Extracto
Sulfatide es un glicoesfingolípidos sabe que interactúan con varias proteínas de la matriz extracelular, tales como la tenascina-C que se sobreexpresa en muchos tipos de cáncer, incluyendo el de colon. En vista del éxito limitado de la quimioterapia en el cáncer colorrectal y de alta toxicidad de la doxorrubicina (DOX), se adoptó un enfoque encapsulación en liposomas que contienen sulfatida-(SCL) para superar estas barreras. Este estudio evaluó la citotoxicidad in vitro, la biodistribución, la eficacia terapéutica y la toxicidad sistémica in vivo de contener sulfatida-doxorrubicina liposomal (SCL-DOX) usando humano adenocarcinoma de colon HT-29 xenoinjerto como el modelo experimental. In vitro, el SCL-DOX se mostró a ser entregado en los núcleos y se muestra la retención prolongada en comparación con el DOX libre. El uso de este sistema de entrega para entregar nanodroga DOX para el tratamiento de ratones portadores de tumor produce un muy mejorado la eficacia terapéutica en términos de supresión del crecimiento tumoral y la supervivencia prolongada en contraste con el fármaco libre. Además, el tratamiento de ratones portadores de tumores con SCL-DOX resultó en una menor absorción DOX en los sitios principales de la toxicidad del fármaco libre, es decir, el corazón y la piel, así como la reducción mielosupresión y la disminución de cardiotoxicidad. Tales sistemas de liberación de lípidos nanodroga guiada naturales pueden representar una nueva estrategia para el desarrollo de agentes quimioterapéuticos contra el cáncer eficaces, en beneficio del microambiente tumoral tanto para el tumor primario y micrometástasis
Visto:. Lin J, Yu Y, Shigdar S, Fang DZ , Du JR, Wei MQ, et al. (2012) Enhanced antitumoral eficacia y toxicidad sistémica Reducción de Sulfatide que contienen Nanoliposomal doxorrubicina en un modelo de xenoinjerto de cáncer colorrectal. PLoS ONE 7 (11): e49277. doi: 10.1371 /journal.pone.0049277
Editor: Maurilio Sampaolesi, Stem Cell Research Institute, Bélgica
Recibido: 22 Julio, 2012; Aceptado: 8 Octubre 2012; Publicado: 7 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Consejo de Investigación médica (# 479505) Nacional de Salud y; Australia-India Fondo Estratégico de Investigación, (ST01-0013). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es la tercera causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo [1], [2], con hasta un 25% de los pacientes que presentan enfermedad metastásica. A pesar de la cirugía y la quimioterapia, muchos de estos pacientes finalmente sucumben a las enfermedades metastásicas. Las terapias adyuvantes, incluyendo la radioterapia y la quimioterapia, están diseñados para dirigirse a las células tumorales residuales. En el estadio III de pacientes con cáncer colorrectal, la quimioterapia sigue siendo la estrategia principal del tratamiento [3]. Sin embargo, el éxito de estas terapias está limitado por la aparición de células cancerosas resistentes a la terapia, así como toxicidades limitantes de la dosis [4]. Durante las últimas décadas, los sistemas terapéuticos nanoescala han surgido como nuevas modalidades terapéuticas para combatir el cáncer [4]. Las formulaciones de nanopartículas de fármacos contra el cáncer tradicionales libres pueden haber mejorado la farmacocinética y perfiles de biodistribución, la eficacia antitumoral mejorada, así como la reducción de toxicidad a los tejidos sanos.
medicamentos liposomales fueron la primera tales nanomedicina aprobado y ampliamente utilizado para el tratamiento de la tipos de cáncer [5], [6]. Los liposomas son vesículas microscópicas de fosfolípidos con una estructura de membrana de dos capas. Los estudios preclínicos y clínicos han demostrado que los perfiles farmacocinéticos, así como las especificidades de orientación, de los liposomas se pueden controlar y modificar para reducir los efectos secundarios de los fármacos encapsulados y mejorar su eficacia [7], [8], [9].
Hemos desarrollado recientemente un sistema de soporte novela liposomal que se compone de dos lípidos que se encuentran en los seres humanos, sulfatida y 1,2-dioleoyl-
sn
glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) [12 ], [13]. Bajo pH fisiológico, DOPE confiere estabilidad a sulfatida que contiene liposomas (SCL) a través de sus efectos inhibidores sobre la fusión de liposomas, como la incorporación de sulfatida en vesículas DOPE mejora en gran medida la estabilidad de los liposomas formados, incluso en presencia de plasma, presumiblemente debido a la hidratación del sulfato de grupo de cabeza cargado negativamente de la glicoesfingolípidos [10]. También hemos demostrado que la interacción entre sulfatida y tenascina media en la unión de SCL para la captación endocítica ECM y de los liposomas por las células tumorales al menos in vitro [10], [11].
La administración dirigida de agentes contra el cáncer para el microambiente tumoral es una vía prometedora para la terapia del cáncer colorrectal metastásico. La tenascina-C, una gran extracelular glicoproteína matriz hexabracchion, es altamente expresado en el microambiente de la mayoría de los tumores sólidos, incluyendo cáncer colorrectal, pero está ausente o reducido en gran medida en la mayoría de tejidos adultos [14]. Así, nuestro sistema de soporte liposomal que contiene sulfatida-representa una nueva clase de sistema de suministro intracelular de lípidos guiada natural de la orientación del microambiente del tumor. En la exploración de una nueva dirección tal para el desarrollo de agentes quimioterapéuticos contra el cáncer más eficaces, es importante para entender el comportamiento in vivo de la nanotransportador, como la distribución singular gobernada por las propiedades de la nanotransportador puede cambiar la eficacia terapéutica, así como alterar la toxicidad perfil del fármaco encapsulado. En este estudio, utilizamos un modelo de xenoinjerto de ratón de adenocarcinoma colorrectal humano (HT-29) que se sabe que expresa tenascina-C [15], [16] y un fármaco de quimioterapia ampliamente utilizado, doxorubicina (DOX), como un modelo de carga útil para estudiar la biodistribución, la eficacia antitumoral y la toxicidad del sistema portador liposomal que contiene sulfatida.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
el Comité de Bienestar Animal de la Universidad de Deakin ha aprobado todos los animales protocolos utilizados en esta investigación.
Cell Cultura y
La línea celular de adenocarcinoma de colon humano HT-29 se adquirió de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). 5A de McCoy medio (modificado) se adquirió de Invitrogen ™ (Australia). suero bovino fetal (FBS) se adquirió de Hyclone (Canadá). La tripsina se adquirió de Invitrogen ™ (Australia). frascos de cultivo de tejidos se compraron de BD Falcon ™ (Australia). platos de fondo de cristal fueron adquiridos de MatTek Corporation (Ashalnd, MA, EE.UU.). Células HT-29 se cultivaron en medio 5A de McCoy suplementado con 10% de suero fetal bovino, penicilina (50 U /ml) y estreptomicina (50 mg /ml) en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
aire 2 y 95% a 37 ° C.
Preparación de SCL-DOX
Los liposomas se prepararon de acuerdo con un método publicado previamente con algunas modificaciones [10]. Brevemente, vesículas unilamelares DOPE que contienen 30% sulfatida (relación molar) se prepararon por un método de hidratación seguido de extrusión de membrana de policarbonato. DOPE (13,35 mM) y sulfatida (6 mM, Avanti Polar Lipids, Inc.) se disolvieron en una mezcla de cloroformo y metanol (02:01, v /v), y la mezcla de lípidos, compuesta de DOPE /sulfatida (3: 7, mol /mol), se transfirió a tubos de vidrio. Las muestras fueron luego reducidos a un volumen mínimo bajo una corriente de nitrógeno, y se almacenan bajo vacío durante 24 horas a 4 ° C para evaporar completamente el disolvente orgánico. Las películas lipídicas se hidrataron finas mediante la adición de 1 ml de sulfato de amonio 250 mM (pH 8,5). Las muestras se colocaron entonces en un baño de hielo-agua y se sonicaron en nitrógeno durante 2,5 min con una amplitud de 50% utilizando un sonicador (Sonics & amp; Materials, Inc). Después de la sonicación, se formaron los liposomas a través de extrusión a través de membranas de policarbonato (Avanti Polar Lipids, Inc.) con tamaños consecutivos de poro de 400 nm durante 14 veces, 200 nm durante 14 veces y 100 nm durante 19 veces a temperatura ambiente. Para establecer un gradiente de sulfato de amonio trans-bicapa, los liposomas extruidos se dializaron frente a un volumen 250 veces mayor de 10% de sacarosa en Trizma 25 mM a pH 8,5 a 4 ° C durante 24 h. El tampón externo se cambió tres veces durante la diálisis. Después de la diálisis de los liposomas, DOX, en 10% de sacarosa a una concentración final de 5 mg /ml, se añadió a los liposomas en una relación de fármaco a lípido de 0.3:1 (w /w), seguido de incubación en una baño de agua a 60 ° C durante 1 h. No encapsulado DOX se separó por cromatografía de exclusión molecular usando una columna de Sephadex G-50. Se determinó la concentración de los fosfolípidos (DOPE) en los liposomas como se describe anteriormente [17]. El tamaño de la vesícula y el potencial zeta de SCL se midieron utilizando Zetasizer Nano ZS sistema de caracterización de partículas de Malvern? Instrumentos (Malvern, Reino Unido). El DOX cargado en SCL se cuantificó usando un detector de fluorescencia en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Se utilizó
cromatográfica instrumentación basado en un método previamente publicado con algunas modificaciones [18], [19]. En pocas palabras, el sistema de HPLC (Milford, MA, EE.UU.) usado en este estudio consiste en un módulo de separación Waters e2695 y un 2475 Multi λ detector de fluorescencia Waters. Las longitudes de onda de excitación y emisión se fijaron en el 470 nm y 585 nm, respectivamente. La separación cromatográfica se realizó usando una columna Nova-Pak® C18 (3,9 x 150 mm de diámetro interno, 4 micras, Waters, EE.UU.) con una columna de guarda C18 Nova-Pak ® (3,9 x 20 mm de diámetro interno, 4 micras, Waters, EE.UU.). Una mezcla de metanol y tampón de fosfato 10 mM (pH = 3,0) se utilizó como la fase móvil. La velocidad de flujo usada en el ensayo fue de 1 ml /min y la columna se mantuvo a 40 ± 5 ° C durante todo el proceso cromatográfico.
Análisis de citotoxicidad
El efecto de DOX libre o SCL-DOX en HT-29 citotoxicidad se determinó usando el ensayo de proliferación celular MTT [20], [21]. células HT-29 se sembraron a una densidad de 2 × 10
3 células por pocillo en una placa de 96 pocillos en 100 l medio 5A de McCoy que contenía 10% de FBS. solución libre de DOX y SCL-DOX se añadieron a cada pocillo 24 h después de la siembra (concentración final 0-100 mg /ml). Después de 48 h de incubación a 37 ° C, 5% de CO
2, se midió la absorbancia a una longitud de onda de 570 nm utilizando un lector de placas Victor TM X5 Multilabel HTS (PerkinElmer Life Sciences y analítica). La citotoxicidad se expresa como un porcentaje de las células control. La concentración de inhibición del 50% (IC
50), definido como la dosis de agentes que inhiben 50% del crecimiento celular, se interpoló a partir de las curvas de crecimiento utilizando SPSS 13.0 [18], [19]. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y tres veces repetida.
confocal Microscopía Análisis de Absorción celular y retención del SCL-DOX
HT-29 células (1 × 10
5 células /pocillo) se sembraron en placas de 35 mm de fondo de vidrio y se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2 para 24 h. A continuación, el medio se reemplazó con medio de cultivo completo que contiene 2 mg /ml DOX libre o SCL-DOX. Veinticuatro horas después, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y la imagen para los estudios de absorción celular. Para los estudios de retenciones, las células se expusieron primero a 2 mg /ml DOX libre o SCL-DOX en medio de cultivo celular completo durante 24 h y después se lavaron dos veces con PBS. Las células fueron incubadas con medio de cultivo celular fresco y en serie con imagen formada en 1 h, 2 h, 4 h, y 24 h utilizando un Fluoview FV10i láser de fluorescencia confocal de barrido microscopía (Olympus, Japón).
Análisis de las propiedades farmacocinéticas
Male Sprague-Dawley (SD) ratas in vivo (200 a 250 g) se alojaron en una habitación de temperatura controlada (25 ± 1 ° C) con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Las ratas fueron alimentadas
ad libitum
con una dieta estándar, pero se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de DOX libre o administración SCL-DOX. Todos los procedimientos que implican la experimentación con animales fueron aprobados por el Comité de Protección de los Animales de la Universidad de Deakin.
Para investigar la farmacocinética (PK) propiedades del SCL-DOX en vivo, ratas SD sanas fueron inyectados por vía intravenosa con DOX libre o SCL-DOX a través la vena de la cola con una dosis única de 5 mg DOX /kg. Se recogió la sangre en serie desde el mismo animal en tubos heparinizados de la cola en 2 min, 0,5 h, 2 h, 6 h, 24 h y 48 h. Después de la recogida, las muestras se centrifugaron a 3.000 ×
g
a 4 ° C durante 10 min para separar el plasma. Para determinar los niveles de DOX en el plasma, 495 l de metanol y 405 l de tampón de fosfato se añade a 100 l de plasma, vórtex durante 1 min y se centrifugó a 21.000 ×
g
durante 10 min a 4 ° C. El sobrenadante se transfirió a otro tubo, seguido de la adición de 2 l de ácido perclórico (35%, v /v). Las muestras se agitaron en vórtex durante 1 min, y se centrifugaron a 21.000 ×
g
durante 10 min a 4 ° C, seguido de la medición de la concentración de DOX mediante HPLC.
Tumor implantación, tratamiento y la evaluación
xenoinjertos de tumores se establecieron en las 6 semanas de edad BALB /c-Foxn1
nu ratones que fueron comprados desde el Centro de Recursos Animales (Perth, Australia). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité de Protección de los Animales institucional de la Universidad de Deakin. Los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos en TECNIPLAST Sealsafe ™ jaulas ventiladas individualmente (Buguggiate, Italia) a (25 ± 1 ° C) y un /12 h oscuridad ciclo de 12 h de luz. Fueron alimentados
ad libitum
con una dieta estándar.
HT-29 células utilizadas para los tumores de xenoinjertos fueron preparadas por tripsinización. Las células se lavaron y se resuspendieron a una concentración de 3 × 10
7 células /ml en PBS, que luego se inoculó por vía subcutánea (s. C.) En el flanco derecho de los ratones. El tamaño del tumor se evaluó utilizando un calibrador digital cada dos días después de la implantación del tumor y la carga aproximado (mm
3) se calculó como longitud x anchura
2/2 (
V
=
lw
2/2), donde la longitud y la anchura son el eje largo y más corto en milímetros [22].
Para el estudio captación tumoral, los ratones con tumores de ~150 mm
3 eran tratados con DOX libre o SCL-DOX (5 mg /kg de DOX o equivalente) a través de inyección en vena de cola. Veinticuatro horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados por inyección de Lethabarb R (100 mg /kg) y los tumores se procesaron tal como se describe anteriormente [23], [24]. la concentración de DOX en el tejido se determinó mediante HPLC.
Para los experimentos terapéuticos, los ratones fueron tratados cuando los tumores de xenoinjertos alcanzaron 35 mm
3. Los ratones recibieron una inyección de solución salina, libre de DOX (5 mg /kg), SCL-DOX (5 mg /kg en DOX) o en blanco SCL través de la vena de la cola dos veces a la semana durante 3 semanas. El crecimiento tumoral se controló mediante la medición de diámetros de los tumores cada dos días con un calibre y animales pesos fueron controlados al mismo tiempo. El punto final de este estudio se define como la carga tumoral llegar a 1700 mm
3.
Análisis de toxicidad sistémica
Para evaluar la toxicidad general de DOX libre y SCL-DOX, sangre se recogió cuando se sacrificaron los ratones para experimentos terapéuticos. recuentos de células sanguíneas y la troponina fueron analizadas por un laboratorio de patología veterinaria (Gribbles Patología Veterinaria, Clayton, Victoria, Australia). Se obtuvieron frotis de sangre de cada animal para obtener un recuento de glóbulos blancos relativa adaptado del método Fonio para el recuento de plaquetas [25], [26], con modificaciones menores. Los portaobjetos se tiñeron con Giesma y un área de la muestra de sangre fue elegido donde las células rojas colindaban entre sí pero no se solapan, con campos consecutivos elegidos para eliminar el sesgo. Se contó el número total de glóbulos blancos por 1500 células rojas (n = 3 para cada diapositiva) y se compara para cada grupo.
Análisis de Datos
Todos los resultados se presentan como media y error estándar (media ± DE). Los parámetros farmacocinéticos se calcularon a partir de las concentraciones medias en plasma utilizando el software 2.0 del software DAS farmacocinético (Matemática Comité Profesional Farmacología de China, Shanghai, China). Las diferencias en los valores medios entre los diferentes grupos se determinaron mediante un análisis de una vía de la varianza (ANOVA) utilizando el programa SPSS 13.0. Se consideró significativo en los valores de
p
. & Lt; 0,05
Resultados
Caracterización de SCL
Se encontró que la incorporación de SCL diámetro de DOX a oscilar dentro de 92,3 ± 1,3 nm (media ± SE, n = 10) con un índice de polidispersidad (PDI) de 0,15 ± 0,01 (media ± dE). En una relación de peso inicial de DOX a DOPE de 0.3:1, el SCL tenía una eficiencia media atrapamiento DOX de 94,11 ± 2,27% (media ± S.E). El valor potencial zeta de SCL fue -26,38 ± 2,20 mV (media ± S.E.). El DOX para dopar relación de peso después de DOX encapsulación en SCL fue 0.5:1.
intracelular captación y retención del SCL-DOX en células HT-29
Aprovechando la propiedad fluorescente natural de DOX , la captación celular y la retención de DOX libre o SCL-DOX fue estudiada mediante escaneo láser microscopía confocal. células HT-29 se incubaron con 2 g DOX /ml o SCL-DOX para 24 h. Después del lavado, se examinó la captación celular de diferentes formulaciones de DOX. Como se muestra en la Figura S1 (bajo aumento) y la Figura 1 (de gran aumento), tanto libre de DOX y SCL-DOX fueron tomadas por las células de adenocarcinoma colorrectal y había acumulaciones de DOX en el núcleo en ambos grupos (Figura 1), aunque las células tratadas con DOX libre mostraron un poco más fuerte fluorescencia roja (DOX) que los tratados con SCL-DOX después de 24 h de incubación. Curiosamente, la retención de SCL-DOX en células HT-29 era mejor que la de DOX libre. Como se muestra en la Figura S2A (bajo aumento) y la Figura 2A (de gran aumento), después de lavado con PBS y la incubación en medio fresco durante 4 h, la fluorescencia DOX en el grupo de DOX libre disminuyó significativamente. Por otra parte, las células tratadas con DOX libre mostraron disminución de la fluorescencia roja de 24 h después del lavado. Por el contrario, la fluorescencia roja para SCL-DOX era más estable en comparación con la del grupo de DOX libre. Incluso 24 h después del lavado, DOX fluorescencia se puede observar fácilmente en los núcleos de las células tratadas con SCL-DOX (Figura S2B y la Figura 2B). La retención mejorada de SCL-DOX in vitro sugiere que la formulación SCL de DOX podría exhibir mejor la eficacia del tratamiento in vivo.
HT-29 células se incubaron con 2 g /DOX libre ml o equivalente SCL-DOX para 24 marido. Después de dos lavados con PBS, las células fueron imágenes con un microscopio de fluorescencia confocal. Las células (A) tratados con DOX libre. (B) Las células tratadas con SLC-DOX. Red: fluorescencia de DOX; azul: núcleos teñidos con Hoechst 33342. Las barras de escala: 10 micras
HT-29 células se incubaron en primer lugar con 2 mg /ml DOX libre o equivalente SCL-DOX durante 24 h.. Después de dos lavados con PBS para eliminar los fármacos, las células se cultivaron en medio de cultivo completo fresco, seguido de la formación de imágenes en serie a 1 h, 2 h, 4 h y 24 h utilizando microscopía de fluorescencia confocal. Las células (A) tratados con DOX libre. (B) Las células tratadas con SLC-DOX. Red: fluorescencia de DOX; azul: núcleos teñidos con Hoechst 33342. Las barras de escala:. 10 micras
citotoxicidad in vitro
Para estudiar la citotoxicidad in vitro, las células HT-29 fueron expuestas a diferentes concentraciones de libre DOX o SCL-DOX durante 48 h, y la viabilidad celular se midió usando el ensayo de MTT. Como se muestra en la Tabla 1, el IC
50 de DOX para las células HT-29 fue 1,74 ± 0,10 g /ml mientras que la IC
50 de SCL-DOX era 2,77 ± 0,06. Por lo tanto, en condiciones in vitro donde las células fueron expuestas a una concentración constante de los agentes a través de todo el período de ensayo, libre de DOX era más tóxico que el SCL-DOX. SCL vacío no mostraron ningún efecto sobre la supervivencia celular (datos no mostrados).
propiedades farmacocinéticas mejoradas de SCL en ratas SD sanas
Las propiedades farmacocinéticas de ambos DOX libre y SCL- DOX se estudiaron en ratas SD macho sanas. La cinética de eliminación del suero de DOX libre y SCL-DOX se comparó tal como se muestra en la Tabla 2. En nuestro estudio, la tasa de aclaramiento de DOX encapsulado por SCL-DOX (1.39 L /h /kg) fue significativamente más bajo que el de la solución de DOX ( 2.68 L /h /kg,
p Hotel & lt; 0,01), lo que sugiere una tasa diferente de la liquidación de SCL-DOX en comparación con el fármaco libre. Por otra parte, el área bajo la curva de concentración-tiempo en plasma durante el período de estudio (AUC
0-48 h) de DOX entrega a través de SCL fue 2,37 veces mayor que DOX libre (
p Hotel & lt; 0,01) . Por lo tanto, DOX podría mostrar una tasa de aclaramiento reducido de manera significativa, así como una mayor biodisponibilidad cuando se administran atrapado en SCL.
biodistribución y la captación tumoral Ventajas de la SCL-DOX
Los estudios que comparan la acumulación de DOX libre o SCL-DOX en los tumores y los órganos se realizaron en un /c ratones desnudos HT-29 modelo de xenoinjerto de tumor BALB. Los animales fueron inyectados i.v. con una dosis única de DOX libre o SCL-DOX (5 mg /kg) y no hubo una diferencia estadísticamente significativa en la concentración de DOX en los riñones entre los dos grupos de tratamiento 24 h después de la administración. Los pulmones y el hígado mostraron una mayor acumulación de DOX (4,74 veces y 12,94 veces, respectivamente) con el tratamiento SCL-DOX (Figura 3A), y el bazo, un órgano importante del sistema reticuloendotelial, mostraron una 17 veces mayor acumulación de DOX con tratamiento SCL-DOX. Sin embargo, el tratamiento SCL-DOX en los dos órganos principales que muestran toxicidades limitantes de la dosis de DOX clínicamente, a saber, la piel y el corazón, la disminución de la acumulación DOX a 59,0% (0.039 ± 0.001 g /g frente a 0,066 ± 0,003 mg /g) y 77.4% (0,956 ± 0,073 mg /g frente a 1,235 ± 0,083 mg /g) en comparación con el DOX libre, respectivamente (Figura 3A y 2B). Por otra parte, SCL encapsulación mejora de forma significativa la acumulación de DOX (1,3 veces; 0,060 ± 0,005 g /g frente a 0,047 ± 0,003 mg /g) en el tumor de xenoinjerto en comparación con la DOX libre (Figura 3D), lo que confirma claramente la entrega DOX intratumoral reforzada por SCL -DOX in vivo.
ratones desnudos portadores de cáncer colorrectal humano HT-29 xenoinjertos fueron tratados con 5 mg /kg iv DOX libre o SCL-DOX Los ratones se sacrificaron 24 h más tarde. Los órganos y tejidos se recogieron, se lavaron, se pesaron, y la DOX se extrajo y cuantificados. Los datos se muestran como medias ± S.E. (N = 5~6). *,
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con DOX libre; **,
P
. & Lt; 0,01 en comparación con DOX libre
mejorado la eficacia terapéutica del SCL-DOX
Se evaluó la actividad antitumoral de la SCL-DOX usando la BALB /c ratones desnudos HT-29 tumor modelo de xenoinjerto. Una vez que el tumor había crecido hasta aproximadamente 35 mm
3, se dividió a los animales al azar en cuatro grupos (n = 5~10) con el fin de minimizar la diferencia en el peso y el tamaño del tumor entre los grupos. Los siguientes regímenes se administraron por vía i.v. dos veces a la semana durante 3 semanas: (
i
) solución salina; (
ii
) SCL vacío; (
iii
) DOX libre (5 mg /kg) y (
iv
) SCL-DOX (5 mg /kg). El peso corporal de los animales y el tamaño del tumor se monitoriza a continuación, hasta que el tamaño del tumor en los animales de control alcanza el punto final del estudio. Tal como se presenta en la Figura 4, para los grupos de control de ratones que recibieron solución salina o vacío SCL, el tratamiento no mostró ninguna eficacia, y los tamaños medios de tumor al final del estudio fueron 1129.03 ± 55.06 mm
3, y 1188,63 ± 137.54 mm
3, respectivamente (media ± DE, n = 5~6). El grupo de tratamiento SCL-DOX demostró una eficacia superior, con una carga tumoral promedio final de 586.52 ± 29.63 mm
3, en comparación con 809.13 ± 43.75 mm
3 en el grupo de DOX libre. Por lo tanto, en comparación con la solución salina o el tratamiento libre de DOX, la eficacia de la SCL-DOX para suprimir el crecimiento del tumor a la dosis de 5 mg /kg fue significativamente mejorada por $ $ 1,9 veces y ~1.4 veces, respectivamente.
Los ratones con xenoinjertos de HT-29 se inyectaron iv con solución salina, 5 mg /kg de DOX libre, SCL-DOX o vacío SCL dos veces a la semana durante 3 semanas como se indica, a partir del día cuando el volumen del tumor alcanzó ~ 35 mm
3. Los datos mostrados son medias ± S. E. (N = 5~6). *,
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con solución salina; **,
P
& lt; 0,01 en comparación con solución salina; #,
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con DOX libre; & Amp; & amp ;,
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con el blanco SCL; & Amp; & amp; & amp ;,
P
. & Lt; 0,001 en comparación con el blanco SCL
A continuación, se compararon las tasas de supervivencia de ratones portadores de tumores después de los cuatro regímenes de tratamiento diferentes. Como se muestra en la Figura 5, la mediana de supervivencia para los cuatro grupos diferentes fueron 26 días (solución salina), 33 días (DOX libre), 36 días (SCL-DOX) y 32 días (en blanco SCL), respectivamente. Por lo tanto, el tratamiento SCL-DOX aumentó a medio tiempo de vida en un 38,5% en comparación con el grupo control de solución salina, un 12,5% en comparación con el grupo de SCL en blanco y un 9,1% en comparación con el grupo de DOX libre. Estos experimentos demostraron que la administración de SCL-DOX en 6 dosis en un período de tres semanas no sólo proporcionó una mejor inhibición del crecimiento tumoral sino que también mejoró la supervivencia de los animales portadores de xenoinjertos.
La curva de supervivencia de Kaplan-Meier muestra una mejora de vida de los ratones de xenoinjerto portadores tratados con SCL-DOX (n = 9~10 por grupo). Los ratones fueron tratados como se indica en la Figura 3 y se sacrificaron a lo largo del periodo de estudio al llegar a nuestro punto final del estudio.
Reducción de toxicidad sistémica de SCL-DOX
DOX inducida por miocardiopatía es una de las toxicidades principales limitantes de la dosis de la droga [27]. Troponina T cardiaca se libera de los miocitos dañados-DOX [28], por lo tanto, la medición de los niveles séricos de esta proteína proporciona una evaluación sensible de cardiotoxicidad temprana de DOX. El método utilizado en el presente estudio tiene un umbral de corte de & lt; 0,01 mg /l para los sujetos normales [29]. Como se muestra en la Tabla 3, el tratamiento libre de DOX resultó en un nivel sérico de troponina 75 veces mayor en comparación con los controles, lo que confirma la cardiotoxicidad conocido del fármaco libre. Sin embargo, no se observó ninguna elevación de troponina en suero para el grupo de tratamiento SCL-DOX, que se mantuvo por debajo de los niveles de corte, como con los grupos de control, lo que indica que el tratamiento de ratones de xenoinjerto-cojinete con 6 dosis de SCL-DOX durante el período de 4 semana tenían cardiotoxicidad mínima. Para investigar si la encapsulación de DOX en SCL tuvo ningún impacto en la severidad de la depresión de la médula ósea (mielosupresión), el efecto adverso más común de DOX la quimioterapia [27], se estudiaron los cambios en los glóbulos blancos periféricos cuentan. Como se muestra en la Figura 6, no hubo diferencia estadísticamente significativa en el número total de células blancas de la sangre entre la solución salina tratada o grupos tratados con SCL-DOX. Además, en comparación con los ratones tratados con DOX libre, los tratados con SCL-DOX tenían un 2,0 veces y un 3,3 veces más alto recuento de linfocitos y monocitos, respectivamente. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que SCL-DOX tiene cardiotoxicidad mínima y reduce significativamente la mielosupresión
.
HT-29 ratones de xenoinjerto-cojinete se trataron como se indica en la Figura 3. Se recogió sangre inmediatamente después de que los ratones fueron sacrificados al llegar a la punto final. Los datos mostrados son medias ± S. E. (N = 3~5). *,
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con solución salina; ***,
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con solución salina; #,
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con DOX libre; ##,
P
. & Lt; 0,01 en comparación con DOX libre
Discusión
Este estudio es el primero en evaluar la distribución en los tejidos, in vivo actividades contra el cáncer y el perfil de toxicidad de SCL-DOX en un modelo de ratón con xenoinjerto de adenocarcinoma colorrectal humano. Hemos demostrado varios puntos importantes: (a) SCL-DOX fue tomada fácilmente por las células de cáncer de colon y representada retención prolongada; (B) la encapsulación de DOX en SCL resultó en una distribución disminuido del fármaco a los sitios principales de toxicidad aguda y crónica de DOX libre, es decir, el corazón y la piel, así como marcadamente rebajado cardiotoxicidad y mielosupresión; (C) fármaco liposomal que contiene sulfatida-muestra una eficacia terapéutica mejorada en un modelo de ratón de adenocarcinoma colorrectal humano.
La captación intracelular de SCL en células de glioma se demostró que era un resultado de la captación endocítica de los liposomas en anterior trabajar [11]. En este estudio, se confirmó la captación intracelular de SCL-DOX por células de adenocarcinoma colorrectal humano, HT-29, utilizando microscopía confocal. Es importante destacar que, hemos demostrado que el medicamento de quimioterapia encapsulado fue entregado intracelularmente para el sitio de acción, los núcleos, de las células HT-29 (Figuras 1 y 2). Además, el fármaco liposomal entregado fue retenido por las células tumorales, incluso 24 h después del lavado. Nuestro estudio in vitro de la citotoxicidad en comparación con la viabilidad de células de cáncer colorrectal tratados con SCL-DOX y DOX libre usando el ensayo MTT y mostró que ambas formas poseen citotoxicidad manifiesta. Curiosamente, la SCL-DOX tiene un IC
50 59% mayor que la de DOX libre (Tabla 1). Esto es consistente con las observaciones de otros que el IC
50 del fármaco libre y liposomal, cuando se ensaya in vitro, varía dependiendo de las líneas celulares utilizadas y la naturaleza de los liposomas. Por ejemplo, Wang et al. que se encuentra en la línea celular de cáncer de próstata de rata MLLB2, el IC
50 de la formulación liposómica fue significativamente más baja que DOX libre [30]. En un estudio de células resistentes MCF-7 /ADR, el liposomal mostró una DOX 30 veces menor IC
50 en comparación con DOX libre [31]. Sin embargo, en otros estudios libre de DOX parece tener mayor captación intracelular y muestra citotoxicidad mayor que la de DOX liposomal. Por ejemplo, en la línea celular de carcinoma hepatocelular, HepG2, libre de DOX se ha indicado poseer una citotoxicidad mayor en comparación con la de los liposomas ocultos cargados-DOX [24]. Además, polietilenglicol (PEG) revestida-liposomal DOX se ha demostrado que tiene menos toxicidad que DOX libre en la línea celular de glioma, U-87 células [10]. Es importante tener en cuenta que la farmacocinética in vivo son muy diferentes entre DOX liposómica y libre de DOX. La vida media de DOX liposomal puede ser de varios días, mientras que DOX libre puede ser eliminado en unos pocos minutos in vivo [32], [33], [34]. En placas de cultivo celular, las células se exponen a una concentración de fármaco constante durante todo el período de ensayo, y, a menudo ocupan DOX libre más rápidamente que la formulación liposomal [35]. Además, las células para ensayos de MTT son en su mayoría cultivadas en monocapas, que tienen una organización espacial drásticamente diferente de la arquitectura del tejido 3-dimensional in vivo [36]. Por lo tanto, la comparación de IC
50 entre un fármaco libre y una nanopartícula-formulación del fármaco in vitro proporciona una medida de la citotoxicidad bajo una concentración constante durante un período de ensayo elegido, y por lo tanto puede que no sea capaz de proporcionar una fiable predicción de la eficacia terapéutica in vivo [37]. En el presente estudio, aunque el IC
50 de SCL-DOX era mayor que la de DOX libre en las células HT-29 in vitro, la formulación SCL se demostró para mostrar un gran efecto inhibidor de la mejora de tumor sobre la libre DOX en el TC -29 ratones desnudos portadores de tumor (Figuras 4 y 5).
tumores gastrointestinales son conocidos por ser relativamente resistentes a agentes quimioterapéuticos. En 80% de los tumores de colon no tratados, hay un nivel elevado de I (MDR I) gen resistente a múltiples fármacos [38]. La comparación de las propiedades farmacocinéticas entre la DOX libre y SCL-DOX en ratas SD sanas muestra la significativa disminución de la velocidad de eliminación de SCL-DOX en comparación con DOX libre (
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