Extracto
La obesidad es un factor de riesgo para el desarrollo de cáncer de colon; Sin embargo, las redes endocrinas /paracrinas /metabólicos que median en este sentido, son poco conocidos. Aquí planteamos la hipótesis de que los resultados de la obesidad en los productos secretados a partir de tejido adiposo que inducen alteraciones metabólicas relacionadas con malignidad en células de cáncer de colon. células de cáncer de colon HCT116 Humanos, se expusieron a medio acondicionado a partir de fragmentos de tejido adiposo humano cultivadas de obesidad en comparación con sujetos no obesos. tasa de consumo de oxígeno (OCR, sobre todo la respiración mitocondrial) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR, la mayoría de la producción de lactato a través de la glucólisis) se examinaron vis-à-vis la viabilidad celular y la expresión de genes y proteínas relacionadas. Nuestros resultados muestran que los medios de condicionado de los sujetos obesos (frente a no obesos) disminuyó basal (40%,
p & lt; 0,05
) y máxima (50%,
p & lt; 0,05
) OCR y la expresión de genes de proteínas mitocondriales y Bax sin afectar la viabilidad celular o la expresión de enzimas glicolíticas. Cambios similares se podrían recapitulan mediante la incubación de las células con leptina, mientras que, del receptor de leptina antagonista específico inhibió la reducción de OCR inducida por los medios acondicionados procedentes de sujetos obesos. Llegamos a la conclusión de que los productos secretados desde el tejido adiposo de los sujetos obesos inhiben la respiración mitocondrial y la función en las células de cáncer de colon HCT116, un efecto que es al menos en parte mediada por la leptina. Estos resultados ponen de manifiesto un nuevo mecanismo putativo de riesgo asociada a la obesidad de cánceres gastrointestinales, y sugieren posibles nuevas vías terapéuticas
Visto:.-Yehuda Shnaidman E, L Nimri, Tarnovscki T, Kirshtein B, Rudich A, B Schwartz (2013) La leptina secretada humana adiposo Disminuciones mitocondrial La respiración en las células del cáncer de colon HCT116. PLoS ONE 8 (9): e74843. doi: 10.1371 /journal.pone.0074843
Editor: Giovanna Bermano, Robert Gordon University, Reino Unido
Recibido: 24 Enero, 2013; Aceptado: August 8, 2013; Publicado: 20 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Yehuda-Shnaidman et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por Israel Science Foundation de subvención a BS 134/06 Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cada vez es más claro que el alarmante aumento de la prevalencia de la obesidad no sólo aumentará la población de riesgo de los trastornos cardio-metabólico [1], ya que el exceso de peso corporal es ahora también reconocido como un importante factor de riesgo para el desarrollo de cánceres prevalentes tales como el cáncer de colon [2]. Sin embargo, mientras que la asociación entre la obesidad y sus manifestaciones cardio-metabólico ha sido ampliamente estudiado en las últimas décadas, los mecanismos para la "conexión con la obesidad malignidad" siguen siendo poco conocidos.
El tejido adiposo es un órgano endocrino activo, secretando ácidos grasos y hormonas peptídicas o citoquinas (adipocitocinas), que están implicados directamente no sólo en la regulación del metabolismo de todo el cuerpo, sino también en las respuestas inflamatorias e inmunes [3]. Se ha sugerido que el aumento de la obesidad asociada en el tamaño de los adipocitos y /o el número, alteraciones en la secreción adipocytokine y aumento de la angiogénesis, puede contribuir a un mayor riesgo de ciertas enfermedades malignas, incluyendo el cáncer de colon [1,4,5]. Cambios en los niveles de adipocitocinas afectan a la proliferación celular, la apoptosis, el crecimiento invasivo, y la angiogénesis [1]. Aunque numerosos adipocitocinas han sido identificados, solamente varios han sido estudiados por su capacidad de regular el crecimiento de tumores de cáncer de colon. El nivel sérico de leptina está estrechamente relacionado con el tejido adiposo (AT) de masas [6] y fue encontrado previamente por nosotros para afectar a la iniciación del cáncer de colon y la progresión,
in vitro
[7].
en contraste con las células normales, que se basan principalmente en la fosforilación oxidativa mitocondrial para la producción de ATP, la mayoría de las células cancerosas dependen más de la glucólisis aeróbica; un fenómeno denominado "el efecto Warburg" [8]. Se demostró previamente que, en condiciones normales de oxígeno, las células no metastásicas consumen menos glucosa mientras que las células metastásicas constitutivamente exhiben una mayor tasa de glucólisis, lo que sugiere que los asociados "efecto Warburg 'con un fenotipo maligno más alto [9]. Correspondientemente, la captación de glucosa elevada incluso en condiciones normales de oxígeno es una característica de los cánceres malignos, sin embargo, los eventos moleculares implicados no se entienden completamente. En particular, no está claro si el cambio de la respiración mitocondrial a glicolítica es primario, es decir, una consecuencia de la elevada expresión de proteínas glicolíticas, o es más bien secundaria a la disfunción mitocondrial (que constituye un equivalente del "efecto Pasteur).
la alta incidencia de cáncer en la obesidad puede señalar los factores que promueven la malignos que emanan del tejido adiposo alterado. Aunque la mayoría de los adipocitos no pueden estar en contacto físico directo con las células del colon, todavía son adipocitos locales en la grasa abdominal que se encuentran en las proximidades de tejido colónico y pueden afectar, a través de sus productos secretados, el metabolismo celular colónica. Durante células cancerosas carcinogénesis de colon pueden penetrar en el intestino, alcanzar la circulación y entrar en el hígado. En las células de cáncer de colon vía migratorias pueden encontrar vasos sanguíneos procedentes de la masa grasa y rica en adipoquinas. A lo mejor de nuestro conocimiento, es sin explorar si AT induce reprogramación metabólica de los tejidos del colon a través de la promoción de la glucólisis mejorada y /o mediante la inhibición de la respiración mitocondrial. Hacer frente a esta hipótesis, se realizó un análisis bioenergético detallada de un panel de líneas celulares de cáncer de colon humanas expuestas a medio condicionado (CM) recogidos en cultivaron visceral humana (epiplón) AT fragmentos obtenidos a partir de sujetos dentro de un amplio rango de IMC. Se presenta en el presente documento que las células de cáncer de colon HCT116 expuestos a CM de sujetos obesos muestran una reducción significativa en la tasa de la respiración mitocondrial y en el nivel de expresión génica de las proteínas mitocondriales, sin ningún cambio significativo en el nivel de expresión de las proteínas de la glucólisis. Por otra parte, nos encontramos con que la leptina puede ser una señal molecular clave de la mediación de la interacción entre las células de cáncer de colon y AT.
Métodos
recolección de la muestra humana y medio condicionado (CM) preparación
el protocolo de estudio fue aprobado por el comité de ética local del Centro Médico de la Universidad de Soroka y la Universidad de Ben Gurion. Se obtuvo un consentimiento informado por escrito para cada uno de los pacientes participantes. omental Humanos en las biopsias fueron recogidos durante la cirugía abdominal electiva, tal como se describe anteriormente [10] a partir de los no obesos (IMC: 26,2 kg /m
2 ± 0,9 (media ± SD), edad: 51,2 ± 11 años,
n
= 4) o las personas obesas (IMC: 42,1 kg /m
2 ± 5,8, edad: 38,8 ± 16 años,
n
= 10). fragmentos de tejido adiposo cultivadas (2-3 mm
3, 100 mg /ml de medio) se incubaron a 37 ° C en medio [DMEM + 10% (v /v) de FCS, 2 mM L-glutamina], se dejó sedimentar durante la noche, el medio se reemplazó, y los fragmentos se incubaron adicionalmente durante 24 horas en el mismo medio sin FCS. Los fragmentos fueron retirados con pinzas, y los medios de comunicación (CM) transferidos desde el pozo a un tubo limpio, se congelaron rápidamente (10 segundos) en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C.
Cell Culture
líneas celulares de cáncer de colon humano HCT116:, HM-7 y Caco
2 se cultivaron a 37 ° C, 5% de CO
2 en DMEM suplementado con 10% (v /v) de FCS, 2 mM de L- glutamina y 0,2% (v /v) de penicilina-estreptomicina. HCT116 y líneas celulares Caco
2 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, EE.UU.). HM-7 es una variante de células de LS174T, previamente seleccionados por su capacidad de producir grandes cantidades de mucina [11] y para ser altamente metastásico en
in vivo
[12] y
in vitro
sistemas [13]
Las células fueron sembradas en:. 0,2% de gelatina cubiertas de 24 pocillos XF24 placas (3 × 10
4 células /pocillo, Seahorse Bioscience, North Billerica, MA) para OCR y el CERA experimentos; placas de 24 pocillos (7,5 x 10
5 células /pocillo) para la proteína o la extracción de RNA. Veinticuatro horas más tarde, las células se trataron con DMEM (control), leptina (100 ng /ml), CM no obesos o con sobrepeso. Donde se indique, se añadió antagonista de leptina (1 ng /ml) a las células que se incubaron con CM.
mediciones de respiración celular
Celular OCR y el CERA se midieron utilizando el Analizador de XF24 (Seahorse Bioscience, MA , EE.UU.) como se describe anteriormente [14,15]. Para la respiración máxima, se utilizó 0,4 M FCCP. FCCP óptima concentración se determinó en experimentos preliminares. Se aisló
La extracción de RNA y PCR
ARN en tiempo real utilizando la solución de reactivo Tri (MRC, Cincinnati, OH). La transcripción inversa se realizó usando el kit de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Foster City, CA) con cebadores aleatorios en un Veriti® 96 pocillos Termociclador (Applied Biosystems). PCR en tiempo real se realizó utilizando SYBR Green (Applied Biosystems) en un Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM 7900HT. Los cebadores se describen en la Tabla S1. Todos los resultados se normalizaron a ß-actina expresión.
Western Blot
Las células se sembraron a 7,5 x 10
5 células /pocillo en placas de 24 pocillos. Después de 24 h las células fueron tratadas con DMEM (control), leptina (100 ng /ml), CM a partir de sujetos no obesos o con sobrepeso y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C. Se lisaron las células y se centrifugaron a 23.000 g, 15 min. De proteína se determinó en sobrenadantes de ensayo de proteínas a base de ácido microbicinchoninic (BCA) (Pierce, Rockford, IL). 25-50 muestras de proteína g se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Whatman, Schleicher & amp; Schuell, Dassel, Alemania) y se bloquearon en 5% (w /v) de leche descremada seco (Difco, Sparks, MD, EE.UU. ) como se describe [15]. Los anticuerpos primarios se obtuvieron de: proteínas glicolíticas - Móvil Tecnología de Señalización (Danvers, MA,#8337), anticuerpos Bax - Santa Cruz de Biotecnología (CA, EE.UU., SC-493), anticuerpos CYTC - BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA, EE.UU. ,#556433), anticuerpo β-actina - Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Los anticuerpos secundarios se obtuvieron de Jackson (Baltimore PA, EE.UU.). Las proteínas se visualizaron utilizando ECL kit (Rockford, IL, EE.UU.).
ensayo de viabilidad celular
3 × 10
4 células /pocillo, se cultivaron en placas de 96 pocillos durante 24 hy tratado con DMEM (control), leptina (100 ng /ml), CM a partir de sujetos no obesos o con sobrepeso para adicional 24 h. Las células se incubaron con ácido 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT, 0,5 mg /ml) durante 1 h y de una incubación de seguimiento con DMSO durante 20 min. La formación del colorante formazán de color se evaluó colorimétricamente a 550 nm en un lector de microplacas ELX 808 Ultra (Bio-Tek Instruments Inc, Londres, Reino Unido) utilizando el software KCJunior (York, Reino Unido).
Análisis de los datos
por parámetros experimentales, análisis estadísticos fueron realizados por uno y dos-way ANOVA de medidas repetidas, Mann-Whitney o Estudiante de
t-test
, como se ha mencionado en la figura leyendas. Los resultados se representan como la media ± SEM, a menos que se indique lo contrario. Todas las cifras son resultados representativos de al menos 3 experimentos independientes.
Resultados
Efectos de la leptina sobre el metabolismo HCT116
Entre los diversos factores secretados en niveles altos por obesidad AT, que evaluaron si la leptina puede participar potencialmente en la disminución de la respiración mitocondrial en la línea celular de cáncer de colon HCT116 [16]. Hemos informado anteriormente de que las células del colon poseen receptor de la leptina y que la leptina promueve la iniciación del cáncer de colon y la progresión,
in vitro
[7], además de la proliferación celular y el crecimiento tumoral [17,18]. Por otra parte, hemos caracterizado recientemente un gran número de células de cáncer de colon y se encontró un nivel de malignidad que se incrementa como sigue: Caco
2 & lt; HCT116 & lt; HM-7 [16]. Por lo tanto, se consideró que la línea celular HCT116 ser una línea de "medio malignas 'células de cáncer de colon y utilizamos estas células en nuestros próximos experimentos. Utilizando el analizador de XF24, que mide la tasa de consumo de oxígeno (OCR, sobre todo la respiración mitocondrial) y el índice de acidificación extracelular (ECAR, lactato generado a través de la glucólisis [15]) de las células HCT116. De hecho, el tratamiento con leptina de las células HCT116 dio como resultado niveles más bajos de OCR (Figura 1A) sin un cambio significativo en ECAR (Figura 1B). Además, la tasa de respiración máxima como se mide en la presencia de FCCP fue significativamente más baja después del tratamiento de la leptina (Figura 1C). Es de destacar que el tratamiento con leptina no indujo la muerte celular, de manera similar a nuestro estudio anterior [7] y se confirmó en el presente documento mediante la medición del número de células (Figura S1A) y la viabilidad celular (Figura S1B).
células HCT116 se trataron con DMEM (control), vs. leptina (100 ng /ml), durante 24 horas. (
Un
) Basal OCR, (
B Opiniones), basal ECAR, (
C
), FCCP máxima inducida por OCR (0,4 M) se midieron utilizando el Analizador XF24 (
n
= 5). *,
P Hotel & lt; 0,01 frente al control (de Student
t-test
). **,
P Hotel & lt; 0,05 frente al control (de Student
t-test
). Los resultados se normalizaron al número de células y se expresan como porcentaje de control de
El aumento de expresión de un número de enzimas glucolíticas se ha asociado con fenotipo cancerígeno (revisado en 8,19,20), incluyendo:. Piruvato quinasa (isoforma especialmente M2 tumor-específica, pero también M1 (PKM1, PKM2 [19,21])), hexoquinasa (especialmente isoforma 2, sino también 1 (HK1, HK2 [22,23])), y fosfofructoquinasa (PFK [ ,,,0],8]).
tratamiento con leptina no dio lugar a cambios significativos en los genes (Figura 2A) o proteína (Figura 2 B, C) los niveles de expresión de HK1, HK2, PKM2, o PFK. Sin embargo, el nivel de proteína de PKM1 total y isoformas PKM2 (PKM1M2) fue significativamente mayor en las células de leptina tratados (Figura 2B, C), lo que sugiere que la leptina puede afectar a la vía glucolítica al menos en cierta medida (posiblemente por el aumento de PKM1), aunque no se refleja en ECAR.
células HCT116 se trataron con DMEM (control) frente a la leptina (100 ng /ml), durante 24 horas. (
Un
) los niveles de expresión génica fueron detectados utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (
n
= 4). (
B
) lisados de células totales se analizaron por transferencia de Western. (
C
) se hizo Densitométricas análisis de los datos de Western blot. *
P Hotel & gt; 0,05, frente al control respectivo de cada proteína (de Student
t-test
).
mitocondrial respiración podría verse afectada por una variedad de cambios en los genes mitocondriales, incluyendo aquellos que codifican los complejos de la cadena respiratoria , que también se ven afectados por la carcinogénesis [24,25]. A continuación se evaluó si el OCR disminución inducida por la leptina está asociada con cambios en el perfil de genes y la expresión de la proteína de las principales proteínas mitocondriales. Que mide los niveles de mRNA de los genes de la cadena de complejos respiratorios: Complejo 1 (
ND1
,
NDUFA13
), complejo 2 (
SDHB /C /D
), complejo 4 (
COX1 /2/4/5
), complejo 5 (
ATP6, ATP5H
) y el citocromo C (
CYTC
). el tratamiento con leptina redujo significativamente los niveles de expresión de los genes mitocondriales codificadas nucleares:
NDUFA13, COX5, CYTC gratis (Figura 3A); y de los genes mitocondriales codificadas:
ND1, SDHD, COX2 gratis (Figura 3B). Por otra parte, el nivel de proteína de citocromo C se redujo significativamente por la leptina (Figura 3C). Estos resultados implican que la leptina, como un factor aislado; puede disminuir la masa mitocondrial y la función de las células de cáncer de colon HCT116.
células HCT116 se trataron con DMEM (control) frente a la leptina (100 ng /ml), durante 24 horas. (
Un
,
B Opiniones) los niveles de expresión de genes fueron detectados utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (
n
= 4). *,
P Hotel & lt; 0,05, **,
P Hotel & lt; 0,01 frente al control respectivo de cada gen (de Student
t-test
). (
C
) Los lisados celulares se analizaron para citocromo C (CYTC, panel superior) y β-actina (panel inferior) por Western blot, y el análisis densitométrico de los datos se hizo. *
P Hotel & gt; 0,01, frente al control (Estudiante de
t-test
).
Efectos de la obesidad sobre la respiración CM HCT116
efectos del medio condicionado (CM) a prueba , recogidos de visceral (epiplón) AT de obesos frente a los sujetos no obesos, en las tasas de respiración glucolíticas vs. mitocondrial en células HCT116 [16] (Figura 4). Los detalles de los sujetos se resumen en la Tabla S2.
HCT116 células fueron tratadas durante 24 horas con DMEM (control), CM recogidos de TA visceral de los sujetos no obesos (n = 4) o los sujetos obesos (n = 10) y se analizaron por su OCR (
Un
) y el CERA (
B Opiniones) niveles utilizando el Analizador XF24. *,
P Hotel & lt; 0,05 frente a los no obesos o control (prueba t de Student). (
C
) Los niveles máximos de OCR siguientes FCCP (0,4 M) se midieron usando el analizador XF24. Control (
n
= 9), no obesos (
n
= 4), obesidad (
n
= 10). *,
P Hotel & lt; 0.05 muestra frente a no obesos (prueba de Mann-Whitney). Los resultados se normalizaron a la concentración de proteína y se expresan como porcentaje de control de
Nuestros datos muestran que el CM de obesos a los condujo a una significativa. (P & lt; 0,05) disminución del nivel de OCR por ~ 40% (Figura 4A) . Curiosamente, los niveles ECAR no aumentaron por el CM obesos (Figura 4B), como sería de esperar en respuesta a la "efecto de Warburg. Además, las tasas de respiración máxima, medida por el desacoplador FCCP mitocondrial, fueron significativamente más bajos en las células expuestas a la obesidad vs células CM-expuestos a CM no obesos (Figura 4C).
En conjunto, estos resultados sugieren que CM de AT, en particular de los individuos obesos, tiene la capacidad de inhibir la respiración mitocondrial en células de cáncer de colon HCT116; un cambio característico de reprogramación metabólica típica para la transformación maligna.
Efecto de la CM obesos en HCT116 glucólisis
Teniendo en cuenta el debate a largo plazo con respecto glucolíticas frente a las funciones mitocondriales durante el cáncer [26], lo primero se verifica que la falta de aumento de la ECAR en respuesta a la CM obesos se correspondía con los niveles de expresión de proteínas glicolíticas clave. Por lo tanto, a prueba el efecto de la CM obesos en genes y expresión de proteínas niveles de estas enzimas glucolíticas clave seleccionados. Las células expuestas a los obesos CM no ejercieron ningún aumento en el gen (Figura 5A) o la proteína (Figura 5B) niveles de expresión de HK1, HK2, PKM1, o PFK en comparación con las células expuestas a la CM no obesos. Por el contrario, una disminución significativa en el nivel de mRNA de
PKM2
(Figura 5A) se observó, pero esto no se asoció con una disminución paralela de los niveles de expresión de proteína (Figura 5B). HM-7 y Caco se utilizaron
2 células como controles para células con características más o menos malignas en comparación con HCT116, respectivamente [16]. Nuestros resultados muestran una correlación positiva entre el nivel de malignidad de las células y el nivel de expresión de la proteína de HK1 y PKM2, mientras que el nivel de expresión de PFK se redujo en la línea celular HM7 (Figura 5B, C). Esto está en correlación con la disminución del cociente /ECAR OCR de las células de cáncer de colon con el nivel de malignidad (Caco
2 & lt; HCT116 & lt; HM-7, Figura S2). Estos resultados son consistentes con los resultados reportados para los tejidos de cáncer y proliferación de las células activas [27]. Todos juntos, estos resultados sugieren que los cambios en la expresión de enzimas glicolíticas no pueden explicar los efectos respiratorios inducidos por la CM obesos. Esto nos llevó a probar si CM altera la función mitocondrial.
HCT 116 fueron tratadas las células durante 24 horas con CM recogidos de TA visceral de los sujetos no obesos (
n
= 4) o con sobrepeso sujetos (
n
= 9). (
Un
) niveles de expresión génica Bax fueron detectados utilizando cuantitativa en tiempo real PCR. *,
P Hotel & lt; 0,05 frente respectiva muestra no obesos de cada gen (prueba de Mann-Whitney). (
B
) Los lisados celulares se analizaron por Western blot. HM-7 y Caco
2 se utilizaron como controles (ver Resultados) (
C
), el análisis densitométrico de los datos de transferencia de Western. *,
P Hotel & gt; 0,01, **,
P Hotel & lt; 0,05 (ANOVA de dos sentidos, prueba de Bonferroni) guía empresas
Efecto de la CM obesos en HCT116 células mitocondrias
En comparación con. no obesos CM, las células incubadas con los obesos CM mostraron significativamente más bajos niveles de mRNA de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial (Figura 6). Se detectó la disminución de genes codificados por cualquiera nuclear (Figura 6A) o ADN mitocondrial (Figura 6B), lo que sugiere conjuntamente menor masa mitocondrial. ATP sintasa (ATP5H, ATP6) exhibió disminución tendencia similar. Es de destacar que la obesidad CM no disminuyó el número de células (Figura S3 A) ni la viabilidad celular (Figura S3 B). Además, las células HCT116 tratadas con el CM no obesos expresaron altos niveles de genes y proteínas de Bax, un importante miembro de la familia Bcl-2 pro-apoptóticos [28], en comparación con el control o las células CM-tratada obesos (Figura 6C, D ). En conjunto, estos resultados demuestran la disfunción mitocondrial severa de las células HCT116 inducidas por CM de los individuos obesos.
células HCT116 se trataron durante 24 horas con DMEM (control), CM recogido de visceral AT de sujetos no obesos. (
Un
,
B Opiniones) los niveles de expresión de genes fueron detectados utilizando cuantitativa en tiempo real PCR. Obesos (
n
= 8), no obesos (
n
= 4). *,
P Hotel & lt; 0,05, **,
P Hotel & lt; 0,01 frente respectiva muestra no obesos de cada gen (prueba de Mann-Whitney). (
C
) los niveles de expresión génica fueron detectados utilizando cuantitativa en tiempo real PCR. Control (
n
= 3), no obesos (
n
= 4), obesidad (
n
= 9). *,
P Hotel & lt; 0,05, frente al control (Mann Whitney), **
P Hotel & lt; 0,05, frente a los no obesos (Mann Whitney). (
D
) Los lisados celulares se analizaron para Bax (panel superior) o β-actina (panel inferior) anticuerpos, por Western blot y análisis densitométrico se hizo. líneas blancas verticales denotan imagen de empalme para presentar solo las bandas correspondientes, para mayor claridad (que se muestra es una sola mancha). Control (
n
= 3), no obesos (
n
= 3), obesidad (
n
= 6). *,
P Hotel & gt; 0,01 frente al control (One Way ANOVA, prueba de Tukey). **,
P Hotel & lt; 0.001, en comparación con las muestras no obesos (ANOVA de una vía, la prueba de Tukey).
Por último, como se demostró anteriormente que la concentración de leptina en el CM se correlaciona directamente con el IMC de los donantes de tejido adiposo [29 ], por tanto, se determinó si la leptina secretada a partir de explantes de tejido adiposo podría mediar el efecto de la obesidad-CM en la respiración celular de cáncer de colon. De hecho, la adición de antagonista de leptina, que bloquea la acción de la leptina [30], protegidas significativamente contra la disminución de OCR que fue inducida por la CM obesos (Figura 7).
células HCT116 se trataron durante 24 horas con CM recogidos de TA visceral de los sujetos no obesos o con sobrepeso, con o sin antagonista de leptina (1 ng /ml). los niveles de OCR se midieron utilizando el Analizador XF24. No obesos (
n
= 4), obesidad (
n
= 7), antagonista no obesos (Lepa no obesos,
n
= 3), obesidad antagonista (Lepa obeso,
n
= 6). *,
P Hotel & lt; 0.05 vs. muestras de (la prueba t de Student) obesos. Los resultados se normalizaron a la concentración de proteína y se expresan como porcentaje de control.
Discusión
El tejido adiposo es un importante órgano endocrino que afecta a todo el metabolismo del cuerpo. En algún momento durante la progresión de la obesidad, diversos estímulos de estrés pueden conducir a un AT disfuncional, que a su vez, se secreta interrumpido señales que pueden alterar la función de las células y tejidos (comunicaciones paracrinos y endocrinos) adyacentes o distantes. Esta diafonía interrumpido puede contribuir a la inflamación, al desarrollo de resistencia a la insulina y a la aparición y /o progresión de varios tipos de cáncer (revisado en 4,31). De hecho, la obesidad ha sido ahora claramente asociada con un mayor riesgo para el desarrollo de diferentes tipos de cáncer, particularmente cánceres de tejidos periféricos que se encuentran en las cercanías de la visceral AT (tales como: hígado, colon, páncreas, riñón [1,2] ). Un estudio pertinente se informó recientemente por Sung et al. [32] que demostraron que en ratones en los que se indujo la carcinogénesis de colon químicamente, se producen el mayor número de tumores de colon en ratones alimentados con una dieta alta en grasas. Esto se asoció con la grasa abdominal superior y las concentraciones de leptina, insulina y IGF-1. De hecho, se ha revisado recientemente que la obesidad visceral EN ejerce diversos efectos sobre la progresión del tumor en las distintas etapas de la carcinogénesis [4]. Sin embargo, la contribución básica del AT a la fisiología del tumor no está claro ni son los mecanismos implicados. Se presenta en el presente documento que AT del sujeto obeso puede promover la progresión del cáncer mediante la inducción de alteraciones metabólicas y, especialmente, la disfunción mitocondrial.
metabolismo energético de las células resulta de la interacción de los dos principales vías bioenergéticas, la fosforilación oxidativa y la glucólisis [33 ]. Está bien establecido que una alteración metabólica frecuentes observados en las células tumorales es una tasa de glucólisis más alta y la producción de ácido láctico debido a la expresión aumentada de genes que codifican enzimas glicolíticas y los transportadores de glucosa ([34] y ref. En el mismo). Sin embargo, nuestros resultados muestran sólo un efecto leve de la leptina sobre la glucólisis. Desde la proliferación celular no se vio afectada por el CM de obesos a estos resultados se puede explicar por el hecho de que muchos tumores producen la mayor parte de su ATP (& gt; 80%) por la respiración mitocondrial [33], [35], que es mucho más eficiente de la glucólisis. Por otra parte, no todos los hallazgos apoyan cambios glucolíticas con la tumorigénesis. En cambio, algunos apoyan una producción de ATP mitocondrial mejorado para soportar la demanda de energía de las células del cáncer [36,37]. Es de destacar que nuestros resultados no se pueden descartar los cambios en la captación de glucosa y la utilización de productos intermedios glucolíticas aguas arriba de la leptina /CM obesos. Los estudios futuros sobre si y cómo los cambios en la utilización de glucosa y metabolismo de la glucosa se cambian por la leptina o CM obesos pueden ser un componente mecánico del efecto de la obesidad /leptina, además de alteraciones en la respiración mitocondrial
.
Muchas moléculas pueden preverse a mediar en la diafonía entre los obesos AT y cáncer de colon. La leptina es una hormona producida por el AT en correlación con la adiposidad toda la grasa corporal. Se sabe que afectan a la ingesta de alimentos a través de acciones centrales [38], sin embargo, también ejerce acciones periféricas a través de sus receptores en los tejidos periféricos (tales como: hígado, músculo, AT, colon [7,39]) y puede estar presente en alto las concentraciones en los tejidos periféricos rodeados por el depósito de grasa visceral. De hecho, los informes que se acumulan sugieren leptina como un candidato central de articulación entre la obesidad y el cáncer, incluyendo: (a) la leptina promueve la progresión del cáncer de colon y la agresividad [7,40], la proliferación celular y el crecimiento tumoral [17,18]; (B) la leptina promueve tumores mamarios en ratones obesos [41]; la expresión (c) del receptor de la leptina se incrementa en los tejidos tumorales y es necesario promover la progresión del tumor [42]; y los niveles de (d) de leptina y del receptor de la leptina se utilizan para indicar la progresión del cáncer de mama [43]. De hecho, nuestros datos presentan evidencia de alteraciones metabólicas inducidas por la leptina en células de cáncer de colon HCT116 que son similares a los observados por el CM obesos. Nuestros resultados son consistentes con un informe anterior de Park et al. (2012) en ratones, mostrando que las células epiteliales tumorales que carecen de receptor de leptina poseen mayor nivel OCR basal y máxima en comparación con las células con receptor de leptina normal [42]. Curiosamente, Park et al. no se detectó una diferencia significativa en la expresión de genes mitocondriales ni en el nivel de OCR siguiente tratamiento con leptina. Esta discrepancia se puede explicar por las diferentes configuración del experimento, utilizando células epiteliales tumorales ratones frente a células de cáncer de colon humano; y por las diferentes concentraciones de leptina utilizado. La disfunción mitocondrial tras el tratamiento de 24 horas con la leptina puede ser una consecuencia de aumento inicial de la oxidación de ácidos grasos debido a mayores concentraciones grasos de ácidos y AMPK activación [44], con el fin de apoyar la demanda aumentado-ATP de las células del cáncer [36 , 37]. Esto puede derivar en daño mitocondrial después, como se demuestra en el corazón [45]. De hecho, tras la exposición inmediata de las células HCT116 a CM, se observó un aumento OCR (no mostrado).
Es importante destacar que se encontró que las células HCT116 expuestos a los obesos CM mostró niveles basales de OCR y máximas más bajas junto con la expresión más baja los niveles de los genes nucleares y las mitocondrias-codificado, lo que sugiere un papel central para la mitocondria en la reprogramación metabólica del cáncer de colon por la obesidad. De apoyo de nuestros resultados, se ha demostrado que las mitocondrias desempeñan un papel clave durante la tumorigénesis (revisado en 24,25), donde puede ser disfuncional debido a defectos en el proceso de fosforilación oxidativa y /o debido a ADN mitocondrial inferior [20, 24]. Los ejemplos incluyen: NDUFA13 (GRIM-19), una subunidad esencial del complejo 1, se reduce en el carcinoma colorrectal [46]; DSS, complejos 2 subunidades, se consideran los genes supresores de tumores, ya que sus mutaciones conducen a la tumorigénesis; y COX2, complejo 4 subunidad, se reduce en muchos tipos de cánceres ([24] y ref. en el mismo). Por otra parte, se encontró ADN mitocondrial a reducirse en los estados de la obesidad [47] y el cáncer ([20], [24], pero ver 25). El mecanismo puede incluir aumento de la degradación mitocondrial (mitofagia) y /o inferior proliferación mitocondrial [20]. El estrés oxidativo mejorada en las células cancerosas puede disminuir la expresión de genes mitocondriales [48]. Lo más importante, la disminución en el ADN mitocondrial se correlaciona con la progresión y la agresividad de malignidad del cáncer. Este fenómeno permite que el ADN mitocondrial de ser una herramienta de diagnóstico para evaluar la progresión del cáncer ([24,25] y ref. En el mismo). En conjunto, los resultados sugieren que la obesidad avanza células de cáncer de progresión y la agresividad, resultando en una enfermedad más grave.
Otro resultado interesante es la observación de que las células HCT116 expuestos a CM obesos no son capaces de aumentar la expresión de Bax, en contraste con los no obesos células tratadas con CM (Figura 6C, D). Aunque el nivel de actividad Bax, per se, no se midió, la explicación podría incluir la teoría 'mitocheckpoint' (analizado en 24), en referencia a la capacidad mitocondrial sobre-venir estímulos nocivos mediante la restauración de la función mitocondrial o la promoción de la apoptosis usando cambios de expresión génica. En los casos en que las mitocondrias son disfuncionales, las células se volverían resistentes a la apoptosis y, por tanto, el estímulo lesiones pueden conducir a la tumorigénesis. Los complejos respiratorios se consideran ser el mecanismo mitocondrial 'punto de control' jugar un papel en la represión de la tumorigénesis. Por lo tanto, nuestros resultados pueden sugerir mitocondria disfuncional de las células de cáncer de afectados. El aumento de los niveles de Bax inducida por el CM no obesos pueden explicarse por la producción adipo-citoquinas por el AT que son diferentes entre el AT obesos y no obesos debido a las poblaciones diferencial de macrófagos (la mayoría de los macrófagos en magra AT son los macrófagos M2 mientras que en Los macrófagos son obesos M1 [31]). Cuando la disección de la relación entre la obesidad y el cáncer de colon estos resultados añaden información valiosa y novedosa para poner de relieve la mitocondria como un factor clave en este proceso.
Por último, hemos detectado una protección significativa contra de antagonista de leptina inducida por la obesidad-CM reducción de OCR (Figura 7), apoyando el importante papel de la leptina en el efecto de la obesidad mitocondrial en las células de cáncer de colon. De hecho, Amemori et al.