Extracto
Antecedentes
Las únicas opciones terapéuticas que existen para el carcinoma de pulmón de células escamosas (SCC) son estándar de radiación y la quimioterapia citotóxica. Las células madre del cáncer (CSC) son la hipótesis para dar cuenta de la resistencia terapéutica, lo que sugiere que las CSC deben ser específicamente. A continuación, se analiza el transcriptoma del CSC y no CSC subpoblaciones por la RNA-seq para identificar nuevas estrategias terapéuticas potenciales para la SCC.
Métodos
ordenado de SCC en CD133- y CD133 + y subpoblaciones luego se examinan tanto por análisis de número de copias (CNA) y la secuenciación de todo el genoma y transcriptoma. Analizamos del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA) transcriptome datos de 221 SCC para determinar la generalidad de nuestras observaciones.
Resultados
Los dos subpoblaciones altamente expresado numerosas isoformas de mRNA cuyos productos proteicos son dianas de fármacos activos para otros tipos de cáncer; 31 (25%) corresponden a 18 genes bajo investigación activa como objetivos MAB y un adicional de 4 (3%) son de interés terapéutico. Por otra parte, hemos encontrado pruebas de que las dos subpoblaciones se proliferatively impulsados por niveles muy elevados de c-Myc y la isoforma larga TRAIL (TRAIL
L) y que las respuestas normales de apoptosis a alta expresión de estos genes fue impedido por altos niveles de Mcl- 1
L y Bcl-x
L y C-flip
L-isoformas de qué medicamentos están ahora en desarrollo clínico. SCC datos de RNA-seq (n = 221) de TCGA apoyaron nuestros hallazgos. Nuestro análisis es incompatible con el concepto de CSC que la mayoría de las células de un cáncer han perdido su potencial proliferativo. Por otra parte, nuestro estudio sugiere cómo dirigirse a las subpoblaciones tanto el CSC y no CSC con la estrategia de un tratamiento.
Conclusiones
Nuestro estudio es relevante para SCC, en particular para los que presenta numerosas opciones potenciales para la norma la terapia que se dirigen a todo el tumor. De este modo, se demuestra cómo la secuenciación del transcriptoma proporciona información detallada sobre las bases moleculares de las células cancerosas de multiplicación que, de forma importante, pueden ser aprovechados para identificar nuevas opciones terapéuticas potenciales para los cánceres más allá de lo que es posible con la secuenciación de ADN
Cita.: Barrett CL, Schwab RB, Jung H, Crain B, Goff DJ, Jamieson CHM, et al. (2013) La secuenciación del transcriptoma de subpoblaciones tumorales revela un espectro de opciones terapéuticas para el cáncer de pulmón de células escamosas. PLoS ONE 8 (3): e58714. doi: 10.1371 /journal.pone.0058714
Editor: Marc Lenburg, Boston University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 17 de octubre de 2012; Aceptado: 5 Febrero 2013; Publicado: 20 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Barrett et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Centro para el Premio de Ciencia traslacional (UL1RR031980 y UL1TR000100) desde el Centro Nacional de Recursos de Investigación, tres subvenciones (1R21CA152613-01, 1R21CA155615-01A1, CA69375) del Instituto Nacional del cáncer, cuatro subvenciones del Instituto de Medicina Regenerativa de California (CL1-00502, RT1-01108, TR1-01250, TR2-01789) y una subvención del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (P30 AI036214). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción el cáncer de
pulmón representa el 28% de todas las muertes por cáncer, el porcentaje más alto de todos los tipos de cáncer [1]. Cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa el ~85-90% de los cánceres de pulmón, de los cuales el adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas son los subtipos más comunes [1]. A pesar de que más del 70% de los pacientes con CPNM han avanzado enfermedad que rara vez es curable cuando se diagnostica, los nuevos avances para subconjuntos de los adenocarcinomas de pulmón que albergan mutaciones de EGFR o EML4-ALK fusiones de genes que impulsan el desarrollo de terapias específicas que pueden alterar esta situación extrema [2] . Estas alteraciones genéticas se producen principalmente en los adenocarcinomas de pacientes que nunca habían fumado, y son poco comunes en los CE que está predominantemente asociado con el tabaquismo [3] - [5]. Mientras FGFR1 [6] y DDR2 [7] han surgido recientemente como posibles dianas terapéuticas para algunos pacientes SCC, inhibidores aún tienen que llegar a los ensayos clínicos. estudios de secuenciación de alto rendimiento con CPNM últimos principalmente centrado en el análisis de ADN han demostrado que algunos genes están mutados a una frecuencia suficientemente alta para ser útil para la terapia dirigida; sin embargo estos estudios predecir alteraciones del ADN que se agrupan con frecuencia en un número limitado de vías moleculares importantes que sugieren que la orientación de estas vías puede ser una estrategia terapéutica viable [8] - [12]. transcriptoma profunda (ARN-ss) perfilado de CPNM para identificar los genes con expresión desregulada que es común entre los aún no ha sido reportado tumores, aunque tales informes son de esperar dado que ésta genere TCGA [13] y otra los grandes conjuntos de datos de RNA-seq consorcios.
existen células cancerosas dentro de un tumor individual en los estados fenotípicos diferentes que a menudo presentan importantes diferencias funcionales. Una subpoblación de células con auto-renovación y capacidades iniciadoras de tumores, comúnmente referido como cáncer de células-madre-como (CSC), se han identificado en una variedad de tipos de tumores incluyendo NSCLC [14]. La evidencia creciente sugiere que las células madre cancerosas son resistentes a las terapias contra el cáncer y la metástasis son la base [15], [16], y por lo tanto son el tipo de células de cáncer primario responsable de las recaídas y la progresión de los tumores malignos. La consecuencia inmediata es que por la orientación CSC debe ser posible para erradicar la subpoblación resistente y metastásico de drogas de un cáncer [14]. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que el fenotipo CSC es de plástico y se puede reconstituir por otros no CSC, células tumorales, [17], [18]; por tanto, no sólo células madre cancerosas, pero todas las subpoblaciones tumorales que son "potencial de células madre cancerosas" deben ser dirigidos. secuenciación del transcriptoma de CSC y subpoblaciones no CSC en el CPNM podría ayudar a comprender las bases moleculares subyacentes a sus similitudes y diferencias fenotípicas y facilitar la identificación de nuevas dianas terapéuticas. Dicho análisis será un complemento importante y necesario para el grueso de perfiles de transcriptoma tumor que se está realizado por TCGA y otros
.
Las observaciones de que los CAC no puede reconstituir células madre cancerosas, y viceversa, sugieren que las diferencias fenotípicas entre estas subpoblaciones se deben a epigenético en lugar de diferencias genéticas. Por lo tanto, no se espera que los experimentos de secuenciación del exoma y el genoma dirigidos a identificar las mutaciones somáticas para revelar diferencias entre subpoblaciones ordenada CSC y los no-CSC. Por otra parte, el perfil del transcriptoma, que es una lectura de la epigenoma (es decir, las marcas de las histonas y la metilación del ADN que regulan la expresión), debe ser un excelente método para crear perfiles de células madre cancerosas y no las CSC para revelar diferencias mecánicas. La ventaja de los datos de RNA-seq más de microarrays es la capacidad de analizar las diferencias de expresión de isoformas [19]. En las células cancerosas, las isoformas de ARNm alternativos pueden producir isoformas de la proteína con actividad dominante negativa. El papel patógeno de las isoformas específicas del cáncer ha sido ampliamente demostrada en todos los aspectos de la fisiología celular, incluyendo la adhesión celular y la metástasis (CD44 y RON), el crecimiento celular y la tumorigénesis (PKM2, MDM2, FGFR2, CRK, numb), el ciclo celular (PYK ), la angiogénesis (VEGF), la apoptosis (GS3KB, CD95, Bcl-X, caspasa-2, caspasa-9), el metabolismo (PK), y resistencia a los medicamentos (AR y MRP-1) [20] - [24]. Estos ejemplos ponen de relieve la ventaja de la información a nivel de la isoforma transcriptoma sobre la expresión del gen entero para obtener conocimientos sobre los mecanismos moleculares que subyacen a CSC y las diferencias fenotípicas no CSC.
A continuación se presenta la aplicación de tecnologías genómicas de un xenotrasplante SCC que se solucionó en CSC y subpoblaciones no CSC basado en el marcador CD133 (Figura 1). CD133 (PROM1; Prominin-1) es una glicoproteína 5-transmembrana que se considera que es un marcador para la subpoblación de células madre cancerosas en ambos subtipos de NSCLC [15], [25] - [27]. En NSCLC la subpoblación CD133 + se ha demostrado que tienen mayor potencial tumorigénico en ratones SCID, para expresar niveles más altos de genes stemness y ser más resistentes a la quimioterapia convencional que el CD133- subpoblación [15]. Es importante destacar que, para que el xenoinjerto SCC sería más representativo del tumor primario, se injertaron directamente como picada tumor primario en ratones GSN y nunca fue crecido
in vitro
. El análisis de ADN de todo el genoma reveló que los cromosomas de subpoblaciones CD133 + y CD133- fueron muy trastornada de una manera muy similar; Sin embargo, como era de esperar que el tumor no albergaba mutaciones clínicamente factibles. Análisis de mRNA de empalme perfiles de expresión de isoformas de la CD133 + y subpoblaciones CD133- como resultado la identificación de SCC como un potencial nueva indicación para numerosos fármacos actualmente en desarrollo y sugieren varias nuevas dianas prometedoras adicionales. Por último, el análisis de los datos El Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) a disposición del público transcriptoma de ARN-ss de 221 SCC [28] apoya la generalidad de nuestros resultados del transcriptoma de esta enfermedad. En total, nuestro estudio demuestra la capacidad de la secuenciación del transcriptoma de las subpoblaciones celulares de cáncer ya clasificados para informar de desarrollo clínico en formas que no son posibles con la secuenciación del ADN.
Estamos ordenados las células tumorales humanas de un escamosas de xenoinjerto de cáncer de pulmón de células CD133 + y en subpoblaciones CD133-. A continuación realizó análisis CNA utilizando matrices de genotipado en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), así como tanto las subpoblaciones CD133 + y CD133-. Se compararon los genomas de la población CD133 + y la muestra de PBMC para identificar las mutaciones somáticas. Por último, se realizó la secuenciación del transcriptoma conjunto (ARN-ss) de las subpoblaciones CD133 + y CD133- para evaluar sus ARNm de la isoforma expresión diferencias y similitudes.
Métodos
xenotrasplante
Un Protección de investigación Humanos Programa Junta de Revisión Institucional de UCSD (IRB) aprobó este estudio antes de cualquier actividad relacionada con el estudio. Todos los procedimientos experimentales con animales cumplieron con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto de Investigación Animal de Laboratorio, 1996) y fueron aprobados por el Comité de Investigación Global y Desarrollo Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Pfizer. Un hombre de 75 años de edad con una historia de 30 años paquete de tabaco y un nódulo pulmonar encontrado el consentimiento informado por escrito documentado por cierto de acuerdo con este protocolo aprobado por el IRB antes de la cirugía. La resección reveló un carcinoma de células escamosas T1 moderadamente diferenciado. Una parte de su tumor resecado fresca fue tomada por el xenoinjerto en ratones NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SZJ nombre exacto cepa) (The Jackson Laboratory). pasajes posteriores se realizaron en ratones CB17.Cg-PrkdcscidLystbg /Crl de Charles River. tumor fresca picada se mezcló con Matrigel (BD Biosciences) y por vía subcutánea insertada. Los ratones se observaron hasta que crecieron tumores palpables y éstos se cosecharon para la implantación de serie y el estudio. A los dos años de seguimiento del sujeto permaneció sin evidencia clínica o radiográfica de la recaída.
El aislamiento de ARN y ADN
Los lisados de la CD133- /EpCAM + y CD133 + /+ EpCAM muestras fueron procesadas para ordenados ARN y la extracción de ADN utilizando todos Prep Mini Kit de Qiagen (Valencia, CA). Las muestras se procesaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. No más de cuatro volúmenes se cargaron en una columna de centrifugado sola RNeasy Mini. muestras de ARN total se evaluaron para determinar la pureza y la concentración utilizando el Agilent 2100 Bioanalyzer en el GeneChip Microarray Core.
ARN secuenciación
El ARN total de los directorios /EpCAM + CD133- y + /+ EpCAM tumorales subpoblaciones CD133 ( ~230 ng de cada uno) se utilizaron para generar bibliotecas enteras para la secuenciación del transcriptoma en la plataforma sólida siguiendo las recomendaciones del fabricante (Life Technologies, Carlsbad CA, EE.UU.). Las muestras de ARN fueron fragmentados por RNAsa III y se concentraron utilizando el Módulo de concentración RiboMinus (Invitrogen, Carlsbad CA, EE.UU.). fragmentos de ARN se ligaron a las mezclas de adaptador sólida y llevaron a cabo la transcripción inversa. ADNc purificados se seleccionan tamaño (150-250 pb) utilizando el kit de purificación de PCR MinElute (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.), y luego se amplifican 15 ciclos usando Solid 3 'y 5' SOLID cebadores. ADNc amplificado se purificó mediante PCR PureLink Micro Kit (Invitrogen, Carlsbad CA, EE.UU.), QC'ed por el Bioanalyzer 2100 DNA 1000 Kit (Agilent, Santa Clara, CA, EE.UU.), y se cuantificó usando el qubit 2.0 fluorómetro (Invitrogen, Carlsbad CA, EE.UU.). Las bibliotecas enteras transcriptoma se utilizaron para la fabricación de perlas con plantilla sólida siguiendo la Guía SóLIdAS con plantilla del grano Preparación y secuenciados utilizando el protocolo de 50 × 25 de extremo asociado, para cada muestra que genera más de 500 M leer pares por muestra.
Computacional el análisis de los datos de RNA-seq
secuenciación del transcriptoma de las subpoblaciones CD133 + y CD133- produjo 529 M y 531 M 50 × 25 pares de lectura, respectivamente. En primer lugar, el conjunto alineados transcriptoma de extremo emparejado lee a rRNA y tRNA genes utilizando la versión 0.6.4 de bfast f + BWA [29] y retuvo sólo aquellas parejas en las que se alineó ni de lectura, lo que resulta en conjuntos de datos que comprende 77 M y 79 M leer pares. a continuación, que se suman cada conjunto de pares retenido leer con bfast + BWA a una base de datos personalizada no redundante de las isoformas de ARNm construidos con el programa "cuffcompare" de la versión 0.9.3 de la suite de software Gemelos (79) y todos los modelos de la isoforma RefSeq [30], UCSC genes conocidos [31] y [32] Ensembl bases de datos. A continuación convertimos la alineación leer las coordenadas en el ARNm de las isoformas de la base de datos de genómica coordenadas hg19 utilizando un script personalizado. A partir de estas alineaciones se calculó de expresión y la expresión diferencial de las estadísticas con los "gemelos de" programas "y" cuffdiff de Gemelos, respectivamente. Al utilizar ambos programas se utilizó la normalización cuartil superior y la secuencia de referencia del genoma humano hg19 para la corrección del sesgo. Hemos calculado que 13.612 genes y 43.120 isoformas del gen tenían algún nivel distinto de cero de expresión en al menos una de las dos subpoblaciones. Figura S1 en la información S1 muestra un histograma de los valores de expresión de isoformas de pre-filtrada en ambas subpoblaciones de células. La mayoría de estos casos se debieron a ruido de lectura de cartografía o de la expresión génica "fugas" que es de importancia fisiológica desconocida [33], por lo que aplica mínima expresión y leer los criterios de cobertura (& gt; 1 FPKM y la cobertura del 60%) para obtener una expresión inicial isoforma estima en las dos subpoblaciones. Hemos observado que 3.844 genes con 7.558 isoformas de ARNm cumplen estos criterios mínimos. Para ser muy seguros en nuestra expresión y la expresión diferencial de los resultados, hemos aplicado el filtrado estrictos a las estimaciones iniciales de expresión isoforma; hemos limitado nuestro análisis a las isoformas de ARNm que se expresa a un nivel de al menos el 30 FPKM en una de las subpoblaciones y que fueron cubiertos durante al menos el 60% de su longitud mediante secuenciación lee. Además, para una isoforma que se llamará expresados diferencialmente, su expresión diferencial tuvo que ser significativo en un FDR de 0,01 y haber cambiado al menos de cuatro veces entre las dos subpoblaciones. La aplicación de estos criterios cedido 572 genes tenían al menos una isoforma que se expresó significativamente diferente. Como resultado final, se calculó 671 de las isoformas 43.120 (1,6%) para ser significativamente expresados diferencialmente. Tabla S1 S1 en la información muestra cómo cambian estos números para diferentes FPKM y se pliegan criterios de cambio.
Resultados
El aislamiento de CSC y no CSC subpoblaciones
Se aislaron células madre cancerosas humanas ( CD133 + /EpCAM +) y no las CSC (CD133- /EpCAM +) a partir de un xenotrasplante de cáncer de pulmón de células escamosas utilizando células activadas por fluorescencia (FACS) y, respectivamente, recogieron un total de 9.19 × 10
4 (3,4%) y 2,18 × 10
6 (96,6%) de células vivas que corresponden a las dos subpoblaciones (Figura 2). Para evaluar la calidad de nuestra especie que mide los niveles de expresión de las isoformas de CD133 (figura S2 en la información S1) en los datos del transcriptoma enteros (descrito más adelante) y observó expresión moderada de tres isoformas en la subpoblación CD133 + y ningún nivel detectable de expresión en el CD133 - subpoblación. Se realizó una segunda FACS para el mismo xenoinjerto aislado de un animal diferente y obtuvimos un número y proporción de CD133 + y células CD133- (Figura S3 S1) en la información similar. Nuestros resultados muestran que somos capaces de ordenar en puras subpoblaciones CD133 + y CD133- y que la subpoblación CD133 + constituye una fracción menor de las células cancerosas en el tumor de pulmón de células escamosas, que es coherente con los estudios publicados previamente [15], [26] .
(A) Las células vivas muestran poblaciones distintas de uno u otro ratón CD45 /MHC I o la expresión de EpCAM humana. (B) Aislamiento de las células CD133 + humanos (rojo) de las células humanas CD133- (verde) y las células positivas de ratón (azul). (C) El nuevo análisis de poblaciones celulares en el panel B muestra que las células C133 + (rojo) son el 3,4% de la población EpCAM +.
El paisaje mutacional de pulmón de células escamosas subpoblaciones tumorales
se realizó Copy Number Alteración (CNA) el análisis de microarrays (ver resultados y métodos de información S1) de la línea germinal, CD133 +, y el ADN CD133- y encontramos que aproximadamente la mitad de todo el genoma, tanto en el CD133- y CD133 + subpoblaciones participó en gran CNA (Figura S4 en Información S1). análisis de solapamiento reveló la existencia potencial de CNA específicos para cada subpoblación, pero una inspección manual de todos los CNA y teniendo en cuenta la exactitud de microarrays [34], no hemos podido identificar con seguridad diferencias. Por lo tanto concluimos que los cromosomas de la CD133 + y CD133- subpoblaciones fueron altamente alteradas de una manera en gran medida indistinguibles. Además, se analizaron los datos de la secuencia de todo el genoma de la subpoblación CD133 + y cotejo de ADN de la línea germinal y concluimos que el tumor estudiado no contenía mutaciones clínicamente viables (Cuadros S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10 , S11, S12 en Información S2 y la Figura S8 en Información S1).
Evaluación de las isoformas de ARNm de genes que codifican proteínas de superficie celular
expresión desregulada de isoformas de ARNm puede dar lugar a la generación de cáncer- proteínas de la superficie celular asociados que son potenciales dianas antigénicas para anticuerpos monoclonales terapéuticos. Para determinar esos objetivos, que mide la expresión de mRNA de 1.191 isoformas de 426 CD de la molécula [35], 354 GPCR [36], y 212 canales de iones [36] genes (992 genes en total). Hemos limitado nuestro análisis a isoformas que fueron al menos moderadamente expresado (30 FPKM) y tapado al menos el 60% de su longitud mediante secuenciación lee en una o las dos subpoblaciones CD133 + y CD133-, produciendo un conjunto de evaluación de 124 isoformas en representación de 80 genes (10,4% de los 1.191 isoformas y el 8,0% de los 992 genes) (Figura 3; Figuras S5A, S5B de información S1). De los 124 isoformas altamente expresados, 43 (en 25 genes) tienen diferencias de expresión de al menos cuatro veces (FDR & lt; 0,01), con 24 que muestra disminuyó y 19 que muestra el aumento de expresión en las células CD133 + en relación con CD133- células (Figura 3). Curiosamente, 31 (25%) de los 124 isoformas altamente expresados corresponden a 18 genes actualmente bajo investigación activa como dianas de fármacos para numerosos tipos de cáncer (específicamente ABCG2 [37], ADAM10 [38], ALCAM [39], [40], BSG [ ,,,0],41], CD151 [42], CD44 [43], CD47 [44], [45], CD9 [46] - [50], CEACAM5 [51], [52], CEACAM6 [52], CXCR4 [53], EPCAM [54], erbB2 [55], ICAM1 [56], IGF1R [57], NRP1 [58], NT5E [59], TRPM7 [60]. Es de destacar que la isoforma ABCG2 (16X mayor expresión en la subpoblación CD133 +) y la isoforma CXCR4 (4X mayor expresión en la subpoblación CD133 +) han sido previamente identificado como biomarcadores de tumor de cáncer de pulmón que inician células ahorrado por tratamiento con cisplatino [15]. Además de estos 18 genes bajo investigación activa como fármaco dirigido a otros dos genes altamente expresados -CD97 [61], y IFITM1 [62] -tienen sido propuesto, pero no perseguido activamente como blancos de anticuerpos terapéuticos para tumores primarios o metastásicos. Creemos que otros genes de la superficie celular altamente expresados que se muestran en la Figura 3 también pueden ser posibles dianas de medicamentos. Por ejemplo, una isoforma de DDR1, un homólogo de DDR2 que es un objetivo prometedor para SCC [7], es altamente expresado en las células CD133 +. ICAM4, que tiene un papel en la carcinogénesis demostrado y se encuentra en el locus de susceptibilidad 19p13.2 para múltiples tipos de cáncer [63], [64], está también altamente expresado. A medida que estos genes de superficie 22 celular de codificación interés terapéutico para proteínas implicadas en las interacciones célula-célula, la adhesión celular, la migración y la quimio-resistencia, sus similitudes de expresión y las diferencias identificadas para ilustrar cómo los análisis a nivel de la isoforma pueden proporcionar un nuevo nivel de información tanto para la comprensión la fisiología de, y para la orientación, las subpoblaciones tumorales específicos.
indicados son los niveles de expresión de isoformas de 1.191 426 CD molécula, 354 y 212 GPCR genes de los canales de iones. círculos grises corresponden a isoformas que no cumplieron con los criterios de nivel mínimo de expresión y los círculos azules de isoformas que sí, pero no eran expresados diferencialmente de manera significativa. triángulos de color indican isoformas significativamente expresados diferencialmente; triángulos que apuntan hacia abajo verdes indican una disminución en la expresión y triángulos apuntando arriba rojos indican una mayor expresión en las células CD133 +. Las líneas grises diagonales son clinas de cambio veces. Isoformas discutidos en el texto se nombran. Tenga en cuenta que CD133 /PROM1 no cumple con nuestro criterio de expresión, que subyace a la rigurosidad de nuestro filtrado de datos; pero se muestra para la comparación. Aquí símbolos uso aprobado por la HGNC de genes [96] y de las denominaciones de isoformas de UCSC [31].
Para evaluar el grado en que una alta expresión de las terapéuticamente atractivos proteínas de la superficie celular descritos anteriormente para el tumor estudiado es la un fenómeno común en las CEC que examinó los datos del TCGA transcriptoma de 221 cánceres de pulmón de células escamosas [28], [65]. Es importante destacar que la secuenciación se realiza en TCGA tumoral mayor, por lo que se espera que la composición subpoblación a ser bastante diferente de las subpoblaciones CD133 + y CD133- del carcinoma de células escamosas en nuestro estudio. La expresión de datos a disposición del público TCGA se analiza en el exon-, desprovistas de diafragma de empalme, y los genes a nivel. Puesto que no hay forma establecida para inferir la expresión a nivel de la isoforma de exón y expresión nudo de empalme, que elegimos para comparar nuestro nivel de expresión de genes isoforma estima con TCGA expresión estimaciones nivel. Con base en el hecho de que nuestro análisis se centró en las isoformas con alta expresión, razonó que si nuestros hallazgos son generales a SCC entonces nosotros observamos una alta expresión de los genes completos correspondientes a través de la mayoría de las muestras tumorales 221. Como se muestra en la Figura 4A, 4C, la mayoría de los 22 genes de la superficie celular de interés terapéutico se expresan robustamente en los 221 muestras con 12 colocación en el 10% (mediana de expresión & gt; 31 RPKM) de los genes más altamente expresados. Curiosamente, ABCG2 y ICAM4, que tienen los dos niveles más bajos de expresión de los 22 genes, se expresan predominantemente en la subpoblación CD133 +. Esta situación refleja la de CD133 /PROM1 (Figura 3), de modo que especular que la expresión aparentemente de bajo ancho tumor de ABCG2 y ICAM4 se debe a que se expresan robustamente sólo en las células CD133 +, que constituyen una fracción menor de las células tumorales. En general, estos resultados indican que nuestros hallazgos son generales para SCC y así podrían afectar el desarrollo clínico porque se identifican esta enfermedad como una potencial nueva indicación de numerosos fármacos actualmente en desarrollo y sugieren varios nuevos objetivos prometedores adicionales.
A) La superficie celular y B) de genes relacionados con la apoptosis toda expresión estimaciones de muestras de carcinoma de células escamosas de pulmón 221. C) La distribución de los niveles de expresión estimado de 20,533 genes por ejemplo, promediado en los 221 muestras. La línea horizontal de puntos indica la parte superior del 5% de los genes, cuando se clasificó por la expresión.
Evaluación de las isoformas de mRNA de los genes implicados en la apoptosis
Teniendo en cuenta la magnitud de las alteraciones genómicas observadas en el el análisis de la CNA SCC estudiado y la multitud de mecanismos de muerte celular conocidos que responden al daño del ADN, se sospecha que las células cancerosas deben haber alterado la expresión de los genes relacionados con la apoptosis con el fin de sobrevivir bajo una alta carga tales mutacional. Para hacerse una idea de la capacidad de supervivencia de las subpoblaciones CD133 + y CD133-, se realizó un análisis de la expresión centrado en un conjunto de 106 genes relacionados con la apoptosis (Tabla S2 en la información S2) que en conjunto tenían 434 isoformas de ARNm. Como el anterior, hemos limitado nuestro análisis a isoformas que se expresa a nivel de al menos el 30 FPKM y que fueron cubiertos durante al menos el 60% de su longitud mediante secuenciación lee en una o ambas de las subpoblaciones. Treinta de los 106 genes (28%) y 37 de los 434 isoformas (9%) cumplen estos criterios (Figura 5; Figura S6 en Información S1). Curiosamente, sólo 9 isoformas en 6 genes fueron significativamente expresados diferencialmente con al menos una diferencia de cuatro veces entre las dos subpoblaciones (FDR & lt; 0,01). Es de destacar la alta expresión de una isoforma L-Myc (MYCL1, uc001cer) y una isoforma XIAP (XIAP, ucoo4etx) en ambas subpoblaciones, con la regulación positiva de cuatro veces en el CD133 + y las subpoblaciones CD133-, respectivamente. L-Myc es un factor de transcripción que actúa a nivel mundial y de todas las proteínas de la familia Myc (N-Myc, c-Myc, y L-Myc) que tiene la actividad más fuerte y específica en la promoción de IPSC humana generación, presumiblemente a través de su capacidad para suprimir genes de diferenciación asociada a [66]. XIAP es un supresor de bien conocida de la apoptosis, además de otras funciones fisiológicas relacionadas con su actividad de ubiquitina ligasa E3 [67]. También son dignos de mención los pocos isoformas (es decir BCLAF1 y BFAR isoformas) con & gt; 16 veces la expresión diferencial. BCLAF1, que tiene una isoforma altamente expresado sólo en la subpoblación CD133-, juega un papel crítico en muchos procesos [68], incluyendo el desarrollo pulmonar [69]. BFAR, una ubiquitina ligasa E3 que probablemente media la diafonía entre las vías de apoptosis intrínsecos y extrínsecos [70], tiene una isoforma expresada exclusivamente en CD133 + y otro exclusivamente en CD133-. Estos resultados sugieren que, aunque en general las subpoblaciones CD133 + y CD133- parecida expresan genes relacionados con la apoptosis, las diferencias de expresión de isoformas de genes clave de la apoptosis pueden en parte contribuir a las diferencias auto-renovación y de supervivencia entre estos tipos de células de cáncer.
indicados son los niveles de expresión de las isoformas 434 de 106 genes relacionados con la apoptosis. círculos grises corresponden a isoformas que no cumplieron con los criterios de nivel mínimo de expresión y los círculos azules de isoformas que sí, pero no eran expresados diferencialmente de manera significativa. triángulos de color indican isoformas significativamente expresados diferencialmente; triángulos que apuntan hacia abajo verdes indican una disminución en la expresión y triángulos apuntando arriba rojos indican una mayor expresión en las células CD133 +. Las líneas grises diagonales son clinas de cambio veces. Isoformas discutidos en el texto se nombran. Isoformas discutidos en el texto se nombran. Aquí símbolos uso aprobado por la HGNC de genes [96] y de las denominaciones de isoformas de UCSC [31].
A continuación centramos en los genes relacionados con la apoptosis más altamente expresado en tanto las subpoblaciones CD133 + y CD133- para ganar conocimientos sobre los mecanismos de supervivencia comunes entre estos tipos de células de cáncer. Este análisis se centró reveló c-Myc (MYC, uc003ysi), y las largas isoformas de TRAIL /TNFSF10 (TNFSF10, uc003fid), MCL-1 (MCL 1, uc010pch), y Bcl-x (Bcl2l1, uc002wwl) que están entre los más genes relacionados con la apoptosis altamente expresados (Figura 5). Se confirmó por RT-qPCR la alta expresión de c-Myc, MCL-1
L, y Bcl-x
L, tanto en el CD133 + y subpoblaciones CD133- (Figura S7 en la información S1). Está bien establecido que la expresión de alto c-Myc induce potentemente la vía de la muerte celular intrínseca (mitocondria mediada); No obstante alta expresión simultánea de MCL-1
L y Bcl-x
L puede secuestrar las proteínas de membrana externa mitocondrial Bak y Bax [71], [72], y con ello bloquear las consecuencias apoptóticos de c-Myc. Este papel de MCL-1
L y Bcl-x
L se ha demostrado recientemente en 14 líneas impulsadas-c-Myc no escamosas de cáncer de pulmón de células humanas de células [73], en modelos de ratón de cáncer de pulmón adenocarcinoma [74], y en otros contextos malignidad [75]. Nuestros datos implican MCL-1
L y Bcl-x
L en el bloqueo de los efectos apoptóticos de c-Myc, tanto en el CSC y la subpoblación no CSC del carcinoma de células escamosas estudiado. Observamos que mientras que los largos isoformas de MCL-1 y Bcl-X han demostrado funciones pro-supervivencia, las isoformas cortas de estos genes, los cuales no fueron expresadas, son pro-apoptótica [76]. De alta expresión de la isoforma larga de TRAIL (TRAIL
L) en ambas subpoblaciones es significativo, ya que esta citocina está bajo investigación como un agente anti-cáncer [77], ya que puede matar selectivamente las células tumorales a través de la apoptosis mediada por receptor. Sin embargo, la exposición prolongada a altos niveles de TRAIL
L puede resultar en TRAIL
resistencia L, después de lo cual TRAIL
L se convierte en un potente inductor de la proliferación y metástasis [78]. Estudios anteriores han demostrado tanto MCL-1
L, y Bcl-x
l que se encarga de TRAIL adquirido
resistencia a la L en líneas celulares de cáncer de pulmón no escamosas [79] y en otras líneas celulares de cáncer [ ,,,0],80] - [83]. Es de destacar que otro de los principales determinantes de la resistencia a TRAIL, c-Flip
L (CFLAR, uc002uxb) -el isoforma larga del tirón /CFLAR que es un homólogo catalíticamente inactiva de la caspasa-8-está también altamente expresado en las dos subpoblaciones de nuestra SCC estudiados (Figura 5) [79], [84] - [87]. Las isoformas cortas de TRAIL y c-Flip también tienen un papel pro-apoptóticos antitéticas en comparación con las largas isoformas [79], [88]. En total, nuestro análisis de la expresión génica a nivel de la isoforma sugiere que en las CEC estudiado tanto las subpoblaciones CD133 + y CD133- fueron expulsados por los muy altos niveles de c-Myc y TRAIL
L y que la respuesta de apoptosis normal a la alta expresión de estos genes fue impedido por altos niveles de MCL-1
L y Bcl-x
L y C-flip
L.
una vez más hemos utilizado los datos del TCGA transcriptoma de 221 cánceres de pulmón de células escamosas determinar la generalidad de nuestros resultados de los análisis de genes isoforma apoptosis. Como anteriormente para ABCG2 y ICAM4, atribuimos la expresión aparentemente baja en todo el tumor de L-Myc (MYCL1) (Figura 4B, 4C) a la posibilidad de que en las CEC se expresa con firmeza sólo en las células CD133 +, que constituyen una fracción menor de las células tumorales.