Extracto
El carcinoma nasofaríngeo (NPC) está asociado etiológicamente con la infección por el virus de Epstein-Barr (VEB). Sin embargo, la función exacta de EBV en la patogénesis de la APN sigue siendo difícil de alcanzar. La activación del transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) es común en cánceres humanos incluyendo NPC y juega un papel importante en la patogénesis y la progresión de los cánceres humanos. La interleucina-6 (IL-6), una citoquina inflamatoria importante, es un potente activador de la STAT3. En este estudio, mostramos que las células infectadas con EBV inmortalizada epitelial nasofaríngea (NPE) a menudo adquieren una mayor respuesta a la activación de STAT3 inducida por IL-6 para promover su crecimiento y las propiedades invasivas. Curiosamente, esta mayor respuesta /STAT3 IL-6 fue mediada por la sobreexpresión de receptor de IL-6 (IL-6R). Por otra parte, la sobreexpresión de IL-6R mejorado la activación de STAT3 inducida por IL-6 en células NPE inmortalizadas infectadas
in vitro
, y promovió el crecimiento y la tumorigenicidad de línea de células NPC VEB positivo (C666-1)
in vivo
. Además, se demuestra por primera vez que la IL-6R se sobreexpresa en muestras clínicas de NPC. IL-6 expresión también podría ser fuertemente detectó en las células del estroma de NPC y un mayor nivel circulante de IL-6 se encontró en el suero de pacientes NPC etapas de avance-en comparación con los sujetos control. Por lo tanto, la sobreexpresión de IL-6R, junto con la señalización de IL-6 /STAT3 mejorada puede facilitar la transformación maligna de las células premalignas NPE infectadas con EBV en las células cancerosas, y mejorar las propiedades malignas de células NPC
Visto:. Zhang G , Tsang CM, Deng W, Yip YL, Lui VW-Y, Wong SCC, et al. (2013) Mejora de la IL-6 /IL-6R de Señalización Para promover el crecimiento y propiedades malignas en células premalignas o cancerosas epiteliales de la nasofaringe infectadas por EBV. PLoS ONE 8 (5): e62284. doi: 10.1371 /journal.pone.0062284
Editor: Qian Tao, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 12 Diciembre, 2012; Aceptado: March 19, 2013; Publicado: May 1, 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto está financiada por subvenciones de GRF concedidos por el Consejo de Investigación de Hong Kong Grant (Grant número: 776608M; 779810M 780911M; a SWT) y la CGR, patrocinado área de excelencia temático (Grant número: AOE /M-06/08 al MLL). VWL es apoyado por el Fondo L. Patricia Knebel de la Fundación Pittsburgh, EE.UU., el Programa de Desarrollo de la Carrera 512 del Programa Especializado de Excelencia en Investigación (SPORE) en cáncer de cabeza y cuello (5P50CA097190-05), el cáncer de cabeza y cuello SPORE del Desarrollo Premio de Investigación (5P50CA097007). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma nasofaríngeo (NPC) es un tipo distinto de cabeza de cáncer de cuello con alta prevalencia en el sudeste de Asia [1]. Esta malignidad se caracteriza por la infección por el virus de Epstein-Barr (EBV), así como su estroma altamente inflamatoria y la naturaleza metastásica [2]. EBV está presente en prácticamente todos los casos de indiferenciada NPC en regiones endémicas y mucho tiempo se ha postulado que es un factor etiológico fundamental para NPC patogénesis. Sin embargo, hasta la fecha, la función exacta de EBV en la patogénesis de la APN no está claro [3] - [5]. El papel de las citocinas inflamatorias en la patogénesis del cáncer está bien establecido, pero sus efectos sobre premalignas infectadas con EBV y epitelios nasofaríngeos cancerosas no están bien definidos.
evidencia acumulada sugiere que múltiples factores están implicados en la patogénesis de NPC además de o en conjuntamente con la infección por VEB [4], [6]. la activación de STAT3 es común en cánceres humanos incluyendo tanto hematológicas y tumores sólidos [7]. La activación constitutiva de STAT3, indicado por el aumento de expresión de fosfo-STAT3 (p-STAT3), se ha informado en & gt; 70% de las muestras de la APN [8] - [10]. En condiciones fisiológicas normales, la activación de STAT3 es generalmente transitoria y está estrechamente regulada. En células tumorales, la activación constitutiva de STAT3 puede ser causada por anormal y sostenida de señalización autocrina y /o paracrina incluyendo la interleucina-6 (IL-6) de señalización [11] - [13]. IL-6 activa STAT3 por unirse específicamente a su receptor afín en la membrana celular, es decir, IL-6R. Tras la IL-6 de unión, el receptor de IL-6 activa las quinasas asociadas al receptor (JAK1, JAK2 y Tyk2), que posteriormente induce la fosforilación y dimerización de STAT3 (activación de STAT3). STAT3 activada se transloca luego al núcleo para inducir la transcripción de genes diana [14], [15]. la activación de STAT3 Constitutiva promueve el crecimiento tumoral y la supervivencia, así como la invasión, la transición epitelial-mesenquimal y la angiogénesis [16] - [18]. Un estudio reciente ha propuesto que la activación de STAT3 mediada por IL-6 puede mediar la inducción de iNOS en la APN, lo que resulta en la formación de lesiones de ADN mutagénicos que podría contribuir a su patogénesis [19].
A pesar de la importancia biológica emergente de STAT3 la activación en la APN, el mecanismo exacto de su activación permanece mal definida, especialmente en el contexto de la infección por EBV [20]. El promotor L1-TR de un EBV-codificado oncogén, LMP1, contiene STAT3-elemento de respuesta [21]. la activación de STAT3 podría inducir la transcripción de LMP1 en células NPC infectadas por EBV. Por otra parte, la expresión LMP1 regula al alza de IL-6 [22], [23], que activa STAT3 señalización para establecer un bucle de retroalimentación positiva de STAT3 activatioin /LMP1 /IL-6 /STAT3 para amplificar la señalización de STAT3 en células NPC infectadas con EBV [22 ].
IL-6 impulsada por la activación de STAT3 es de particular importancia en la patogénesis de la APN.
In vivo
, el estroma inflamatoria puede representar una potente fuente de IL-6 para conducir la activación de STAT3 en células infectadas con EBV epitelial nasofaríngea (NPE) para promover la tumorigénesis y progresión de la enfermedad. Aunque la IL-6 es una citocina de mediación de señalización STAT3 tecla, el papel de la IL-6 de señalización /STAT3 en células NPE pre-malignas infectadas por EBV no se ha informado anteriormente. Hemos establecido previamente la infección por VEB estable en células NPE inmortalizadas [24], [25]. Estas líneas de células NPE infectadas por EBV se utilizaron en este estudio para examinar la intrincada relación entre la activación de STAT3 y la infección por EBV. Curiosamente, se observó por primera vez que la infección por EBV estable en células NPE inmortalizadas a menudo resultaba en la potenciación de sus respuestas a la activación de STAT3 inducida por IL-6. Además, la activación de STAT3 en estas células NPE infectadas con EBV potenció su independencia de anclaje y propiedades invasivas
in vitro
. Los mecanismos que subyacen a la señalización de la activación de STAT3 inducida por IL-6 reforzada en células infectadas con EBV nasofaríngeos fueron examinados en este estudio y su relevancia clínica en la APN se exploraron.
Materiales y Métodos
declaraciones de Ética
los estudios en seres humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Hong Kong /hospital de Hong Kong Autoridad West Cluster, y todos los sujetos dieron su consentimiento por escrito antes de la participación en el estudio informaron. Las investigaciones con animales fueron aprobados por el Comité para el uso de animales vivos en la Enseñanza & amp; Investigación de la Universidad de Hong Kong. Se utilizó el esfuerzo posible para evitar el sufrimiento y reducir al mínimo el número de ratones que se requieren para cada experimento.
Células y cultivo celular
El establecimiento y caracterización de la línea celular inmortalizada NPE NP460hTert se ha descrito anteriormente [26 ]. Establecimiento de otras líneas celulares incluyendo NPE-NP550 cyclinD1-hTERT, NP550-CDK4-hTERT, NP361-cyclinD1-hTERT se informa por separado. la infección por VEB estable se logró en estas células inmortalizadas NPE y sus condiciones de cultivo se ha informado anteriormente [24], [25]. la infección por VEB y el cultivo celular de las células NPE se realizaron como se informó anteriormente [24]. líneas celulares NPC humanos CNE2, C666-1, HONE1 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) que contenía FBS al 10% en 5% de CO
2 a 37 ° C.
plásmidos
el plásmido para expresar un mutante constitutivamente activa STAT3 (pBabe-STAT3-C), la IL-6 promotor constructo informador de luciferasa (pGL3-IL-6-Luc), y el plásmido informador de luciferasa m67 utilizado para la detección de la activación de STAT3 (luc-m67) fueron amablemente proporcionados por el Dr. JF Bromberg, Departamento de Medicina, Centro de cáncer Memorial Sloan-Kettering, EE.UU. [27]. La PUC-IL-6R utilizado para la expresión de IL-6R fue proporcionado amablemente por el Dr. R. Stefan (Instituto de Bioquímica, Christian Albrecht-Universidad, Alemania) [28]. El vector de expresión retroviral (pBabe-IL-6R) utilizado para sobreexpresar IL-6R se generó insertando el fragmento de IL-6R de la pUC-IL-6R en el vector pBabe en el sitio SalI. El plásmido de expresión LMP1 (pcDNA 2117) que se utilizó en un estudio anterior [29] fue un generoso regalo del Dr. D. P. Huang, de la Universidad China de Hong Kong.
Análisis Western Blot
Western blot análisis se llevaron a cabo como se describe anteriormente [26]. Los extractos nucleares se prepararon a partir cultivar células utilizando el NE-PER nucleares y citoplasmáticas de extracción Reactivos (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos utilizados para detectar IL-6R, ciclina D1 y β-actina se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra STAT3, p-STAT3 (Tyr705) y Bcl-2 fueron adquiridos de Señalización Celular (Danvers, MA, EE.UU.). Los anticuerpos contra c-myc, anti-Flag se compraron a Sigma. El anticuerpo contra el LMP-1 fue adquirido de Dako (Glostrup, Dinamarca). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron anticuerpos contra la peroxidasa de rábano picante ligada comprados de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). La detección del antígeno en el Western Blot fue debida a los reactivos de quimioluminiscencia ECL Plus (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante.
electroforética cambio de ensayo-movilidad (EMSA)
EMSA se realizó de acuerdo con las instrucciones del Fabricante del uso de un kit comercialmente disponible para la activación STAT3 (Thermo Scientific). Brevemente, los extractos de células enteras (proteína 4 g) preparados a partir de IL-6-tratadas y las células no tratadas se incubaron con suero de alta afinidad marcado con biotina elemento inducible (HSIE) oligonucleótido dúplex (GATCCATTTCCCGTAAATC). Después de la electroforesis en gel, la STAT3 obligado: oligonucleótido a electrotransferencia a 350 mA a Biodyne B membrances (nylon) y se fija usando un agente de reticulación UV. Las membranas con el oligonucleótido unido transferidas fueron bloqueadas, marcadas con estreptavidina-HPR conjugado en 1:1000 concentración, y se exponen a los reactivos de quimioluminiscencia ECL Plus (GE Healthcare), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Supershifting de la STAT3: se detectaron complejos de oligonucleótidos después de 30 minutos de preincubación con el anticuerpo anti-STAT3 (Santa Cruz)
Transwell invasión ensayo
El ensayo de invasión de cámara de Boyden se realizó utilizando la cámara Transwell de la. Milipore Company (diámetro de 6,4 mm con tamaño de poro 8,0 m) de acuerdo con un método publicado anteriormente [30]. La migración celular se determinó promediando el número de células migradas en diez campos microscópicos elegidos aleatoriamente en × 400 aumentos. Los datos presentados son la media ± SD de pocillos por triplicado.
Transient plásmido de transfección y luciferasa reportero ensayo
Lipofectamine
™ 2000 (Invitrogen) se utilizó para la transfección transitoria de ADN plasmídico de acuerdo con el fabricante de instrucción. Para la medición de la actividad de transactivación de STAT3 en células HONE1 y HONE1-EBV, 0,8 g de indicador de luciferasa m67 (luc-m67) plásmido por muestra se utilizó. La detección de la activación de STAT3 se realizó con co-transfección de RcCMV STAT3-C o vector de control con el plásmido indicador de luciferasa. Para la medición de IL-6 gen promotor de la actividad en las células HONE1, 0,8 g de pGL3-IL-6-Luc por muestra se utilizó. La relación de la luciérnaga constructo indicador de luciferasa de Renilla y utilizada fue de 200: 1. Treinta y seis horas después de la transfección, se lisaron las células, y las actividades de luciferasa se midieron usando el kit Dual-Luciferase Reporter (Promega, Madison, WI, EE.UU.). La actividad luciferasa se normalizó en relación con el valor de la señal de luciferasa de Renilla.
-PCR cuantitativa en tiempo real
Se aisló ARN de las muestras utilizando Trizol (Invitrogen). El ARN se transcribe inversamente en ADNc utilizando transcriptasa inversa SuperScriptII (Invitrogen) de acuerdo con los protocolos publicados previamente [26]. Las sondas y cebadores fueron diseñados utilizando el sistema de biblioteca universal Probe (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La mezcla de reacción consistió en 0,4 l de cebador directo (10 mM), 0,4 l de cebador hacia atrás (10 mM), 10 l LightCycler mezcla maestra, 4 l autoclave agua Milli-Q, sonda de 0,2 l y 5 de ADNc l. PCR en tiempo real se realizó en mi sistema IQTM2 PCR en tiempo real de detección (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Gene cebadores y sondas específicos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla 1. Los niveles relativos de transcritos de ARNm de los genes examinados se normalizaron a los niveles de transcripción de control interno de GAPDH.
Anchorage crecimiento independiente
ensayo de colonias de agar suave para determinar el crecimiento de anclaje independiente de las células infectadas con EBV y no infectados. El agar inferior (0,6%) se preparó mediante la mezcla de 6% de Bacto-agar y medio a una relación de 01:09. a continuación, se sembraron dos ml de agar superior (0,3%) mezclado con 1 × 10
5 células en la parte superior del agar inferior. Los tamaños de las colonias se puntuaron después de 3 semanas de incubación. Sólo las colonias de & gt; se contaron 0,2 mm de diámetro. Los datos presentados son la media ± DE de pocillos por triplicado.
ensayo de tumorigenicidad en ratones desnudos
células
C666-1 (1 × 10
6 células) que expresan ectópica IL-6R se recogieron y se suspendido en 50 l de PBS, y luego se mezcla con un volumen igual de Matrigel
™ membrana basal para la matriz (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). se inyectó El volumen total de 100 l de suspensión celular en el flanco de 6-8 semanas de edad ratones desnudos macho. Una vez que se estableció el crecimiento del tumor, los tamaños tumorales se midieron cada dos días. El volumen del tumor (media ± DE) se calculó como longitud x anchura
2/2 [31].
MTT ensayo
En pocas palabras, 1 × 10
3 células por pocillo eran se sembraron en placa de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. Posteriormente, los medios de cultivo se reemplazó con medio RPMI que contiene 1% de FBS con o sin recombinante humano IL-6 y se incubaron aún más para los puntos de tiempo indicados. A partir de entonces, a 20 l de reactivo de marcado MTT (5 mg /ml en PBS; Sigma) se añadió a cada pocillo y se incubaron durante 4 horas a 37 ° C seguido de la adición de 200 l de DMSO para disolver los cristales de formazán. La absorbancia se midió a 570 nm utilizando un lector de multiplaca (Merck Eurolab, Dietikon, Suiza). Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de tres pozos por grupo de tratamiento.
La inmunohistoquímica
microarrays de tejidos (TMA) que contiene muestras de tejido de la APN control y se obtuvieron del banco de tejidos APN establecido por el Centro de El carcinoma nasofaríngeo Investigación (RGC financiado área de excelencia del tema). Secciones para inmunohistoquímica se dewaxed en xileno y rehidratada clasificado en el alcohol. actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación de diapositivas con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min. Para la recuperación de antígenos, todos los portaobjetos se incubaron con 10 mmol /L de tampón de citrato (pH 6,0) durante 93 ° C durante 10 min y después se enfrió hasta la temperatura ambiente. Después de eso, las secciones se enjuagaron con PBS y se trataron con suero de bloqueo normal (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EE.UU.) durante 30 min. Anti-IL-6 humana de anticuerpos y los anticuerpos IL-6R anti-humano (Santa Cruz) diluido en PBS (1:100) se aplicaron a las secciones y se incubaron a 4 ° C durante la noche. Después de enjuagar, todas las secciones se incubaron adicionalmente durante 1 h con el anticuerpo y peroxidasa de rábano estreptavidina conjugada secundario conjugado con biotina seguido de un cromógeno, diaminobencidina (Dako). Contratinción se realizó mediante hematoxilina antes de la deshidratación y de montaje. Los controles negativos se realizaron mediante la adición de bloqueo de péptido para sustituir la unión de los anticuerpos primarios a los antígenos.
ELISA para IL-6
Las concentraciones circulantes de IL-6 en los sueros de los controles y NPC pacientes y los sobrenadantes de líneas celulares se cuantificaron usando un ensayo ELISA para la IL-6 (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. muestras duplicadas y se estimaron los valores promediados se utilizaron en el análisis.
El análisis estadístico
Los datos de cada experimento se expresaron como media ± desviación típica (SD). Se utilizó
t
de Student para evaluar las diferencias entre los grupos experimentales. Un
p
valor & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo a lo largo de este estudio
Resultados
EBV-infección de células NPE inmortalizadas mejoradas sus respuestas a la activación de STAT3 inducida por la IL. -6
Hemos informado anteriormente el establecimiento de la infección por VEB estable en una línea de telomerasa inmortalizado NPE celular (NP460hTert) [24]. Cuando se examina para las respuestas a IL-6, se observó que la NP460 infectadas con EBV (NP460hTert-EBV) células muestra consistentemente un nivel mucho más alto de p-STAT3 (Tyr 705) en comparación con las células NP460hTert no infectados tras la exposición de IL-6 (Figura 1A ). También hemos sido capaces de mostrar una inducción sostenida de p-STAT3 en puntos de tiempo prolongados después de IL-6 tratamiento (Figura 1B). El p-STAT3 se pudo detectar hasta 12 horas en las células infectadas con EBV (Figura 1B). En las células no infectadas de control, el nivel de p-STAT3 ya regresó a nivel basal a 0,5 horas (Figura 1A y B). Esta observación apoya además que la activación de STAT3 inducida por IL-6 es mucho más potenciada en células infectadas con EBV en comparación con los no infectados. Hemos sido capaces de confirmar el aumento de la activación de STAT3 al tratamiento con IL-6 en las células NP460hTert-EBV por translocación nuclear de p-STAT3 (Figura 1C), lo que indica la hiperactivación de STAT3 por la IL-6 en células NPE infectadas con EBV, pero no el EBV-negativo de contrapartida. Este aumento de la activación de STAT3 por tratamiento con IL-6 en las células NP460hTert-EBV fue confirmado por la EMSA (Figura 1D). La especificidad de la EMSA para la activación de STAT3 se confirmó por supershifting el complejo STAT3 /DNA después de la unión a anticuerpo específico de STAT3 (Figura 1E). El aumento de la activación de STAT3 inducida por IL-6 también se observó en otra línea celular inmortalizada NPE, NP550-cyclinD1-hTERT (recientemente inmortalizada por la acción combinada de hTERT y ciclina D1, manuscrito en preparación) (Figura 1F). Una activación STAT3 mejorada también se observó en una línea de células NPC infectadas con EBV, CNE2, a pesar de que en menor medida (Figura 1G), en comparación con la de líneas celulares inmortalizadas NPE. El mayor nivel de p-STAT3 en células de cáncer después del tratamiento de IL-6 podría explicar una respuesta más débil a la activación de STAT3 mejorada después de la infección por VEB. Esta respuesta más débil en CNE2 infectados por el VEB se demostró mediante experimentos repetidos. En conjunto, en la presencia de la infección por EBV (EBV-infectadas tanto NPE y infectadas con EBV células NPC), IL-6 induce la hiperactivación de STAT3.
células infectadas con EBV y NP460hTert no infectados fueron tratados con IL-6 en 50 ng /ml de (a) 10, 20 o 30 minutos, y (B) 0,5, 1, 2, 4, 8 o 12 horas. Lisados de células enteras se prepararon y la expresión de p-STAT3 (Tyr 705) se analizó por transferencia de western. STAT3 total fue detectado como el control para la carga de proteínas. (C) Se prepararon extractos nucleares a partir de células infectadas con EBV y NP460hTert no infectada con o sin tratamiento con IL-6 (50 ng /ml durante 30 minutos) y se sometieron a análisis de transferencia Western para la expresión de P-STAT3. Histona 1 se detectó como el control para la carga de extracto nuclear. (D) Total proteína lisados de células se prepararon después del tratamiento con IL-6 durante el tiempo indicado y luego se sometieron a análisis EMSA usando la sonda HSIE marcado con biotina (que contiene elementos de unión de ADN STAT). Para que la competencia "frío", los extractos se incubaron previamente con la sonda no marcada HSIE en exceso molar de 200 veces durante 20 minutos antes del análisis. (E) El ensayo supershift se realizó incubando el extracto con anticuerpo anti-STAT3 durante 30 minutos antes del análisis EMSA. Se observó que el complejo supershifted específica STAT3 que confirmó la especificidad de la EMSA para la activación STAT3 mejorada en NP460hTert infectadas con EBV para IL-6 de la estimulación. (F) NP550-cyclinD1-hTERT y infectada con EBV NP550hTert-cyclinD1 fueron tratados o no tratados con IL-6 a una concentración final 50 ng /ml durante 30 minutos. La expresión de p-STAT3 (Tyr 705) se analizó por transferencia Western. expresión STAT3 se sondeó como control de carga de las proteínas. (G) y las células CNE2 CNE2 infectadas por EBV fueron tratados o no tratados con IL-6 a una concentración final 50 ng /ml durante 30 minutos. La expresión de p-STAT3 (Tyr 705) se analizó por transferencia Western. expresión STAT3 se sondeó como control de carga de las proteínas a partir de diferentes poblaciones de células.
IL-6R sobreexpresión está implicado en la potenciación de la activación de STAT3 mediada por IL-6 en las células NPE inmortalizadas infectadas con EBV
a continuación, se examinó el mecanismo subyacente para una respuesta mejorada de tales células NPE infectadas con EBV a IL-6. Como IL-6 transmite señalización a través de la interacción directa con la superficie de las células IL-6R, se analizó la expresión de IL-6R en las células NPE infectadas con EBV y las contrapartes no infectadas. Inesperadamente, la sobreexpresión de la proteína IL-6R, así como aumento de los niveles de transcripciones de ARNm de IL-6R se detectaron por transferencia de Western y PCR en tiempo real, respectivamente, en células NP460hTert-EBV (Figura 2A & amp; 2B). Curiosamente, el nivel de proteína de IL-6R no era directamente proporcional a su nivel de transcripción. Sin embargo, el nivel de proteínas de un gen particular puede no ser completamente dependiente de nivel transcripcional. El nivel de expresión de una proteína particular también puede estar regulada por la degradación después de la traducción. Además, la sobreexpresión de IL-6R mediante transferencia génica retroviral en células NP460hTert también confirió la capacidad de respuesta mejorada a la activación de STAT3 inducida por IL-6 (Figura 2C). Además, la activación de STAT3 mejorada por IL-6 en las células NP460-VEB podría ser neutralizada por el tratamiento con anticuerpos anti-IL-6R (Figura 2D). Todos estos resultados indican que la sobreexpresión de IL-6R en células NP460hTert-EBV juegan un papel clave en la mediación de la capacidad de respuesta mejorada a la activación de STAT3 a tratamiento con IL-6.
(A) La expresión de IL-6R en EBV células NP460hTert infectadas y no infectadas se analizaron por Western blot. Inmunotransferencia para la β-actina se proporcionó como control de carga de proteínas. (B) ARN total fue extraído y los niveles de expresión de IL-6R mRNA en NP460hTert y células NP460hTert-EBV fueron analizados por cuantitativa en tiempo real RT-PCR. Los niveles de ARNm de IL-6R se normalizaron a GAPDH ARNm celular. Los datos fueron recolectados a partir de experimentos independientes por triplicado. *
p Hotel & lt;
0,05
. las células (C) NP460hTert fueron infectadas con vectores de expresión retroviral, pBabe-IL-6R o pBabe vectores vacíos. De manera estable células transducidas fueron tratados con IL-6 a 50 ng /ml durante 30 minutos. Los lisados celulares se prepararon y se examinaron para la expresión de IL-6R y p-STAT3 (Tyr 705) por Western blot. Immunoblottings de STAT3 y β-actina se muestran como controles para la carga de proteínas. (D) células NP460hTert y NP460hTert-EBV fueron pre-tratados con anticuerpo anti-IL-6R a 5 mg /ml durante 30 minutos antes del tratamiento de IL-6. La expresión de p-STAT3 se analizó por transferencia Western. La inmunotransferencia de los niveles totales de proteína STAT3 se muestra como controles para la carga de proteínas. (E) Después de la infección por VEB, las células infectadas con EBV NP460hTert y sus padres células no infectadas se subcultivaron de forma continua. Células lisados se prepararon a partir de las células que habían sido a pases para 56, 99 y 133 veces (designados como temprana, media y tardía de paso). La expresión de IL-6R se analizó por transferencia Western. Inmunotransferencia para la β-actina se incluyó como control de la carga de proteínas. (F) Los niveles de expresión de IL-6R en las células se detectaron mediante transferencia de Western en varios pares de líneas de células no infectadas y infectadas con EBV, incluyendo pares infectadas con EBV y no infectados de NP460hTert, NP550-CDK4-hTERT, NP361-cyclinD1- hTERT, NP550-cyclinD1-hTERT. β-actina se muestran expresiones como control de carga de proteínas.
Luego trató de examinar si la sobreexpresión de IL-6R fue una consecuencia directa de la infección por EBV o el resultado de la selección progresiva de las células infectadas con EBV NP460hTert sobreexpresan IL-6R en pasajes prolongados. Se compararon los niveles de expresión de IL-6R en diferentes pasajes de las células infectadas con EBV y NP460hTert no infectada. Se observó un incremento muy moderado en la expresión de IL-6R a principios del paso de las células infectadas con EBV NP460hTert, y había un aumento gradual en la expresión de IL-6R en las células EBV-NP460hTert sobre la cultura prolongada (Figura 2E). Tenga en cuenta que un cambio de los niveles de IL-6R tal no se observó en las células no infectadas NP460hTert más de cultivos prolongados (Figura 2E). Esto indica fuertemente que la sobreexpresión de IL-6R tiene ventaja selectiva de crecimiento para las células infectadas con EBV NP460hTert y fue seleccionado activamente en cultivo. La sobreexpresión de IL-6R también se detectó en otras tres líneas de células NPE inmortalizadas de manera estable infectadas con EBV recientemente establecidos en nuestro laboratorio por las acciones combinadas de la telomerasa con CDK4 o ciclina D1 (NP550-CDK4-hTERT-EBV; NP361-cyclinD1-hTERT-EBV ; NP550-cyclinD1-hTERT-EBV) [25], pero no en sus homólogos no infectados (NP550-CDK4-hTERT; NP361-cyclinD1-hTERT; NP550-cyclinD1-hTERT) (Figura 2F). características detalladas de estas líneas celulares inmortalizadas NPE recién se publicarán por separado. Estas observaciones sugirieron que la sobreexpresión de IL-6R tiene ventaja de crecimiento selectivo en células NPE infectadas por EBV y se selecciona activamente sobre pasajes prolongados.
activación constitutiva de STAT3 potencia el crecimiento y las propiedades malignas de las células infectadas con EBV
Hemos tratado de explorar algunos de importancia biológica de esta selección activa de la expresión de IL-6R en las células NPE infectadas por EBV. Una hipótesis es que la infección por VEB puede inducir estrés a las células NPE inmortalizadas [5] y la activación de STAT3 puede superar la detención del crecimiento inducida por el estrés en las células NPE después de la infección EBV y promover su supervivencia. La activación de STAT3 es conocida por activar una serie de eventos objetivo abajo para potenciar el crecimiento y las propiedades malignas de las células del cáncer [16]. tanto, nuestro estudio si la activación de STAT3 puede potenciar el crecimiento y las propiedades malignas de células NPE infectadas por EBV. Una forma mutante dominante activo de STAT3 (STAT3C) se transfectó en células infectadas con EBV y NP460hTert no infectada con el fin de lograr la activación constitutiva de STAT3 (Figura 3A). Hemos sido capaces de observar un aumento moderado de la expresión de c-myc y Bcl-2, bajo la activación constitutiva de STAT3 en células infectadas con EBV en comparación con las células control no infectadas (Figura 3A). tratamiento con IL-6 también sufrió una expresión más larga y más fuerte de la ciclina D1 en las células infectadas con EBV (Figura 3B). Densitometría se utilizó para el análisis de los niveles de ciclina D1 en 0.5, 1, 2, 4 horas (s) en las células infectadas con EBV y células no infectadas después de tratamiento con IL-6. El nivel de ciclina D1 se reguló en las células infectadas con EBV tratadas con IL-6 por 2 pliegues en 4 puntos de tiempo de la hora (Figura 3B). En contraste, los niveles de ciclina D1 en IL-6-trataron células no infectadas solamente upregulated marginalmente en 0,5 horas y dejaron de aumentar en otros puntos de tiempo (Figura 3B). Estos datos sugieren que la IL-6 podría elevar diferencialmente la expresión de la ciclina D1 en las células infectadas con EBV, pero no en las células no infectadas. Curiosamente, la activación constitutiva de STAT3 por la expresión STAT3C también mejoró las propiedades invasivas de NP460hTert-EBV en comparación con las células control no infectadas NP460hTert como se ensayó mediante un ensayo de invasión de Matrigel (Figura 3C). Por otra parte, el tratamiento con IL-6 también se ha mejorado las propiedades invasivas de las células NP460hTert-EBV (Figura 3D). La activación constitutiva de STAT3 por la expresión en células STAT3C NP460hTert-EBV también indujo robusto crecimiento independiente del anclaje en agar blando, lo que sugiere un papel de la activación de STAT3 para promover la transformación tumorigénico de las células NPE inmortalizadas infectadas con EBV (Figura 3E). Los números, así como los tamaños de las colonias de anclaje independiente en células NP460hTert-EBV que expresan STAT3C se incrementaron en comparación con las células control infectadas con el vector pBabe vacío (Figura 3E). Todas estas observaciones mostraron que la activación de STAT3 mejora las propiedades de crecimiento en las células NPE inmortalizadas infectadas con EBV, lo que puede explicar la selección de IL-6R fenotipo sobreexpresión en células NPE infectadas con EBV haciéndolos más sensibles a la activación de STAT3 inducida por IL-6.
(a) c-Myc y Bcl-2 fueron inducidos por la expresión de STAT3-C en NP460hTert y células NP460hTert-EBV. La bandera de etiquetado STAT3-C fue transducida y seleccionado en células NP460hTert y NP460hTert-EBV. análisis de transferencia de Western reveló la expresión de bandera que indica la expresión exitosa de STAT3C. se indujo la expresión de c-myc y Bcl-2 en las células NP460hTert y NP460hTert-EBV después de la expresión STAT3-C. (B) La expresión potenciada de la ciclina D1 en las células NP460hTert-EBV tratadas con IL-6 se observó en comparación con las células control NP460hTert. Las células fueron tratadas o sin tratar con la IL-6 a una concentración final 50 ng /ml durante el tiempo indicado. En el panel de la izquierda, la expresión de la ciclina D1 se analizó mediante Western blot para la expresión de proteínas. En el panel derecho, densitometría se utilizó para cuantificar la expresión de ciclina D1 con referencia a la actina. Se observó la expresión prolongada de la ciclina D1 en las células infectadas con EBV tratadas con IL-6, pero no en las células NP460hTert tratados con IL-6. (C) STAT3-C-expresando células NP460hTert y NP460hTert-EBV mostraron invasividad mejoradas en comparación con las células de control de vectores. La capacidad invasiva se midió contando el número de células que atravesaban la membrana de Matrigel recubierto en 24 horas. Los datos presentados son la media ± DE de pocillos por triplicado a partir de experimentos por triplicado. *,
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p Hotel & lt; 0,05. (D) el tratamiento con IL-6 invasión celular mejorada de células EBV-NP460hTert
in vitro
. células NP460hTert-EBV fueron cargadas en la cámara de invasión superior con o sin tratamiento de IL-6 (50 ng /ml). Después de 24 horas, las células que penetran en la cámara inferior se tiñeron y se contaron. Los datos presentados son la media ± DE de pocillos por triplicado a partir de experimentos por triplicado. *
p Hotel & lt; 0,05. (E) pBabe control- vector y las células STAT3-C-expresión (1 × 10
5) se sembraron en agar blando. Tres semanas más tarde, se tomaron fotografías de las colonias. se contaron las colonias con un diámetro (≥0.2 mm). El número de colonias que se muestran son las medias ± SD de resultados por triplicado. *
p Hotel & lt; 0,05
IL-6 upregulates LMP1 expresión en células NPE y NPC infectadas con EBV
Hemos informado anteriormente de que la activación de STAT3 podía aumentar la LMP1