fue, como se esperaba, altamente expresado en una amplia selección de las células epiteliales diferenciadas, como se demuestra por tinción de la amígdala (Figura 1, A-C y la figura S3) y de los bronquios (Figura S3). CHGA, un marcador de diferenciación neuroendocrina, mostró una fuerte tinción en las células neuroendocrinas del intestino (Figura 1, D-F), en los islotes pancreáticos y órganos endocrinos, tales como la paratiroides (Figura S3). El marcador de proliferación bien caracterizado Ki-67 se expresa en G1, S, G2 y M fases del ciclo celular y usa a menudo para evaluar la proliferación de células dentro de los tumores. La proliferación de células en la base de las criptas colónicas normales (Figura 1, G-I), en vulva anal y en las amígdalas (Figura S3) se muestran. La señal de ISH para Ki-67 se localiza en regiones específicas en el núcleo de acuerdo con los datos del ratón [8]. PECAM1 se expresó en las células endoteliales en la mayoría de los órganos, ejemplificada por la placenta ricamente vascularizado (Figura 1, J-L), el endometrio (la menopausia pre) y de los ganglios linfáticos (Figura S3). VIL1 es una proteína expresada en el borde en cepillo del epitelio y como tal altamente expresado en los túbulos renales y células glandulares del tracto gastrointestinal, tales como el de colon (Figura 1, M-O), apéndice y el duodeno (Figura S3). Por otra parte, para
CHGA
,
PECAM1
y
VIL1
, se utilizaron dos pares de sondas de ARN independientes (Tabla S1) para la validación cruzada de la especificidad de la sonda. El tejido y el patrón de distribución celular de expresión tanto para el mRNA y la proteína fueron similares para estos cinco genes, confirmando la sensibilidad y especificidad de automatizado de hibridación in situ en FFPE TMA. Para PDE6A, IHC mostró tinción en alvéolos, músculo esquelético, bronquios y células en los glomérulos renales. ARNm y proteínas de correlación sólo se observó en dos casos de músculo esquelético. anticuerpos establecidos para LYN y PTPRC mostraron membranosa distinta y tinción citoplásmica en los tejidos linfoides y las células glandulares del tracto gastrointestinal, y selectivo tinción citoplásmica en el tejido linfoide, respectivamente. No se observó correlación entre la proteína y la expresión de mRNA (Figura S5). Para
PTPRC
, la falta de tinción ISH fue validación cruzada con dos pares de sondas de ARN independientes (Tabla S1).
señales ISH son vistos como tinción con azul /morado con núcleos contrastados en verde de metilo, mientras que IHC señales están en marrón con contratinción de hematoxilina.
A-C
: la queratina 17 (
KRT17
) en las amígdalas,
D-F
: cromogranina A (
CHGA
) en el colon,
G-I
: Ki-67 (
MKI67
) en el colon,
J-L
: plaquetas adhesión de células endoteliales molécula 1 (
PECAM1
) en la placenta ,
H-O
: Villin-1 (
VIL1
) en el colon. Arrays de tejido se hibridaron con sondas de control de sentido (A, D, G, J, M), sondas antisentido (B, E, H, K, N), o immunostained con anticuerpos (C, F, I, L, O) focalización las transcripciones o productos de proteína respectiva. Todas las imágenes se obtuvieron a partir de diapositivas escaneadas con un 40 × objetivo.
La validación de nuevos biomarcadores de anticuerpos por ISH en arrays de tejido
La expresión de anticuerpos derivados en el proyecto Human Protein Atlas sugerido o bien una expresión específica de tejido o utilidad clínica en el diagnóstico del cáncer o la terapia para los nuevos biomarcadores putativos
BRD1
,
EZH2
,
FAM174B
,
GAD1
,
JAK3
,
JUP
,
MIXL1
,
SATB2
y
ZNF473
. Por lo tanto, el análisis de su
In situ
la expresión de ARNm y proteínas en los tejidos normales podría proporcionar validación de la especificidad del anticuerpo. BRD1 es conocido por inmunohistoquímica que se expresa en Purkinje y células neuronales en el SNC, las células en los conductos seminiferus en testículo, células glandulares de la próstata, glándula adrenal y el apéndice, y macrófagos en el pulmón, lo cual fue confirmado por ISH (Figura 2, A-C y la figura S4). EZH2 es un biomarcador potencial de cáncer como la sobreexpresión de la proteína nuclear se observa en una variedad de cánceres agresivos, incluyendo cáncer de mama, cáncer de próstata y glioblastoma multiforme [9]. La expresión génica se encuentra tanto en la transcripción (tinción citoplásmica) y proteínas (tinción nuclear) en las células glandulares en el apéndice (Figura 2, D-F), el duodeno y el tubo de Falopio (Figura S4), las células en los conductos seminiferus en los testículos y los miocitos en el corazón músculos. JUP fue sugerido por IHC para ser un biomarcador específico de tejido expresado en células anexiales y epidérmicas de la piel, que fue confirmado por ISH (Figura 2, G-I) y en las células epiteliales escamosas de la amígdala (Figura S4). SATB2 es un nuevo biomarcador para el cáncer colorrectal [10], donde el perfil de expresión génica ha demostrado asociación de regulación a la baja de la transcripción con metástasis y mal pronóstico [11]. Los anticuerpos para SATB2 mostraron tinción nuclear en las células glandulares del tracto gastrointestinal inferior, incluyendo las células de las criptas colónicas (Figura 2, A). Concomitante array ISH confirmó la expresión del transcrito SATB2 en el citoplasma restringido al epitelio del apéndice, colon (Figura 2, J-K) y el recto (Figura S4), pero no en otros órganos. Para la validación de estos cuatro biomarcadores novedosos, se utilizaron dos pares de sondas de ARN independientes para cada gen (Tabla S1). GAD1 mostró ISH similar y tinción IHC en las células de Purkinje y células en la capa molecular del cerebelo, pero no se observó correlación en otros tejidos. La especificidad de los nuevos anticuerpos a
FAM174B
,
JAK3
,
MIXL1
y
ZNF473
no pudo ser verificada mediante ISH (Figura S5). Para
JAK3
, la falta de tinción ISH fue validación cruzada con dos pares de sondas de ARN independientes pero por
FAM174B
,
MIXL1
y
ZNF473
, solamente un par de sondas se podría diseñar debido a cualquiera de las regiones codificantes de proteínas demasiado corto o demasiado alta homología con otros genes (Tabla S1).
señales ISH son vistos como la tinción con azul /morado con núcleos contrastados en verde de metilo, mientras que IHC las señales están en marrón con contratinción de hematoxilina.
A-C
: bromodomain que contiene 1 (
BRD1
) en la glándula suprarrenal,
D-F
: histona-lisina N-metiltransferasa (
EZH2
) en el apéndice (tinción nuclear y citoplasmática de la proteína y ARNm, respectivamente),
G-I
: Junction plakoglobina (
JUP
) en la piel,
J-L
: especial rica en AT secuencia de la proteína de unión 2 (
SATB2
) en dos puntos (tinción nuclear y citoplasmática de la proteína y ARNm, respectivamente). Arrays de tejido se hibridaron con sondas de control de sentido (A, D, G, J), sondas antisentido (B, E, H, K), o immunostained con anticuerpos (C, F, I, L) dirigidos a las transcripciones respectivas o los productos proteicos . Todas las imágenes se obtuvieron a partir de diapositivas escaneadas con un 40 × objetivo.
Análisis paralelos de proteína SATB2 y la expresión del transcrito de FFPE matrices de cáncer colorrectal
Las proteínas y la expresión de mRNA se evaluó en SATB2 cánceres colorrectales utilizando una matriz que abarca más de 60 tumores primarios por duplicado. La anotación se realizó sobre la base de una escala de tres grados. Un par no contenía tejido tumoral, y de las 59 muestras restantes, 44 mostró una total concordancia entre IHC y expresión ISH en las células glandulares (Figura 3). Doce mostraron semi concordancia como se observó tinción pero con diferentes intensidades, mientras que 3 muestras no mostraron ninguna correlación. Se observó Acuerdo entre la proteína y el patrón de expresión de ARNm en un total de 56 muestras (índice kappa de Cohen, kappa = 0,68).
señales ISH son vistos como la tinción con azul /morado con núcleos contrastados en verde de metilo, mientras que las señales de IHC son en color marrón con contratinción de hematoxilina. arrays de tejido se hibridaron con la sonda de control de sentido (A, D, G, J), sonda antisentido (B, E, H, K) o inmunotinción con el anticuerpo (C, F, I, L). Todas las imágenes se obtuvieron a partir de diapositivas escaneadas con un 40 × objetivo.
Discusión
Escala ISH se acerca al conjunto de genes o en todo el análisis exoma requiere tuberías para la síntesis de la sonda, la hibridación, análisis y anotación. Mientras que mucho trabajo preliminar se ha realizado en el marco de los grandes estudios del transcriptoma del ratón en los tejidos congelados, es necesario realizar modificaciones para ISH exitosa y reproducible en materiales FFPE. Para la síntesis de la sonda facile, concluimos que la informática cuidadosas combinados con el uso de una biblioteca de ADNc humano agrupado (MegaMan) conlleva una alta tasa de éxito de primer paso en la generación de la plantilla de la sonda. Esta biblioteca de ADNc abarca mRNA a partir de 32 tejidos humanos y 34 líneas celulares de cáncer humano se asegura una buena representación de las transcripciones con diversos niveles de expresión y variantes de empalme. En proyectos paralelos, este enfoque ha utilizado con éxito para generar un total de 700 sondas con una tasa de éxito de primer paso de & gt; 95% (datos no mostrados) factores .Essential para la tinción éxito que difieren de los procedimientos publicados previamente empleando a los tejidos congelados fueron se observó que el uso de tejido recién seccionada, ya débil o ninguna tinción de secciones de tejido FFPE mayores, posiblemente debido a la oxidación de RNA en la superficie expuesta o las condiciones de fijación poco satisfactorias que afecta a la calidad del ARN, una mayor concentración de proteinasa K, y dos ciclos de biotina tiramida amplificación de la señal basada. Aunque este último puede ocasionar un ligero aumento los niveles de base, es en nuestra experiencia de una manera conveniente de aumentar la intensidad de la señal.
La especificidad y sensibilidad de ISH Se evaluó exhaustivamente mediante tinción de secciones consecutivas de la misma TMA abarca ~ 40 tipos de tejido normal en el cuerpo humano. Los ISH y patrones de tinción IHC de
KRT17
,
CHGA
,
MKI67
,
PECAM1
y
VIL1
eran idénticos en todos los tejidos tipos, una selección de muestras representativas se muestran en la Figura 1 y la Figura S3, proporcionando así una fuerte validación del enfoque de ISH. Este alto grado de concordancia es de acuerdo con observaciones anteriores de proyectos transcriptoma del ratón. Sin embargo, una mejora muy necesaria para permitir la extracción de datos eficiente de ISH y IHC es una ontología estandarizada para la anotación de los tejidos humanos, en analogía con la anatomía ontología EMAP ratón [3].
sensibilidad y especificidad del anticuerpo es una de las principales preocupación en inmunohistoquímica, especialmente en proyectos a gran escala, donde numerosos anticuerpos se están produciendo hacia los objetivos con los patrones de expresión desconocidos. validación especificidad de los anticuerpos a grado de diagnóstico puede llevarse a cabo mediante la obtención de patrón de tinción muy similares con un anticuerpo para un epítopo diferente del mismo antígeno [6], la pérdida de señal en ratones knock-out o de otro organismo modelo, o patrón de tinción muy similares con
In situ
hibridación. Estamos aquí demostrar la viabilidad de este último enfoque a escala organismo en el ser humano, ya que abarca prácticamente todos los tejidos normales se pueden analizar en un solo experimento TMA. Hemos sido capaces de verificar la especificidad de los nuevos anticuerpos a
BRD1
,
EZH2
,
JUP
y
SATB2
, con dos pares de sondas de ARN independientes, confirmando que ISH puede proporcionar validación especificidad independiente. Una selección de muestras representativas se ve en la Figura 2 y la Figura S4. En experimentos paralelos, no hemos podido confirmar la especificidad de los nuevos anticuerpos a
FAM174B
,
JAK3
,
MIXL1
y
ZNF473 gratis (Figura S5) . El semi-correlación entre el mRNA y la expresión de la proteína de
GAD1
y
PDE6A
puede ser debido a la especificidad de anticuerpos o las diferencias en los procesos de transcripción y traducción. La falta de correlación entre el mRNA y la expresión de la proteína de
LYN
y
PTPRC
puede ser debido a razones biológicas y técnicas. Los anticuerpos para
LYN
y
¿Cuáles son PTPRC dirige a todas las isoformas conocidas de las proteínas y los pares de sondas de ARN se encuentra en las regiones que están presentes en todas las transcripciones conocidas. También para PTPRC, se utilizaron dos pares de sondas de ARN independiente, lo que demuestra la falta de tinción ISH entre inter TMA replica. Por tanto, creemos que la falta de correlación entre el mRNA y expresión de la proteína es más probable debido a razones biológicas, tales como post-transcripcional, traduccional y post-translacional modificaciones que afectan a los niveles de mRNA y proteína. Además, descomposición de ARNm y proteínas de vida media podrían tener un impacto en ARNm y proteína de correlación. Otras fuentes de discrepancia entre IHC e ISH podría ser la falta de sensibilidad o especificidad, ya sea en uno de los enfoques; esto permite la interpretación de los patrones de tinción concordantes como apoyo de la especificidad del anticuerpo y los patrones discordantes como la falta de especificidad. En un esfuerzo a gran escala, los anticuerpos con los patrones de tinción ISH concordantes deben ser priorizados para análisis adicionales en comparación con los anticuerpos con tinción ISH discordantes o inexistente.
SATB2
, un factor de transcripción asociados a matriz nuclear y un miembro de la familia de especiales rica en AT de unión a proteínas, recientemente se ha demostrado que se expresa en las células normales del tracto gastrointestinal inferior y en las células cancerosas de origen colorrectal. Debido al patrón de expresión nuclear altamente específica en células normales y malignas del tracto gastrointestinal, la expresión de proteínas SATB2 se sugirió como un biomarcador de diagnóstico útil clínicamente para el cáncer colorrectal, el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado en el mundo [10]. Se realizó la prueba de Kappa de Cohen para determinar el acuerdo entre IHC y tinción ISH, lo que demuestra una buena fiabilidad entre evaluadores. La tecnología escalable que aquí se presenta también permite realizar análisis de expresión de genes en arrays de tejidos humanos. Tenemos la visión de que la tirosina kinome, phosphatome tirosina, otros genes en cáncer de las vías, junto con una multitud de nuevos genes de cáncer candidato derivados de la secuenciación del genoma del exoma y constituyen los principales objetivos de gran escala
In situ
caracterización basada en la hibridación. Proponemos que la cartografía completa y sistemática de la expresión
In situ Hoteles en tejidos humanos normales y malignas a una resolución de tipo celular proporcionará conocimientos valiosos, especialmente en el desarrollo de fármacos contra el cáncer ya que los resultados pueden ayudar a predecir los efectos, la guía de reposicionamiento disponibles los medicamentos dirigidos, y ayudar a predecir la respuesta a los fármacos que inhiben varias dianas moleculares diferentes. También proporciona la base técnica para el mapeo de transcripción de expresión de los genes que codifican proteínas humanas, y potencialmente también otras especies de ARN, en los enfoques sistemáticos de todo el genoma.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el uso de arrays de tejido HPA en este estudio está cubierto por el permiso ético HPA (EPN Uppsala 2002/577, 2005/338) y permiso de ética de los investigadores (EPN Uppsala 2007/116). Las identidades de las muestras de tejido vestida no se conocen los investigadores, ni serán liberación en el dominio público.
generación de sondas
El procedimiento de generación de la sonda se describe en la Figura S2. Hemos desarrollado un software propio que selecciona regiones de transcripción adecuadas para el diseño de sondas de hibridación de los genes de interés mediante la minimización de homología con las transcripciones de otros genes en el transcriptoma RefSeq humana, asegurando que las secuencias de la sonda están presentes en RefSeq transcripciones del gen de interés , e incluyendo regiones para abarcar las fronteras exón. Dos conjuntos independientes de cebadores de PCR para la amplificación de productos 500-600 nt se generaron para cada gen utilizando Primer3 [12]. Una secuencia de promotor T7 (5'-GCGTAATACGACTCACTATAGGG-3 ') fue incorporado en el extremo 5' de la hacia adelante o cebador inverso, respectivamente, para generar la plantilla de ribosonda sentido o antisentido. Todos los pares de cebadores utilizados en la generación de la sonda se resumen en la Tabla S1.
biblioteca transcriptoma humano MegaMan de Stratagene, una colección de ADNc creado usando ARNm a partir de 32 tejidos humanos y las 34 líneas celulares de cáncer humano, se utilizó para PCR (www. genomics.agilent.com). Cada reacción contenía 2 l 10 x tampón de PCR (166 mM (NH
4)
2SO
4, 670 mM Tris pH 8,8, 100 mM 2-mercaptoetanol, MgCl 67 mM
2), 2 l dNTPs (10 mM, GE Healthcare, Uppsala, Suecia), 1,2 l de DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.), 0,4 l cebador directo (50 mM, Sigma-Aldrich), 0,4 l cebador inverso (50 M, Sigma-Aldrich), 0,2 l de Taq polimerasa (5 U /l, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), biblioteca MegaMan humana transcriptoma 1 l (160 ng /l, (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.)) y MilliQ de agua hasta un volumen de 20 l. Las condiciones de touchdown PCR incluyeron temperaturas de recocido que van desde 64 ° C a 57 ° C; 96 ° C durante 2 min; 3 ciclos de 96 ° C durante 10 s, 64ºC durante 10 s y 70 ° C durante 30 s; 3 ciclos de 96 ° C durante 10 s, 61ºC durante 10 s y 70 ° C durante 30 s; 3 ciclos de 96 ° C durante 10 s, 58ºC durante 10 s y 70 ° C durante 30 s; 41 ciclos de 96 ° C durante 10 s, 57 ° C durante 10 s y 70 ° C durante 30 s, y una extensión final de 5 min a 70 ° C. Los productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 1,25% para la confirmación de tamaño del producto. ribosondas sentido y antisentido marcadas con digoxigenina fueron generados por
in vitro
transcripción de los productos de PCR con ARN DIG mezcla de marcaje (Roche, Rotkreuz, Suiza) en un volumen total de reacción de 5 l. Una g de cada uno sonda de ARN se realizó en un gel de TBE-urea 6% (Invitrogen) para la confirmación de tamaño. Las acciones se hicieron diluyendo sondas de ARN con agua MilliQ a 200 ng /l y se almacena en -80 ° C. Sonda de soluciones de trabajo de 20 ng /l se hicieron a partir de soluciones madre y se almacenan en -20 ° C.
sondas de ARN se fragmentaron usando dos enfoques diferentes. Para la fragmentación alcalina catalizada, dando fragmentos que van desde 50 hasta 150 pb, sondas de ARN se digirieron con tampón de carbonato de sodio 0,2 M (pH 10,2) a 60 ° C. El tiempo de incubación se calcula t = L
0-L
f /
k
L
0L
f, donde t es el tiempo de incubación en minutos, L
0 y L
f son las longitudes inicial y final de la sonda en kb, y
k
es la constante de velocidad para la hidrólisis (aproximadamente 0,11 kb
-1min
-1). Las reacciones se detuvieron mediante la adición de acetato de sodio (pH 4,7) y las muestras se precipitaron con etanol [13]. Una g de cada uno sonda de ARN se realizó en un gel de TBE-urea 6% para la confirmación tamaño. Para la fragmentación de iones catalizada por metal, dando fragmentos de entre 60 a 200 pares de bases, sondas de ARN se incubaron con cloruro de zinc 100 mM en 100 mM Tris-HCl (pH 7) a 70 ° C durante 15 min. Las reacciones se detuvieron con 0,5 M EDTA (pH 8) [14]. Una g de cada uno sonda de ARN se realizó en un gel de TBE-urea 6% para la confirmación tamaño.
Preparación de tejidos
Los arrays de tejidos utilizados fueron los arrays estándar utilizados para inmunohistoquímica en el Protein humano Atlas proyecto (www.proteinatlas.org). Estas matrices abarcan por triplicado 1 mm núcleos de 48 diferentes tipos de tejido humano no maligno [15] y duplicar núcleos de 1 mm de cáncer colorrectal primario [10]. microarrays de tejidos con tejidos tumorales y normales FFPE se seccionaron a 6 micras y se montaron en portaobjetos de microscopio Superfrost Plus.
La hibridación in situ
Muestras de tejido se eliminó la cera en xileno, seguido de hidratación en un etanol clasificado serie (100%, 95% y 80%, 3 min en cada uno). La hibridación se automatizó usando Tecan GenePaint (Tecan Ag, Männedorf, Suiza) esencialmente como se describe [2], [4], [16]. Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. En pocas palabras, la actividad de peroxidasa endógena fue bloqueada en 0,7% H
2O
2 en metanol, seguido de la desproteinización en 0,2 M HCl y la digestión por 60 mg /ml de proteinasa K (Roche). Las secciones de tejido se pre-hibridaron en tampón de hibridación (Ambion, Foster City, CA, EE.UU.) sin sonda para 30 min y después se incubó con 200 ng /ml ribosonda marcada con digoxigenina durante 4 horas a 64 ° C. Después de la hibridación, las secciones de tejido se lavaron en 5 × citrato de solución salina de sodio (SSC), 50% de formamida y 0,1 x SSC. Para detectar sonda unida, se añadió un anticuerpo anti-digoxigenina (150 U /ml, Roche) conjugado con peroxidasa de rábano picante. Después de cinco lavados en tampón de bloqueo, una etapa de amplificación tiramida biotina se realizó para aumentar la sensibilidad de detección en situ (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.). La biotina depositado se detectó mediante alcalina neutravidina conjugada con fosfatasa (2 mg /ml, ThermoScientific, Waltham, MA, EE.UU.), que escinde el tetrazolio cromogénico sustrato nitroazul (NBT) 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP ) para producir un precipitado azul /púrpura en el sitio de hibridación. Después de 30 min el tiempo de desarrollo, la reacción cromogénica se interrumpió mediante la incubación de las secciones de tejido en un tampón que contiene EDTA, seguido de fijación en 4% PFA. Los núcleos se contratiñeron con 2% verde de metilo y los portaobjetos se deshidrataron en alcoholes graduados y se monta en un medio a base de resina.
Inmunohistoquímica
Brevemente, los portaobjetos se desparafinaron en xileno, hidrataron en alcoholes graduados y se bloquearon para la peroxidasa endógena en peróxido de hidrógeno 0,3% diluida en 95% de etanol. Para la recuperación de antígeno, una cámara de destape (Biocare médica, Walnut Creek, CA; EE.UU.) se utilizó. Los portaobjetos se sumerge y se hirvió en tampón de citrato, pH 6 (Lab Vision, Värmdö, Suecia) durante 4 min a 125 ° C y después se dejó enfriar a 90 ° C. Automated IHC se realizó esencialmente como se describe [17], utilizando un instrumento Autostainer 480 (Lab Vision). Las secciones de tejido se incubaron con anticuerpos primarios (Tabla S2) y un sistema de visualización polímero de dextrano (polímero UltraVision LP HRP, Lab Vision) durante 30 min cada uno a temperatura ambiente y las diapositivas se desarrollaron durante 10 min usando diaminobencidina (Lab Vision) como cromógeno. Todas las incubaciones fueron seguidos por un enjuague en tampón de lavado (Lab Vision). Las diapositivas se counterstained en hematoxilina de Mayer (Histolab, Göteborg, Suecia) y la cubierta se coló usando Pertex (Histolab) como medio de montaje.