Extracto
Antecedentes
El objetivo de esta investigación fue evaluar la actividad anticancerígena de noscapina (NOS) y gemcitabina combinación (Gem) (NGC) contra el cáncer de pulmón de células no pequeñas ( CPNM) y para dilucidar el mecanismo de acción subyacente.
Métodos
isobolográfico método se utilizó para calcular los valores de índice de combinación de los datos de citotoxicidad. In vitro actividad antiangiogénica y apoptosis de los números, se evaluó la gema y NGC. Para los estudios in vivo, los ratones nu /nu atímicos hembras eran xenoinjerto con tumores H460 y la eficacia de los números, Gema, o NGC fue determinada. expresiones de proteína por tinción inmunohistoquímica se evaluaron en los tejidos tumorales recogidas
Resultados
Los valores de CI (& lt; 0,59). sugerían un comportamiento sinérgico entre los números y la gema. tratamiento NGC mostró la formación del tubo inhibió significativamente y el aumento de porcentaje de células apoptóticas. NGC, el tratamiento de la gema y los números reduce el volumen del tumor por 82,9 ± 4,5 por ciento, 39,4 ± 5,8 por ciento y 34,2 ± 5,7 por ciento, respectivamente. Específicamente, el tratamiento NGC disminuyó proteínas de supervivencia celular de expresión; VEGF, las manchas y los microvasos densidad CD31 y una mayor fragmentación del ADN y la caspasa 3 escindida en comparación con los niveles de un solo agente grupos tratados y de control.
Conclusión
Nos potenció la actividad anticancerígena de la gema en un aditivo para sinérgica manera contra el cáncer de pulmón a través de vías antiangiogénicos y apoptóticos. Estos hallazgos sugieren que el beneficio potencial para el uso de NGC quimioterapia para el tratamiento del cáncer de pulmón
Visto:. Chougule MB, Patel A, Sachdeva P, T Jackson, Singh M (2011) Enhanced Actividad anticáncer de gemcitabina en combinación con noscapina a través de antiangiogénico y de ruta apoptótica en contra de células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (11): e27394. doi: 10.1371 /journal.pone.0027394
Editor: Rakesh K. Srivastava, de la Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Agosto, 2011; Aceptado: 16 de octubre de 2011; Publicado: 15 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Chougule et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El apoyo financiero fue proporcionada por un centros de investigación en instituciones de las minorías (RCMI) premios (G12RR03020-11) y un Instituto Nacional de Ciencias médicas generales /(NIGMS /SAM) premio de la minoría Biomedical Research Support (5S06GM008111-36) de los Institutos nacionales de Salud (NIH ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la causa principal de muertes relacionadas con el cáncer. La mayoría de los pacientes diagnosticados de cáncer de pulmón se presentan con enfermedad localmente avanzado o metastásico [1], [2]. Más de 85 por ciento de los pacientes con cáncer de pulmón tienen cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). La mayoría de los pacientes recién diagnosticados con CPNM presentan con enfermedad más allá del alcance de la curación quirúrgica y dependen de la quimioterapia sistémica para mejorar su resultado [3], [4]. regímenes de combinación basados en platino son opción de tratamiento de primera línea en el tratamiento del NSCLC, pero su utilidad clínica ha sido limitado debido a las toxicidades sustanciales [4], [5]. A pesar de los recientes avances en la quimioterapia, las tasas de respuesta en NSCLC permanecer & lt; 50 por ciento y un tercio de los pacientes con enfermedad en estadio IV tienen una tasa de supervivencia a 2 años de & lt; 20 por ciento [3]. El establecimiento de un régimen óptimo para los tratamientos combinados con utiliza actualmente y las drogas de nuevo desarrollo es un paso importante para lograr una mayor respuesta y una supervivencia más larga [6]. Para abordar este problema, la atención se ha centrado en la búsqueda de nuevos agentes contra el cáncer que entregarán supervivencia equivalente o mejorado a la conseguida con los regímenes de platino, pero con menos toxicidad. La gemcitabina (Gem) es un agente antimetabolito nucleósido de pirimidina que es activo contra variedad de tumores malignos humanos, incluyendo NSCLC con un perfil de toxicidad favorable [6], [7]. Varios investigadores han estudiado la combinación de la gema y cisplatino, topotecan, inhibidores de la proteasa, y ginsenoside Rg3 para el tratamiento de cáncer de pulmón [8], [9], [10], [11], [12] y reportaron mejorada efectos contra el cáncer [ ,,,0],8], [9], [10], [11], [12], [13].
La actividad contra el cáncer de agentes de microtúbulos interfieren, taxanos y alcaloides de la vinca ha sido bien estudiado [14]. Sin embargo, la utilidad clínica de los taxanos se ha limitado debido a la resistencia a las drogas, la necesidad de por vía intravenosa (i.v.) de infusión durante un largo período de tiempo y asociados toxicidades [15], [16]. Esto ha llevado a la búsqueda de agente de microtúbulos de la orientación que se puede administrar por vía oral, mostrar perfiles de toxicidad favorables y tienen mejores índices terapéuticos. Nos atenúa la dinámica de los microtúbulos sólo lo suficiente para activar los puestos de control mitótico para detener el ciclo celular [17], [18] y demostrado actividad anti-proliferativa contra la amplia variedad de células cancerosas incluyendo muchas variantes resistentes a los fármacos, mientras que evadir las células normales [18], [19 ], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]. Además, los números también mostró poca o ninguna toxicidad para los órganos normales y no inhibió la respuesta inmune humoral primaria en ratones [19], [20]. Nuestros estudios previos demostraron que la administración oral de los números mostró actividad anticancerígena significativa de una manera dependiente de la dosis contra H460 xenoinjertos de tumor de pulmón [24]. Landen et al. demostró que no había mejora significativa en la actividad anticancerígena de los números cuando se combina con paclitaxel [19] posiblemente debido a la competencia por el mismo objetivo. El uso de los números en combinación con vincristina presenta efectos antitumorales sinérgicos en células de leucemia in vitro [27]. Sin embargo, el potencial anticáncer de los números en combinación con varios agentes contra el cáncer en el tratamiento de cáncer de pulmón no ha sido explorado de manera sistemática. Tanto los números y Gem tienen diferente mecanismo de acción y los números y Gem combinación (NGC) puede conducir a una potencial actividad antitumoral sinérgico contra el cáncer de pulmón.
Sobre la base de la actividad individual de estos agentes y sus mecanismos de acción diferentes, nos la hipótesis de que NGC puede producir aditivos a los efectos citotóxicos sinérgicos en células de cáncer de pulmón humano
in vitro
y
in vivo
posiblemente por la degradación de las proteínas de especificidad, la mejora de la actividad antiangiogénica y apoptosis. En esta investigación, se evaluó la actividad contra el cáncer de la terapia NGC contra células de NSCLC in vitro e in vivo en modelo de tumor H460 xenoinjerto de pulmón murino que no se ha informado antes. Los objetivos de este estudio fueron: (a) examinar la actividad anticancerígena de combinación de entre los números y Gem contra las células de NSCLC, y (b) evaluar el efecto antitumoral de NGC en ratones portadores de tumores de xenoinjertos de pulmón H460 y dilucidar el mecanismo subyacente de la acción.
Materiales y Métodos
Materiales
noscapina y la gemcitabina se adquirieron de Sigma Chemicals, St. Louis, MO, EE.UU. y el espectro de Químicos EE.UU. respectivamente. Se obtuvieron las células H460 y A549 NSCLC humanos de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE.UU.). Todos los demás productos químicos eran ya sea reactivo o de grado de cultivo de tejidos. H460 y células A549 se cultivaron en medio RPMI 1640 y medio F12K (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) suplementado con 10 por ciento de suero fetal bovino, respectivamente. Todos los medios de cultivo de tejidos contenía solución antibiótica antimicótica de penicilina (5000 U /ml), estreptomicina (0,1 mg /ml) y neomicina (0,2 mg /ml). Las células se mantuvieron a 37 ° C en presencia de un 5 por ciento de CO
2 en el aire.
Animales
Los ratones hembra nu /nu (seis semanas de edad, Harlan, Indianapolis, IN ) se agruparon y alojados (8 /jaula) en la unidad microisolator introducir en la jaula estéril suministrado con ropa de cama Tek-Fresh autoclave. Los animales fueron alojados en la Florida A & M University, de conformidad con las normas de
la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio
y la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care. El presente estudio fue revisado y aprobado por la Florida A & M University Comité (FAMU) Cuidado de Animales y el empleo (AUCU) de agosto de 2009. (Protocolo#002-09).
in vitro
estudios de citotoxicidad
Las células A549 o H460 se sembraron en placas de titulación de 96 pocillos micro, a una densidad de 1 × 10
4 células /pocillo y se dejó incubar durante la noche. Las células se trataron con varias diluciones de la gema en la presencia o ausencia de los números de 10 a 30 y 30 a 50 mM contra H460 y células A549, respectivamente. Las placas se incubaron durante 72 horas a 37 ± 0,2 ° C en una incubadora. La viabilidad celular en cada grupo de tratamiento se determinó por el ensayo de colorante cristal violeta.
inducción de apoptosis en H460 y A549 células
Las células H460 o A549 se sembraron a una densidad de 1 × 10
6 células /pocillo en placas de 6 pocillos y se incubaron durante la noche. células H460 se trataron con Gem (0,4 g /ml), o los números (30 mM), o NGC y las células A549 se trataron con Gem (0,3 g /ml), o los números (50 mM), o NGC. Después de 72 h, las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% y se montaron sobre portaobjetos utilizando Cytospin R (Shandon) y se procesan de acuerdo con ApoTag Red In Situ Apoptosis kit de detección de protocolo R (R Chemicon Internacional, CA, EE.UU.). Las imágenes de las diapositivas se visualizaron con un microscopio de fluorescencia Olympus BX40. Para cuantificar las células apoptóticas, se contaron 100 células de 6 campos microscópicos al azar.
La inhibición de la formación de tubos de células HUVEC
in vitro
Los efectos antiangiogénicos de los números y Gem se analizaron usando un
in vitro
Ensayo de angiogénesis Kit (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Brevemente, las células HUVEC se cultivaron en presencia o ausencia de 30 mM NOS, 0,4 mg /ml de la gema y NGC sobre polimerizado Matrigel a 37 ° C. Standard Matrigel se dejó polimerizar en una placa de 96 pocillos y las células HUVEC se sembraron a una densidad de 3 x 10
4 por pocillo en medio ECM. Después de 6 h, se evaluó y se fotografió la formación de tubos por las células endoteliales. La cuantificación de la progresión de la angiogénesis se llevó a cabo contando los puntos de ramificación de tubos capilares formados después de una cantidad fija de tiempo (ensayo de punto final). puntos de ramificación en varias de visualización de campos aleatorios (3-10) por pocillo, deben contarse y se promediarán los valores.
in vivo
efecto antitumoral de los números contra los tumores de pulmón H460
las células se recogieron H460 adherentes y se centrifugó a 500 g durante 4 min a 4 ° C y el sedimento celular se volvió a suspender. Las células se diluyeron a 3 × 10
6 células /100 l usando medio de crecimiento. Los 100 l de suspensión de células se inyectaron por vía subcutánea en el área de flanco derecho de cada ratón. El protocolo para
in vivo
experimentos con ratones desnudos fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo, Florida A & M University, Tallahassee, FL. Los ratones se asignaron al azar (n = 8) después de 50 mm
3 de xenoinjertos de tumores (7 días después de la implantación del tumor) y se trató con i) 160 l de vehículo (tampón fosfato, pH 3,5); ii) Gem (30 mg /kg en bolo i.v., Q3D × 7 cronograma); iii) los números 300 mg /kg al día por sonda oral; y iv) la terapia NGC durante 38 días después de la implantación del tumor
. Noscapina se disolvió en tampón de fosfato, pH 3,5 y gemcitabina se disolvió en el tampón de fosfato salino antes de la administración a los ratones. Para comprobar si hay evidencia de toxicidad, los animales se pesaron dos veces por semana. Las dimensiones del tumor se midieron utilizando un volumen tumoral pinza y lineal se calculó utilizando la ecuación siguiente: (1) donde, España
v = volumen tumoral
a = diámetro mayor del tumor
b = diámetro más pequeño del tumor
En el día 38, todos los animales fueron sacrificados después de la eliminación de los tejidos tumorales; algunos de los tumores fueron fijados en formalina, mientras que otros se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenan en -80 ° C.
Transferencia Western de los tejidos tumorales
Las proteínas se extrajeron muestras de tejido tumoral mediante RIPA tampón con inhibidor de la proteasa se incuba durante 30 min en hielo y los sobrenadantes se almacenaron a -80 ° C después de la centrifugación. Para el Western Blot (WB), se utilizó un procedimiento previamente establecido en el laboratorio. [24], [28] Las membranas se probaron con anticuerpos primarios (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) Sp1 (1:750), Sp3 (1:750), VEGF (1:500), pAKT (1:500) , ciclina D1 (1:500), p53 (1:500), p21 (1:500),), PARP (1:1000), PARP escindida (1:1000), se escindió de la caspasa 3 (1:1000), caspasa 8 (1:1000) y la caspasa 9 (1:1000), Bax (1:1000), Bcl
2 (1:1000), BID (1:500) y anticuerpos beta-actina (1:500). Los anticuerpos unidos se revelaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (1:2000) utilizando SuperSignal West Pico solución quimioluminiscente (Pierce, Rockford, IL). proteína beta actina se utilizó como control de carga. El análisis densitométrico de las bandas se realizó utilizando el programa ImageJ v1.33u.
TUNEL ensayo, exfoliados caspasa 3 de expresión y VEGFexpression
El TUNEL, escinde la tinción de la caspasa-3 y VEGF en parafina embebidos en los tejidos tumorales fueron evaluados utilizando el Sistema de detección de apoptosis colorimétrico DeadEndTM (Promega, Madison, WI), escindidos de la caspasa-3 kit de tinción (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) y Sistema de tinción ABC ™ ImmunoCruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), respectivamente, como se describe anteriormente [26]. secciones de tejido tumoral (4-5 m de espesor) montadas en diapositivas recubierta con poli-L-lisina se desparafinaron por xileno y se deshidrataron a través de concentraciones graduadas de alcohol, después se incubaron con 3 por ciento de peroxidasa de hidrógeno durante 20 min para bloquear la actividad peroxidasa endógena. la recuperación de antígeno para la tinción y el bloqueo de la peroxidasa endógena se realizó como se describe anteriormente [26]. Las muestras se incubaron durante la noche a 4 ° C con una dilución 1:50 de anticuerpo primario se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado seguido de estreptavidina. El color fue desarrollado por la exposición de la peroxidasa a un sustrato-cromógeno, que forma un producto de reacción marrón. Las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina. Tres diapositivas por grupo estaban manchadas y TUNLE, caspasa 3 escindida células teñidas fueron identificadas por tinción citoplasmática oscuro marrón. Las células VEGF manchado se identificaron mediante tinción de color marrón. Las imágenes de las diapositivas se visualizaron con un microscopio óptico Olympus BX40.
Expresión de CD31 y Evaluación de la densidad de los microvasos
Para la expresión de CD31 después de un lavado con PBS, las secciones fueron premeditados, en tampón citrato en una horno de microondas durante 20 min a 92-98 ° C. Después de dos lavados con PBS, las muestras se incubaron en 10 por ciento de suero de cabra normal (Atlanta Biológicos, GA, EE.UU.) durante 20 minutos para reducir la unión no específica de anticuerpos. Posteriormente, las secciones se incubaron con un anticuerpo diluido 1:500 ratón CD31 monoclonal (Cell Signaling Tech, MA), que es reconocido como un marcador de superficie de células endoteliales, a temperatura ambiente durante 1 h, seguido de un tratamiento de 30 min con HRP conejo /ratón (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.). La sección se desarrolló con sustrato de peroxidasa diaminobencideno-hidrógeno, y ligeramente contratinción con hematoxilina. Para el cálculo de la densidad microvascular (MVD), se seleccionaron tres áreas más vascularizadas del tumor ( "puntos calientes") y los valores medios obtenidos mediante el recuento vasos. Un único microvasos se definió como un grupo discreto de células positivas para la tinción de CD31, sin necesidad de la presencia de un lumen. los recuentos de microvasos se realizaron a X 400 (lente objetivo X40 y X10 lente ocular; 0,74 mm
2 por campo)
Estadísticas
Se realizó ANOVA de una vía seguido por la prueba de comparación múltiple de Tukey. para determinar la significación de las diferencias entre los grupos usando el software GraphPad Prism versión 3.0 (SanDiego, CA). Las diferencias se consideraron significativas en todos los experimentos a
P Hotel & lt; 0,01 (*, significativamente diferentes de los controles no tratados;.
**, significativamente diferente de la NOS y la gema de los tratamientos individuales
Resultados
sinérgica
in vitro
citotoxicidad del tratamiento NGC
estudios de citotoxicidad in vitro con números contra las células H460 y A549 mostró IC
50 valores de 34,7 ± 2,5 M y 61,25 ± 5,6 M respectivamente. Gem mostró IC
50 de 0,7 ± 0,1 mg /ml y 0,6 ± 0,2 g /ml contra H460 y células de NSCLC A459. Los efectos combinados de la gema y NOS en la proliferación celular se evaluó mediante análisis isobolográfico. El CI los valores oscilaron entre 0.34 ± 0.02 a 0.59 ± 0.04 por 50 células por ciento matar sugiriendo sinérgica a la fuerte comportamiento sinérgico entre los números y Gem contra ambas líneas celulares de cáncer (figura 1A). isobologramas para el espectáculo nivel de efecto del 50% de que el IC
50 concentraciones -equivalente para diversas combinaciones núms /gema se encuentran por debajo de la línea de aditividad, lo que indica sinérgico activityof números y la combinación de la gema (fig. 1B). La separación de los puntos en el isobolograma fue consistente con la de los valores de CI.
se emplearon diferentes concentraciones de los números para estudiar el efecto sobre la IC50 de la gema. Se utilizaron proporciones variables de las concentraciones de drogas y ecuaciones mutuamente no excluyentes para determinar el CI. Los valores de CI representan la media de cuatro experimentos. CI & gt; 1,3: antagonismo; IC 1,1-1,3: antagonismo moderado; CI 0,9-1,1: efecto aditivo; IC 0,8-0,9: ligera sinergia; IC 0,6-0,8: sinergia moderada; IC 0,4-0,6: sinergia; IC 0,2-0,4:. Sinergismo fuerte
formación de tubos de ensayo efecto- antiangiogénico
Nos (30 mM), Gema (0,3 mg /ml) y 30 mM núms + 0,3 mg /ml tratamiento Gem durante 6 horas mostró estructuras tubulares Organizaciónde HUVEC pobres y una disminución en las formaciones punto de ramificación del tubo capilar (Fig. 2A), en comparación con el grupo control que mostró una rica malla de túbulos ramificados de tipo capilar anastomosing con uniones multicéntricos (fig. 2). NGC tratamiento disminuyó formulación del punto de ramificación promedio de 68 ± 5 por ciento en comparación con 26 ± 3 por ciento en los números solos y en un 29 ± 4 por ciento de la gema solo (Fig. 2B).
Para el ensayo de formación de tubos, las células HUVEC fueron se incubaron con los números (30 mM), gema (0,4 mg /ml) y NGC en Matrigel polimerizado a 37 ° C. Después de 6 h, la formación de tubos por las células endoteliales fue fotografiado y se cuantificó la formación punto de ramificación tubo capilar (n = 3). Para el ensayo de TUNEL, H460 células fueron tratadas con Gem 0,4 g /ml, Nos 30 m, y, NGC y las células A549 se trataron con Gem 0,3 g /ml, Nos 50 m, y, NGC. Las células de control no se trataron. Micron bar = 10 micras. Las células se cuantificaron contando 100 células a partir de 6 campos microscópicos al azar. Los datos se expresan como células A549
Fig media ± SD (n = 6).
La inducción de la apoptosis en H460 y. 2C muestra que la apoptosis es inducida en células H460 y A549 después del tratamiento con la gema, o números, o NGC. tratamiento NGC condujo a la apoptosis en el 59 ± 4 por ciento de las células H460 tratadas en comparación con 27 ± 3 por ciento y 20 ± 2 por ciento en Gem y NOS respectivamente, después de 72 h (figura 2D y 2E). Del mismo modo, el tratamiento NGC de las células A549 condujo a células apoptóticas 67 ± 5,0 por ciento en comparación con 32 ± 2,0 por ciento y un 20 ± 3,0 por ciento en la gema y los números, respectivamente (figura 2D y 2E). Todos los tratamientos fueron significativamente diferentes de control (* P & lt; 0,01). Gema o números tratamiento fue significativamente diferente del tratamiento NGC (**, P & lt; 0,001).
Actividad
Anti-tumoral en xenoinjertos de NGC H460
Los resultados (Fig. 3) muestran que el tumor el volumen se redujo significativamente después del tratamiento con la gema, números, o NGC comparación con el control. El volumen del tumor para el tratamiento NGC un promedio de 418.74 ± 55.53 mm
3 en comparación con 1605.08 ± 253.29 mm
3 para el tratamiento de los números o 1498.33 ± 149.38 mm
3 para el tratamiento de la gema (volumen del tumor ± SE) en el día 38 posterior la implantación del tumor. Por otra parte, no se observó ninguna pérdida de peso u otros signos de toxicidad en los ratones tratados con NGC o números o una gema
.
Los ratones fueron tratados con la gema 30 mg /kg i.v. bolo, Q3D × 7 programación, los números 300 mg /kg /día, y NGC. El grupo de control recibió sólo vehículo. Los datos presentados son medios y SE (n = 8). Este experimento se repitió dos veces.
Efectos sobre la especificidad proteínas, proteínas angiogénicas y apoptosis en xenoinjertos de tumores de pulmón H460
El NGC y Gem disminución de la expresión de SP1 y SP3 en tumores recogidos en comparación con los ratones de control (Fig 4). tratamiento NGC disminución de la expresión de expresión de la proteína VEGF a 0,26 veces en comparación con 0,12 veces con los números y 0,13 veces con el tratamiento de la gema, respectivamente de los controles en los tumores de regresión (Fig 4). La expresión de la proteína survivina se redujo significativamente por 0,67 veces, 0,29 veces y 0,37 veces con NGC, Gem y tratamiento núms en comparación con el grupo control, respectivamente (Fig 4). El NGC mostró disminución significativa en la expresión de pAKT en comparación con el grupo control. En los tumores retrocedido, el NGC y Gem disminuyeron significativamente la expresión de ciclina D1 a un 0,39, 0,20, y 0,15 veces, respectivamente de los controles (figura 4). Nos, Gem y tratamiento NGC aumentaron significativamente la expresión de p53 a 1,2, 1,3 y 1,6 veces en las muestras de tumor regresión comparación con el control, respectivamente. (Fig 4) La expresión de p21 aumentó de forma significativa a 1,31 veces con tratamiento NGC en comparación con 1,15 y 1,13 veces con los números y el tratamiento de la gema, respectivamente (Fig 4). Los resultados se ilustran en la figura 5 muestran que en los números, Gema y NGC tratamiento mostró significativo incremento en la expresión de PARP escindida, Bax, BID, la caspasa 3, escindidos de caspasa 3, caspasa 8 y caspasa 9, y la disminución de la expresión de PARP y Bcl
2 compararon con el grupo control. La expresión de proteínas apoptóticas y antiapoptóticas en el tratamiento NGC fue significativamente diferente de los grupos de tratamiento con un único agente
Carril 1, los tumores de control no tratados.; carril 2, oral Nos 300 mg /kg; carril 3, Gema 30 mg /kg i.v. bolo, Q3D × 7 programación; carril 4; NGC. ß-actina proteína actúa como un control de carga. Se observaron resultados similares en los experimentos por triplicado. Se determinaron los niveles de expresión de la proteína (en relación con ß-actina). La media ± DE para tres determinaciones repetidas
Calle 1, tumores de control no tratados.; carril 2, oral Nos 300 mg /kg; carril 3, Gema 30 mg /kg i.v. bolo, Q3D × 7 programación; carril 4; NGC. ß-actina proteína actúa como un control de carga. Se observaron resultados similares en experimentos duplicados. Se determinaron los niveles de expresión de la proteína (en relación con ß-actina). La media ± DE para tres determinaciones repetidas.
fragmentación del ADN y la expresión escindido de la caspasa-3 en el tejido tumoral
tratamiento de agente único, ya sea con o números Gem inducida por la fragmentación del ADN que fue significativamente mayor (** P & lt; 0,001) aumentó mediante tratamiento NGC. El tratamiento NGC condujo a la apoptosis en 80 ± 5,0 (** P & lt; 0,01) por ciento de las células tumorales, mientras que los números y Gem indujeron apoptosis en 34 ± 3,0 por ciento y 42 ± 4,0 por ciento de las células tumorales, respectivamente (Fig. 6). Gema, números, y NGC indujo la expresión escindido caspasa-3 en los tumores que fue significativamente diferente en comparación con el control de los tumores. NGC, Gema y tratamiento números mostraron 62 ± 4,0, 34 ± 2,0 y 26 ± 2,0 por ciento aumento de la expresión de la caspasa 3 escindida en los tumores de los tejidos, respectivamente, en comparación con el grupo control (Fig. 6).
Los datos se expresan como media + SD (N = 6).
La inhibición de la angiogénesis y la MVD en el tejido tumoral
La más alta expresión de VEGF se observó en los tejidos tumorales cosechadas de los ratones no tratados (Fig. 6 ). se observó disminución de la tinción de VEGF en los tumores tratados con NGC (0,28 veces) en comparación con los tumores tratados con Gem (0,15 veces) o NOS (0,1 veces) solo. Esta respuesta se correlacionó positivamente con la baja regulación de la proteína VEGF observada en lisados de tumores de los ratones tratados con los mismos compuestos (Fig. 4). Se identificaron CD31 (+) las células endoteliales utilizando la técnica IHC en los tejidos tumorales cosechadas y los resultados se muestran en la Fig. 6. La tinción de microvasos en NGC, Gema y números grupos tratados fueron significativamente disminuido a 0,21, 0,08, y 0,06 veces en comparación con el grupo control. El microvasos promedio por campo en los grupos tratados con los números, Gema y NGC resultaron ser 148,7 ± 18,6, 135,3 ± 17,5, 91,8 y 6,1, respectivamente, en comparación con 197,7 ± 22,4 en el grupo de control.
Discusión
la mala evolución clínica de la quimioterapia actual requiere la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento del NSCLC [1], [3], [4]. El desarrollo de potentes sin platino quimioterapia de combinación basada con menos efectos secundarios adversos ayudará a mejorar los resultados clínicos en pacientes con cáncer de pulmón [3], [4], [5]. El uso de agentes anti-microtubulares prometedores se ha limitado debido a la resistencia a las drogas, la infusión i.v. prolongada y efectos secundarios adversos asociados [15], [16]. Nos es un agente de microtúbulos activo por vía oral más seguro [19], [20], [23] y ha expuesto in vitro e in vivo la actividad antitumoral contra diversos tipos de cáncer [19], [20], [21], [22] , [23]. Nuestros estudios previos demostraron que en los números exhibe actividad contra el cáncer en modelo de xenoinjerto murino H460 sin efectos secundarios adversos [24]. Gem es uno de los agentes más eficaces contra el cáncer de pulmón que inhibe la síntesis de ADN y la ribonucleótido reductasa [6], [7]. Por lo tanto, se espera que NGC quimioterapia puede ejercer una actividad anticancerígena sinérgica o aditiva y tendrá efectos secundarios adversos más bajos debido a la exigencia de reducción de la dosis de la gema.
Las células de crecimiento rápido crecimiento A549 H460 y lentos fueron seleccionados [28] para determinar la actividad de los números y Gem combinación en las sub IC
50 concentraciones mediante método de uso común isobolográfico [28], [29], [30]. En la presente investigación, el análisis isobolográfico de los datos mostró que en los números mejora la citotoxicidad de Gem (valores de CI & lt; 0,59) en el A549 y células de NSCLC humanos H460 de una manera sinérgica (Fig 1A). La actividad sinérgica se observó también en el isobolograma, donde se encuentran IC concentraciones
50-equivalentes para varios NGC debajo de la línea de aditividad (Fig 1B). Recientemente hemos informado de que los valores de CI & lt; 1,0 son indicativos de la actividad sinérgica entre DIM-C-PPHC
6 H
5y Docetaxel en las células NSCLC [28]
Para estudiar el posible mecanismo implicado en. el aumento de la citotoxicidad de la gema por los números, que evalúa la formación de tubo HUVEC y la apoptosis de las células tumorales [31]. Newcomb et al. informó que en los números (0-150 mM) inhibió
in vitro la formación del tubo Hoteles en 2h11 células endoteliales [32]. Del mismo modo, Laquente et al también demostró la inhibición de la proliferación de células HUVEC por Gem [33] y por lo tanto, hemos evaluado el potencial antiangiogénico de NGC. No ha habido ningún estudio hasta la fecha para evaluar el efecto de GNC en la formación de tubo HUVEC. NGC mostró las estructuras lineales de la red fueron significativamente perturbado en comparación con el tratamiento con agente único o los controles. NGC exhibió actividad anti-angiogénica sinérgico por la inhibición de la formación del tubo en comparación con los números o Gem solo (Fig 2).
La inducción de la apoptosis es mecanismos clave de agentes contra el cáncer y la inducción significativa de la apoptosis, que era evidente por TUNEL positivo tinción y la condensación de la cromatina en el tratamiento NGC en comparación con un solo agente. Similar a nuestros resultados, el tratamiento de combinación de los números (150 mg /kg /día por sonda) y
60Co de radiación (fracción única - 25 Gy) mostró significativa (
P Hotel & lt; 0,01) mayor GL261 TUNEL positivas las células en comparación con el tratamiento con agente único [33].
Después de haber establecido la eficacia del tratamiento NGC
in vitro
, el próximo evaluó la
in vivo
antitumoral eficacia de NGC en tumores de xenoinjertos de pulmón H460 en nu /nu. Se seleccionaron las dosis sub-terapéutica de los números (300 mg /kg /dayand Gem (30 mg /kg iv en bolo, bolo iv, Q3D × 7 horario) sobre la base de nuestros estudios anteriores que han demostrado actividad contra el cáncer dependiente de la dosis (300 & lt; 450 y lt; 550 mg /kg /día) de los números en contra H460 xenoinjerto modelo murino [24]. Nuestro
in vivo
resultados demuestran comportamiento aditivo de NGC en H460 murino modelo de tumor de xenoinjerto (figura 3A). Anterior informaron estudios demostró que el cáncer la actividad de los números varía con el tipo y la sensibilidad de las células del cáncer [19], [20], [21]. Curiosamente, el tratamiento NGC mostró un cambio no significativo en la pérdida de peso que sugiere el perfil de toxicidad favorable de los números y el tratamiento de la gema. NGC será ventajosa sobre Gem convencional + tratamiento taxano de cáncer de pulmón debido a la mejora el cumplimiento del paciente mediante la administración oral de los números con los efectos secundarios adversos mínimos. Varios estudios han proporcionado pruebas de que la inhibición del crecimiento tumoral mejorada se puede lograr mediante la combinación de Gem con otros agentes tales como bortezomib [34] , Telomelysin [35], dihidroartemisinina [36], paclitaxel [37], y topotecan [38] en comparación con el tratamiento con agente único. La
in vivo
aditivo actividad de tratamiento NGC se puede atribuir a la mala biodisponibilidad (& lt; 30%), la vida media en plasma más corto (& lt; 4,5 h) y un extenso metabolismo de primer paso de los números reducir la disponibilidad núms en el sitio del tumor [39], [40], [41]. Nuestros estudios futuros se centrarán en la mejora de la biodisponibilidad de los números de explorar su potencial contra el cáncer en combinación con la gema.
Sobre la base de
in vitro
actividad antiangiogénica y apoptótica en que hemos evaluado la expresión de las proteínas SP, la supervivencia celular, VEGF y proteínas apoptóticas. proteínas SP son factores de transcripción que se sobreexpresan en muchos tumores humanos [42], [43]. Lou et al. demostró que la transformación de los fibroblastos dio como resultado aumento de la expresión Sp1 por 8 a 18 veces y mostró la formación de tumores altamente malignos en modelos de xenoinjerto atímicos [44]. Por el momento el tiempo, hemos demostrado que el tratamiento NGC mostró significativa (p & lt; 0,01) disminución en la expresión de las proteínas SP1 y SP3 en comparación con el tratamiento con agente único y el grupo de control. Estudios previos demostraron que la expresión de VEGF es parcialmente dependiente de proteínas Sp [45], y también hay evidencia de que la expresión de survivina es Sp dependientes [46]. Gem, Nos y tratamiento NGC disminución de la expresión de survivina en tumores de pulmón (Fig 4A y 4B). La survivina es un miembro de la familia inhibidor de la apoptosis que inhibe la activación de la caspasa y actúa como un regulador negativo [46]. Por lo tanto, la baja regulación de la expresión de survivina resultados en la activación de las caspasas y por lo tanto induce la apoptosis en las células tumorales. También se observó que el tratamiento NGC disminuyó significativamente la expresión de VEGF (Fig 4D) en los tumores de regresión comparación con el tratamiento de agente único. Del mismo modo, Papineni et al demostraron que el ácido tolfenámico inhibe el cáncer de esófago a través de la represión de las proteínas SP y varios genes dependientes Sp-y proteínas tales como VEGF, survivin, ciclina D1 y Bcl-2 [47]. Nos solo y tratamiento NGC mostró disminución de la expresión de VEGF y survivin, que puede ser correlacionada con la degradación de Sp1 y Sp3. Además, nuestros resultados muestran que el tratamiento de IHC NGC disminuyó VEGF y CD 31 de tinción en los tejidos tumorales recogidas de ratones en comparación con el tratamiento solo agente y el control (Fig 6A).