Extracto
Cáncer de células madre (CSC) se consideran un subconjunto del tumor mayor responsable de iniciar y mantener la enfermedad. Varios marcadores celulares de superficie se han utilizado recientemente para identificar células madre cancerosas. Entre los es CD133, que se expresa por las células progenitoras hematopoyéticas, así como células madre embrionarias y varios tipos de cáncer. Hemos aislado recientemente y CD133 positivas cultivadas [CD133 (+)] células de diversas líneas celulares de cáncer utilizando un biorreactor de la NASA desarrollado hidrodinámico de enfoque (HFB) (Celdyne, Houston, TX). Para la comparación, otro biorreactor, se utilizó el sistema de cultivo celular rotatorio (RCC) fabricado por Synthecon (Houston, TX). Tanto el HFB y los biorreactores los CRC simulan aspectos de hypogravity. En nuestro estudio, el HFB aumentó el crecimiento de células CD133 (+) de las diferentes líneas celulares en comparación con el recipiente de los CRC y al control normal de la gravedad. Hemos observado (+) una proliferación 15 veces de la CD133 (+) fracción celular con células de cáncer que se cultivaron durante 7 días en condiciones optimizadas. El recipiente de RCCS lugar se obtuvo un (-) disminución 4,8 veces en el CD133 (+) fracción celular respecto a la HFB después de 7 días de cultivo. Curiosamente, también se encontró que el medio ambiente hypogravity de la HFB sensibilizado enormemente los (+) las células cancerosas CD133, que normalmente son resistentes al tratamiento con quimioterapia, que se vuelven susceptibles a diversos agentes quimioterapéuticos, allanando el camino a menos tóxico y más eficaz tratamiento quimioterapéutico en pacientes. Para poder probar la eficacia de los agentes citotóxicos in vitro antes de su uso en el ámbito clínico en las células cancerosas, así como en el cáncer de las células madre pueden allanar el camino a las estrategias quimioterápicos más eficaces en los pacientes. Esto podría ser un avance importante en las opciones terapéuticas de los pacientes oncológicos, teniendo en cuenta los regímenes de quimioterapia más específicos y personalizados, así como para las tasas de respuesta más altas
Visto:. Kelly SE, Di Benedetto A, Greco A, Howard CM , Sollars VE, Primerano DA, et al. (2010) Selección Rápida y proliferación de CD133 (+) Las células de cáncer de Líneas Celulares: Implicaciones quimioterapéuticos. PLoS ONE 5 (4): e10035. doi: 10.1371 /journal.pone.0010035
Editor: Annarosa Leri, Escuela de Medicina de Harvard, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Febrero, 2010; Aceptado: March 16, 2010; Publicado: 8 de Abril, 2010
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Financiación:. Esta investigación se realizó con fondos recibidos en parte por la diferenciación celular y el Centro para el Desarrollo (CDDC) en la Universidad de Marshall, NIH CA138510, CA140024-NIH, NIH-COBRE 5P20RR020180 (al PPC); Virginia Occidental NASA Subvención Consorcio Espacial (de S. K. y J.V.V.); WV-INBRE 5P20RR016477 (a D. P.). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las neoplasias pueden ser vistos como tejido consiste en una población heterogénea de células que difieren en características biológicas y el potencial de auto-renovación [1]. La naturaleza clonal de ciertos tumores malignos está bien establecida [2]. De acuerdo con el modelo de evolución clonal de las células tumorales, el cáncer se forma a través de la acumulación de cambios genéticos en las células y la selección gradual de clones [3], [4]. Por lo tanto, el tumor es considerado como tejido anormal que desciende de una única célula a través de la acumulación continua de errores genéticos y diversos cambios epigenéticos. Sin embargo, varios experimentos llevados a cabo durante las últimas décadas han demostrado que no todas las células tumorales es una célula iniciadoras del tumor (T-IC) y que hasta un 10
se requieren 6 células murinas o de tumores humanos para transplantar un nuevo tumor de una ya existente [4], [5], [6], [7]. Esta evidencia sugiere la posibilidad de que pueden existir células tumorales en un estado jerárquico en el que sólo un pequeño número de células poseen tumor potencial de iniciación. Datos recientes de ambos malignidades hematológicas y tumores sólidos han sugerido que hay sólo las poblaciones menores de células en cada neoplasia maligna que son capaces de la iniciación del tumor, que son las células madre de cáncer (CSC) [4], [5], [6], [ ,,,0],7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Estas células parecen ser capaces de división asimétrica y la auto-renovación, y son sólo una pequeña fracción entre la mayor parte de las células más diferenciadas en el tumor [16], [17], [18].
Recientemente, CSC se han estudiado en diferentes tipos de tumores primarios con el fin de desarrollar terapias-CSC específica [6], [11], [19], [20], [21]. Curiosamente, ciertos tumores son altamente resistentes a la quimioterapia y otras formas de tratamiento y aunque los tratamientos agresivos destruyen la mayoría de las células cancerosas, una pequeña fracción de las células sobreviven y, a menudo se regeneran en masas aún mayores de células tumorales [22], [23] , [24]. terapias eficaces para los pacientes de cáncer requieren un conocimiento profundo de los mecanismos que conducen al desarrollo de tumores y la resistencia a los medicamentos
.
El reciente descubrimiento de células madre cancerosas ha desempeñado un papel fundamental en el cambio de nuestro punto de vista de la carcinogénesis y la quimioterapia. CSC se cree que son responsables de la formación y el crecimiento de tejido neoplásico. Las células madre cancerosas son naturalmente resistentes a la quimioterapia más actual, debido a su naturaleza de reposo. Esto puede explicar por qué las quimioterapias tradicionales inicialmente pueden reducir la mayoría de la masa del tumor, pero no logrará erradicar en su totalidad, lo que permite la eventual recurrencia [1], [11], [17], [18], [22]. CSC son más resistentes a la terapia no sólo secundaria a la quiescencia, pero también debido a un aumento de la expresión de proteínas anti-apoptóticas y transportadores de eflujo de fármacos. tratamientos contra el cáncer disponible en la actualidad sobre todo explotar el potencial de proliferación y metástasis de las células cancerosas; Por lo tanto, la mayoría de los tratamientos están dirigidos a las células que se dividen rápidamente y a dianas moleculares que representan la mayor parte del tumor. Esto puede explicar el fracaso de los tratamientos para erradicar la enfermedad o para prevenir la recurrencia del cáncer. Además, si un fármaco afecta el crecimiento de solamente una población menor de células, sólo habrá una disminución mínima en el crecimiento del tumor en el corto plazo
.
Teóricamente, la identificación y caracterización de la CSC pueden permitir el desarrollo de modalidades de tratamiento que se dirigen a las células madre del cáncer en lugar de las células que se dividen rápidamente en el cáncer.
la exposición prolongada de los seres humanos y animales de experimentación a la alteración de las condiciones gravitatorias de los vuelos espaciales tiene efectos adversos en diferentes sistemas celulares. Los efectos del ambiente hypogravity del crecimiento de tumores y la carcinogénesis aún son desconocidos y este campo de investigación todavía carece de una investigación sistemática sobre hypogravity inducida por la expresión de genes, que es la información clave necesaria para desarrollarse en última instancia, el mecanismo detrás de las enfermedades inducidas por hypogravity. Con este fin, se han estudiado los efectos de hypogravity simulada en células de osteosarcoma humanas cultivadas en el biorreactor hydrofocusing desarrollado por la NASA (HFB) y en el sistema de cultivo celular rotatorio (RCC). Varios diseños de recipientes de pared giratoria se han utilizado para crear un entorno de cultivo en tres dimensiones con la tensión de cizallamiento variable y hypogravity la simulación de que en el espacio [25]. El HFB (Celdyne, Houston, TX) desarrollado por la NASA en el Centro Espacial Johnson, es una bóveda llena de líquido, que gira a una velocidad especificada y tiene una ruleta cónica para proporcionar una capacidad hydrofocusing único que va a permitir una extremadamente baja cizalladura ambiente de cultivo y una membrana de nylon de transferencia de gas [25]. El RCC consta de un recipiente de cultivo horizontalmente girado oxigenada por una membrana de transferencia de gas plana de caucho de silicona [26]. El biorreactor HFB diseñada por la NASA y de la RCC se han utilizado con éxito en la Tierra y en el espacio para permitir a los investigadores a utilizar hypogravity modelado o reales, respectivamente, para estudiar el papel de la gravedad en la formación de modelos de tejido de células de mamíferos en tres dimensiones y la producción de productos biológicos [25], [27], [28], [29], [30], [31].
En este estudio muestran que las células madre del cáncer son estimuladas a proliferar cuando se cultivan en las condiciones hypogravity producidos por la HFB y que la reducción de la gravedad simulada en el HFB sensibiliza células madre cancerosas a los agentes quimioterapéuticos.
resultados
células madre similares a osteosarcoma proliferan en el Hydro-Centrándose biorreactor ( HFB), pero no en el sistema de cultivo celular rotatorio (RCC)
hypogravity Siguiendo el modelo es una condición en la que las células están en caída libre constante y en el que son capaces de crecer de una manera independiente de anclaje. Dado que los efectos de hypogravity sobre los tumores son desconocidos, pensamos para investigar los efectos de hypogravity modelado en ausencia de la tensión de cizallamiento en la capacidad de crecimiento de las células tumorales de origen embrionario diferente. Hemos utilizado un HFB desarrollado por la NASA en el Centro Espacial Johnson, que se compone de una cúpula de llenado 50 ml de líquido que gira a una velocidad especificada y que tiene un spinner cónica interna que hidro-centra el cultivo celular que permite una baja cizalladura medio ambiente.
Para nuestra sorpresa, hemos encontrado que cuando un número conocido de células Saos-2 se sembraron en la HFB, sólo una pequeña fracción de estas células sobrevivieron al tratamiento, independientemente de la densidad celular se sembró en el biorreactor . La Figura 1A muestra que el número de células Saos-2 viables en cultivo durante 5 días en la HFB se redujo drásticamente.
A) Trypan azul recuento de células exclusión de células Saos-2 (células de osteosarcoma) y SAOS-2 células cultivadas en HFB, CD133 (+) células Saos-2 y CD133 (+) células Saos-2 cultivadas en la HFB, y de CD133 (+) células Saos-2 y CD133 (+) células Saos-2 cultivadas en condiciones normales condición gravedad. Las barras grises indican el número de células colocadas en el control en el día-1. Las barras negras indican el número de células viables se recuperaron después de 5 días de cultivo en que la condición de cultivo. B) Imagen de contraste de fase de campo claro (20 ×) de 3-D de cultivo (esferas) formado a partir de SAOS-2 células que se cultivaron en el HFB durante 5 días. El recuadro (arriba a la derecha) muestra una imagen de CD133 tinción de inmunofluorescencia de las células SAOS-2 cultivadas en el biorreactor durante 5 días. C) La citometría de flujo diagrama de la inmunofenotipo CD133 de SAOS-2 células. Un anticuerpo isotipo se usó como un control. D) Trypan azul recuentos de células exclusión de un experimento optimizado de la cultura HFB de SAOS-2 células en el HFB después de siete días. CD133 (+) se seleccionaron células Saos-2 cultivadas en el biorreactor y proliferaron 15 veces después de siete días. barra blanca indica el número de células SAOS-2 sembradas en la HFB. barra de color negro indica el número de viables CD133 (+) SAOS-2 células recuperadas después de 7 días de cultivo optimizado en el biorreactor. barra gris indica el número de células presentes en la población parental SAOS-2 CD133 (+). Los datos son representativos de tres experimentos separados que producen resultados comparables.
Curiosamente, SAOS-2 células cultivadas en las esferas de células del biorreactor formado y parece ser significativamente menor que las células Saos-2 se cultivaron en placas y se cosecha por tratamiento con tripsina (datos no mostrados). La Figura 1B muestra una imagen de campo claro de 20 x de esferas formadas a partir de SAOS-2 células que se cultivaron en el HFB durante 5 días. Las células se retiran del reactor HFB y se tomaron inmediatamente las imágenes usando un microscopio invertido usando contraste de fase.
Debido a su aparente cambio en la morfología y la capacidad para formar esferas en el entorno de HFB y porque otros han demostrado la presencia de CD133 (+) células dentro de sarcomas óseos primarios, así como las líneas de células de osteosarcoma MG-63, OS-521, 0S-01-187, OS-99-01, y SAOS-2 y la línea celular de condrosarcoma CS-828 [ ,,,0],32], [33], la hipótesis de que las células fueron seleccionadas HFB CD133 (+). Para probar esta hipótesis se immunophenotyped estas células con un anticuerpo dirigido contra CD133 (Miltenyi, Alemania), y encontramos que las células HFB seleccionadas fueron 100% positivas para CD133, un marcador de células madre típica de origen mesenquimal (Figura 1B, panel de inserción y la Figura 1C ). Dado que las células SAOS-2 recuperados del biorreactor fueron todos CD133 (+) (98,8%) (Figura 1C), quisimos determinar si las células CD133 (+) no sólo sobrevivieron sino que también proliferaron en el medio ambiente hypogravity. Con este fin, se seleccionaron las células CD133 (+) de las líneas de SAOS-2 o HOS celulares utilizando un sistema MACSorting y cuestionado estas células CD133 (+) a un 5 días de carrera en la HFB. Curiosamente, SAOS-2 o células HOS MACSorted con un anticuerpo contra CD133 y cultivadas en el biorreactor de 5 días aumentó en número por dos veces (Figura 1A). La Figura 1A muestra los recuentos de azul de tripano celulares exclusión de CD133 (+) 2 SAOS células viables recuperadas después de 5 días de cultivo en el biorreactor.
Después de algunos ensayos de optimización de cultivo celular, hemos sido capaces de lograr una incremento de 15 veces en la proliferación de las células madre como (+) de cáncer de CD133 a partir de los padres células Saos-2 durante un período de siete días al detener el reactor cada 24 horas y suavemente mezclando el cultivo de 10 veces, de forma ortogonal a través de una período de un minuto, lo que permitió la redistribución de los medios en la cúpula y la mezcla de los nutrientes a las células en proliferación (Figura 1D). La Figura 1D muestra que después de un protocolo optimizado de cultivo celular en la HFB, es posible seleccionar y a proliferar una población específica contenida en la línea celular parental SAOS-2. Resultados similares se obtuvieron utilizando otras líneas celulares de cáncer de tejidos de origen diferente y que expresan una cantidad variable del marcador CD133 (HOS, U2OS, T98G, U87MG, Du145, LNCaP, WI38, H23, Hep 3B, Hela, Mewo, HO-1 células, HN12 y HN30), véase la Tabla 1 y los datos no presentados.
Otra biorreactor que simula hypogravity, el sistema de 50 ml de cultivo celular rotatorio (RCC) [26] fabricado por Synthecon (Houston, TX), se utilizó para comparar los resultados obtenidos utilizando la HFB. En un experimento paralelo en el que sembramos un número igual de células Saos-2 en la misma incubadora de cultivo de tejidos con idénticas condiciones de velocidad del rotor, CO2, la temperatura y el volumen del depósito (50 ml), la HFB aumentó CD133 crecimiento de las células (+) de SAOS-2 células en comparación con el recipiente de RCC y para el control de la gravedad terrestre. 5 × 10∧6 SAOS-2 células fueron sembradas en los biorreactores HFB o los CRC de los cuales 350.000 (7%) fueron CD133 (+) y 4.650.000 CD133 (-) (Tabla 2). Los medios de cultivo, la oxigenación, la velocidad, la temperatura y el CO
2 se mantuvieron consistentemente constante para los dos sistemas de cultivo y en la misma incubadora durante un plazo de 7 días. Después de una carrera de 7 días, los vasos se recogieron y se hicieron reaccionar las células con un anticuerpo fluoresceinado contra CD133 (Miltenyi, Alemania) y se contaron usando un BD Facs Aria citómetro de flujo. Un anticuerpo isotipo se utilizó como control. De la comparación de las dos culturas de biorreactor, se demostró que un (+) aumento de 15 veces en CD133 (+) número de células (5,370,960 células CD133 +) se logró utilizando el HFB en un plazo de 7 días. No se observó proliferación de las células CD133 (+) en el cultivo derivado del recipiente de cultivo RCCS. El recipiente de cultivo RCCS mostró lugar una drástica reducción de la población de células CD133 (+) [(-) 4,8 veces disminución] a partir del número de células sembradas en los biorreactores en día-0 (Tabla 2) CD133 (+). De hecho, el número de CD133 células SAOS-2 (+) se redujo de 350.000 a 72.800 en un 7 días de carrera en el RCC, mientras que el HFB cultiva SAOS-2 CD133 (+) las células aumentaron de 350.000 a 5.370.960 durante un período equivalente de tiempo.
Debido a esta diferencia dramática en el crecimiento de (+) las células SAOS-2 CD133 en los dos biorreactores hypogravity generación (HFB y RCC), quisimos comprobar si el pH podría ser una variables que causan los efectos sobre el crecimiento celular observada. Por lo tanto, se midió el pH de los medios de comunicación de la HFB y biorreactores RCC mantiene en la misma incubadora con un nivel de CO
2 fijado en el 5% y una temperatura constante de 37 ° C antes y después de una racha de 7 días. Se comparó el pH de los medios de comunicación de la HFB y los vasos RCC con el medio condicionado de células de control cultivadas en una placa de Petri en buenas condiciones de gravedad de la tierra frente al medio D-MEM sin gastar. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las diferentes condiciones de cultivo celular por la repetición de los experimentos tres veces. De hecho, no gastado medio mostró un pH de 7,82 ± 0,04. El medio de control de las células Saos-2 cultivadas en una placa de Petri en condiciones de gravedad normal mostró un pH de 7,96 ± 0,23; medio a partir de células Saos-2 cultivadas en el HFB tenía un pH de 7,71 ± 0,23; y medio a partir de células Saos-2 cultivadas en el biorreactor de RCCS mostró un pH de 7,9 ± 0,11, demostrando que el diferente crecimiento de CD133 (+) células Saos-2 observadas entre los RCC y los vasos HFB no era debido a los cambios en el pH en el medios de cultivo.
osteosarcoma células mueren por apoptosis en el biorreactor de Hydro-enfoque (HFB)
Debido a que sólo una pequeña fracción del osteosarcoma SAOS-2, así como células HOS colocado en la celda HFB sistema de cultivo se recuperaron después de 3 ó 5 días de cultivo, hemos probado si estas células estaban siendo eliminados de la población inicial haciéndoles sufrir apoptosis. Por lo tanto, se compararon las tasas de apoptosis de las células SAOS-2 células cultivadas en la HFB durante 3 y 5 días a las células cultivadas en el HFB para 3 y 5 días MACSorted CD133 (+).
Para ello tenemos analizado SAOS-2 células se cultivaron durante 3 días o 5 días en el biorreactor y se encontró que SAOS-2 células cultivadas en la HFB durante 3 o 5 días mueren por apoptosis como se muestra mediante un ensayo de citometría de flujo de Anexina-V y de propidio tinción con yoduro de las muestras (figuras 2 B y D). 24% de las células se encontraron en la apoptosis después de 3 días de cultivo en la HFB. Curiosamente, la fracción de células que mueren por apoptosis aumentó a 62% después de 5 días de cultivo en la HFB, lo que confirma la observación inicial (Figura 1). Lo más importante, las muestras de CD133 (+) MACSorted las células cultivadas en la HFB durante 5 días no mostraron un aumento en la apoptosis mediante tinción con anexina V, en comparación con la muestra de control (Figura 2E y F). En las mismas condiciones de cultivo en la HFB, el CD133 (+) las células proliferan mientras que el CD133 (-). Las células mueren por apoptosis en lugar
A) Anexina-V tinción de SAOS-2 células se cultivaron en 1-G durante 3 días. El análisis permite distinguir en el diagrama entre las células vivas (cuadrante inferior izquierdo), a principios de células apoptóticas (cuadrante inferior derecho), células apoptóticas (cuadrante superior derecho), y células necróticas (cuadrante superior izquierdo). B) Anexina-V tinción de células Saos-2 cultivadas en el HFB durante 3 días. C) Anexina-V tinción de células Saos-2 cultivadas en 1-G durante 5 días. D) Anexina-V tinción de células Saos-2 cultivadas en el HFB durante 5 días. E) Anexina-V tinción de CD133 (+) MACSorted SAOS-2 células que se cultivaron en 1-G durante 5 días. F) Anexina-V tinción de CD133 (+) MACSorted SAOS-2 células que se cultivaron en la HFB durante 5 días. G) relativa actividad de la caspasa-3 de SAOS-2 células (población total) se cultivaron durante 5 días en el HFB comparación con SAOS-2 células (población total) cultivadas en condiciones 1G estática.
Tenemos también investigado este fenómeno mediante la medición de la actividad de las caspasas mediante el uso de un kit de caspasas colorimétricos que mide la actividad de las caspasas-3 en las muestras. De acuerdo con los datos presentados, se encontró que células Saos-2 (población total) cultivadas en la HFB durante 5 días mostraron un aumento de 1,6 veces en la actividad de caspasas-3 detectado (Figura 2 G), que es una medida de la apoptosis índice en estas células.
marcador de células Stem expresión aumenta después del cultivo en el biorreactor de Hydro-Centrándose
Tal vez el más intrigante capacidad conferida por el sistema de biorreactor de baja cizalladura giratoria es la oportunidad de estudiar , bajo condiciones controladas, la interacción de las células de un determinado tipo o la interacción de un tipo de célula con otra cuando las células en suspensión son libres de establecer sus propias asociaciones. Quisimos analizar los niveles de expresión de diversos marcadores relacionados con el desarrollo de las células madre de origen mesenquimal. La expresión de CD133, CD34, CD38, osteocalcina, Sparc, Sox-9, RunX-2, Stro-1, CD117 /c-Kit, Oct3 /4, endoglina, y la integrina-ß1 fue examinado por citometría de flujo. La Figura 3A muestra el porcentaje de células fluorescentes de los diversos marcadores examinados en células Saos-2 cultivadas en condición estática y después del cultivo en la HFB durante 5 días. Los niveles de expresión y el número de células que expresan los marcadores examinados aumentaron después de 5 días de cultivo en el recipiente de HFB en comparación con las células cultivadas en condiciones normales de gravedad. Curiosamente, las células Saos-2 cultivadas en el recipiente de HFB mostraron el mayor aumento relativo en el número de células positivas a Sox-9, CD133, la osteocalcina, la integrina-SS1, Sparc, RunX-2, y endoglina (94,7%, 89,3% , 82%, 81,8%, 81,3%, 79% y 76%, respectivamente), en comparación con SAOS-2 células cultivadas bajo una condiciones normales de gravedad. Oct3 /4, CD117, Stro-1 y CD34 también mostraron un aumento en el número de número de células positividad (75,9%, 67,5%, 47,6%, 22,36%, respectivamente) comparar 1G-crecimiento frente a las células Saos-2 cultivadas en simulado hypogravity durante 5 días. No encontramos ningún cambio en el número de células CD38 positivas en las mismas condiciones. El experimento se repitió 5 veces con resultados comparables y se calcularon las desviaciones estándar y se informó sobre el diagrama como barras de error. Figura 3B muestra un ejemplo de la tinción de inmunofluorescencia y la positividad de SAOS-2 células para CD133, Sox-9, Sparc, y CD117 /c-kit después de un crecimiento en el recipiente de HFB durante 5 días
.
A) Diagrama de los niveles de expresión de diversos marcadores biológicos. bares lavanda indican el porcentaje de células que expresan niveles basales de los diversos marcadores en células Saos-2 parentales cultivadas en condiciones normales de gravedad 1-G (control). bares púrpura indican el porcentaje de células que expresan los diferentes marcadores en CD133 (+) MACSorted células Saos-2 que se aisló a partir de células Saos-2 parentales cultivadas en condiciones normales de gravedad 1-G. Las barras amarillas indican el porcentaje de células que expresan los diferentes marcadores en CD133 (+) MACSorted SAOS-2 células que se cultivaron en condiciones hypogravity. barras de color azul claro indican el porcentaje de células que expresan los diferentes marcadores en los padres SAOS-2 células que se cultivaron en condiciones hypogravity durante 5 días, dando como resultado una población de seleccionado y proliferaron CD133 (+) células Saos-2. B) La tinción de inmunofluorescencia (40 ×) y la positividad de SAOS-2 células a CD133, Sox-9, SPARC, y CD117 /c-kit después de un crecimiento en el biorreactor durante 5 días.
CD133 células (+) crecen de forma tridimensional en el Hydro-Centrándose esferas biorreactores y en forma
el SAOS-2 CD133 (+) enriquecido en células de osteosarcoma proliferan y se reúnen en tres dimensiones como sarcospheres después de 3 días de cultivo en el biorreactor , que es otra característica de crecimiento de células madre. Las figuras 4 A y B muestran en 10 y 40 × aumento de potencia, respectivamente, las sarcospheres cultivados en el biorreactor después de 3 días de cultivo en hypogravity simulado. Curiosamente, el CD133 (+) células Saos-2 que se hicieron crecer en hypogravity simulada fueron capaces de restablecer la línea celular parental (constituida por aproximadamente 10% ± 6,8 CD133 (+) células y 90% ± 6,8 CD133 (- células) ) después de un período de una semana cuando se sembraron en placas de cultivo tratadas, que permiten para las células adherentes para insertarse en el medio ambiente de plástico. Figura 4 C y D (10 × 40 × y, respectivamente) muestra el CD133 células (+) proliferaron y seleccionados con el HFB que se cultivaron posteriormente en la unión de placas de cultivo tisular SAOS-2. En el cultivo de células reconstituido algunas células no adherentes fueron notables; éstas podrían ser las células madre-como también conocidas como células madre del cáncer.
A) HFB crecido células SAOS-2 de osteosarcoma (CD133 +) son capaces de proliferar y montar de forma tridimensional como sarcosheres después de 3 días de cultivo en el biorreactor (aumento de 10x). cultivaron células SAOS-2 de osteosarcoma B) HFB (CD133 +) son capaces de proliferar y montar de forma tridimensional como sarcosheres después de 3 días de cultivo en el biorreactor (40 aumentos). cultivaron células SAOS-2 de osteosarcoma C) HFB (CD133 +) sembradas en una placa de cultivo de plástico irradiado, reconstituir el fenotipo adjunto normal de las células parentales SAOS-2 después de una semana de cultivo (10 aumentos). Las flechas apuntan a CD133 (+) células Saos-2 que muestran un fenotipo redondeado y débilmente fijación. cultivaron células de osteosarcoma SAOS-2 D) HFB (CD133 +) sembradas en una placa de cultivo de plástico irradiado, reconstituir el fenotipo adjunta normal de las células de los padres SAOS-2 después de una semana de cultivo (40 aumentos). La flecha apunta a CD133 (+) SAOS-2 células que muestran un fenotipo redondeado y débilmente fijación.
Se sabe que las células madre similares a las esferas formarán células cuando se cultivan en placas de ultra-baja fijación. Por lo tanto, hemos probado la capacidad de CD133 (+) SAOS-2 células para formar grupos de células MAC-ordenadas si se colocan en placas de ultra-baja fijación. Su capacidad para formar grupos fue menos eficiente en comparación con aquellas células que han sido cultivadas en el biorreactor hydrofocusing, pero que todavía fueron capaces de formar esferas. Figura 5 A y B muestran esferas formadas por CD133 (+) las células en placas de ultra-bajo adjuntando SAOS-2. También probamos la capacidad de la SAOS-2 CD133 (+) MACSorted y células enriquecidas para adjuntar a los platos de cultivo de tejidos y para reconstituir la línea de células SAOS-2 parental. Como era de esperar, la MACSorted CD133 (+) células enriquecidas colocado en la unión de placas de cultivo de tejido después de haber sido cultivadas en placas de ultra-bajo adjuntando para dos semanas, se reconstituyó la línea de células SAOS-2 parental después de una semana de cultivo uniendo al plato, que se manifiesta un fenotipo aplanado y diferenciada en el tiempo. La figura 5C y D muestran células adherentes Saos-2 derivadas de CD133 (+) células cultivadas en placas de cultivo de tejido adherentes MACSorted. Figura 5 E muestra la línea de células SAOS-2 reconstituido después de 10 días de la inoculación de CD133 (+) células enriquecidas en adherir placas de cultivo de tejidos.
A) MACSorted CD133 (+) SAOS-2 células se reúnen tres dimensionalmente como sarcosheres después de 2 semanas de cultivo en placas de ultra-baja fijación (20 aumentos). B) Otro ejemplo de MACSorted CD133 (+) SAOS-2 células que forman Sarco-esferas después de 2 semanas de cultivo en placas de ultra-baja fijación (10 aumentos). células C) SAOS-2 de osteosarcoma derivadas de cultivos tridimensionales cultivados en placas de ultra-bajo adjuntando sembradas en platos de fijación muestran un adherente un fenotipo diferenciado después de 3 días. células D) SAOS-2 de osteosarcoma derivadas de cultivos tridimensionales cultivados en placas de ultra-bajo adjuntando sembradas en platos de fijación muestran un adherente un fenotipo diferenciado después de 5 días. E) 2 SAOS-osteosarcoma células derivadas de cultivos tridimensionales cultivadas en placas de ultra-bajas adjuntando sembradas en platos de fijación muestran un fenotipo adherente y diferenciada después de 10 días.
Una indicación adicional de que dos poblaciones distintas son identificables en la línea celular SAOS-2 es la evidencia de que CD133 (+) MACSorted SAOS-2 células han mejorado la capacidad de crecer en agar blando en comparación con las células parentales. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos que realizan 6 repeticiones de cada punto experimental. Igual número de SAOS-2 células y de CD133 (+) SAOS-2 células (5 × 10
3 células /pocillo) fueron sembradas en 6 réplicas en una placa de seis pocillos. La eficiencia de CD133 (+) células Saos-2 para crecer en agar blando y para montar en estructuras tridimensionales es mucho mayor que la de las células parentales SAOS-2. Seiscientos cuarenta ± 240 colonias se cuentan a partir de los-agar suave placas de 6 pocillos sembradas con el CD133 (+) SAOS-2 enriquecida en células en comparación con sólo el 20 ± 12 colonias contadas a partir de los platos suaves-agar sembradas con el CD133 (- SAOS)-2 células. Curiosamente, 120 ± 80 se contaron las colonias de las placas de agar blando se sembró con los padres células Saos-2, lo que sugiere que la capacidad de formar colonias en agar blando podría ser debido a la presencia de una fracción (consistente, sobre 10% ± 6.8) de las células madre y especies afines en la línea de células SAOS-2 que tenemos en nuestro laboratorio (Tabla 3). La figura 6 muestra un ejemplo de un ensayo de agar blando se realiza con la línea de células de tumor parental (Figura 6A) o con el CD133 (+) fracción enriquecida de células Saos-2 (Figura 6B). Las células de los padres SAOS-2 esferas, pero con una eficiencia muy baja si se compara con las células CD133 enriquecido (+) formadas.
A) microscopia de contraste de fase de un ensayo de agar blando de las células parentales SAOS-2. B) La microscopia de contraste de fase de un ensayo de agar blando de HFB CD133 (+) proliferaron SAOS-2 células. C) de propidio flujo de yoduro de análisis de citometría de células Saos-2 cultivadas en cultivo 1-G según su estado CD133 que muestra dos poblaciones distintas: el CD133 (+) y CD133 (-) las células con un perfil de ciclo celular diferente. D) El inmunofenotipo de las células Saos-2 cultivadas en 1-G frente a la cultura HFB que demuestra que las células Saos-2 cultivadas durante 5 días en hypogravity simulado contienen la mayoría de las células teñidas para Ki-67 y por lo tanto en la fase S de la ciclo celular
Otra prueba de que hay dos poblaciones distintas en la línea de células SAOS-2, que parece estar compuesto de CD133 (+) y. (-) las células, es que estos dos poblaciones diferentes tienen un perfil distinto del ciclo celular. Se realizó una citometría de flujo análisis de las células Saos-2 cultivadas en cultivo 1G y encontró que SAOS-2 CD133 células (+), que fueron ordenados por su estado CD133 y se tiñeron con yoduro de propidio, tenía un perfil de ciclo celular diferente con respecto a la CD133 (+) de la población. La figura 6C muestra un ensayo de citometría de flujo representativo de las células Saos-2 que demuestran que el CD133 (-) SAOS-2 población tenía 13,8% de las células en la fase G2 /M del ciclo celular, mientras que las células CD133 (+) mostraron un aumento la fracción (49%) de células en la fase G2 /M del ciclo celular. Se obtuvieron resultados comparables en experimentos paralelos y repetidos.
Curiosamente, 2-SAOS células cultivadas en el biorreactor durante 5 días y se tiñeron con un anticuerpo anti-CD133 (Miltenyi, Alemania) y el marcador de proliferación anti-Ki-67 aumento de la proliferación de las células demostrado en comparación con las células Saos-2 cultivadas en cultivos de 1G. La figura 6D muestra un flujo de representante ensayo de citometría de células Saos-2 que demuestran que las células cultivadas en la HFB proliferan a una velocidad diferente de la población total SAOS-2 celular. De hecho, la fracción de células Saos-2 CD133 (+), que también son positivas para Ki-67, aumentó de 14,27% a 53,98% de células que comparan cultivadas en 1G-crecimiento frente a esas células en cultivo durante 5 días en HFB simulado condición hypogravity , respectivamente. Se obtuvieron resultados comparables en experimentos paralelos y repetidos.
hypogravity simulado potencia la apoptosis y sensibiliza a las células madre del cáncer a la quimioterapia
Se cree que las CSC ser responsables de iniciar y mantener la enfermedad. Algunos tipos de tumores son altamente resistentes a la quimioterapia y otras formas de tratamiento.