Extracto
Los marcadores microsatélites se utilizan para la pérdida de heterocigosidad, el desequilibrio alélica y análisis de clonalidad en los cánceres. Por lo general, el ADN del tumor se compara con el ADN correspondiente normal. Sin embargo, el ADN normal no siempre está disponible y puede mostrar las proporciones de los alelos aberrantes debido a variaciones del número de copia en el genoma. Por otra parte, los picos tartamudeo pueden complicar el análisis. Para utilizar marcadores de microsatélites para el diagnóstico de cáncer de vejiga recurrente, que tuvo como objetivo para seleccionar marcadores sin picos tartamudeo y una relación constante entre los alelos, evitando así la necesidad de una muestra de ADN de control. Se investigaron 49 marcadores microsatélites con repeticiones tri- y tetranucleotide en regiones comúnmente perdidas en el cáncer de vejiga. Con base en el análisis de ADN de sangre 50 se seleccionaron los 12 mejores marcadores de rendimiento con unos picos tartamudeo y una relación constante entre los picos de alturas. Por marcador superior y menores valores de corte para la alelo ratios se determinaron. LOH de los marcadores se observó en 59/104 ADN tumorales. a continuación, se determinó la sensibilidad del panel de marcadores para la detección de cáncer de vejiga recurrente por ensayo de 102 muestras de orina de estos pacientes. La sensibilidad fue del 63% cuando los pacientes fueron estratificados por LOH en sus tumores primarios. Se demuestra que la selección inicial de los marcadores de microsatélites oblitera la necesidad de una muestra de sangre correspondiente. Para el diagnóstico de la recidiva del cáncer de vejiga en la orina lo que reduce significativamente los costos. Por otra parte, este enfoque facilita el análisis retrospectivo de muestras de tumor de archivo para alélica desequilibrio
Visto:. Tilborg van AAG, Kompier LC, Lurkin I, R Poort, El Bouazzaoui S, van der Keur K, et al. (2012) La selección de marcadores de microsatélites para el diagnóstico del cáncer de vejiga sin la necesidad de sangre correspondiente. PLoS ONE 7 (8): e43345. doi: 10.1371 /journal.pone.0043345
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: April 2, 2012; Aceptado: July 19, 2012; Publicado: 22 Agosto 2012
Copyright: © van Tilborg et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el programa comunitario Séptimo programa Marco FP7 /2007-2012, de acuerdo de subvención n ° 201663; Holandés Cancer Society subvención no. EMCR 2.007 a 3.863. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
análisis de microsatélites utiliza secuencias cortas repetidas, altamente polimórficos en el genoma. El número de repeticiones que forman un microsatélite específica varía a menudo entre el alelo materno y paterno. Los microsatélites se utilizan para determinar desequilibrio alélica (AI) o pérdida de heterocigosidad (LOH) en loci particulares en los genomas tumorales y pueden ser utilizados como un marcador para la presencia de células tumorales. Para este propósito de microsatélites análisis comparar la intensidad de los productos de amplificación de la paterna y el alelo materno de una muestra de tumor contra las proporciones de un control normal correspondiente (por ejemplo, leucocitos). Cuando el marcador de microsatélite es informativo (la longitud de los dos alelos difiere) la cantidad de producto de los dos alelos será el mismo. En un secuenciador capilar esta se muestra como dos picos de alrededor de la misma altura. LOH o AI de una región cromosómica en el cáncer generalmente se concluye cuando la relación entre los picos de los alelos en el ADN tumoral es más pequeño que desde 0,5 hasta 0,7 o más de 1,5-2 en comparación con el control [1], [2], [3], [4].
el cáncer de vejiga (BC) es el quinto cáncer más común en el mundo occidental después de mama, de próstata, colorrectal y cáncer de pulmón [5]. Más del 70% de manifiesto BC primaria como de bajo grado, no músculo invasivas (PTA, pT1), los tumores. Después de la eliminación de estos tumores mediante resección transuretral (RTU), la tasa de recurrencia es alta (70%) y muchos pacientes desarrollan múltiples recurrencias metacronos [6]. La progresión de un no-invasivos del músculo (CVNMI) a un cáncer invasivo muscular (MIBC) se produce en el 10-20% de los casos, especialmente si el tumor original era de alto grado [7], [8].
en la actualidad, el procedimiento estándar para el diagnóstico de BC es la cistoscopia. La cistoscopia es un método de diagnóstico invasivo que es desagradable para el paciente, que tiene que someterse a dichos controles cada 3-12 meses durante muchos años después de la resección del tumor primario. Estimamos que entre 1-2 millones de cistoscopías se llevan a cabo cada año en la UE y EE.UU. para el seguimiento de estos pacientes. Desafortunadamente, el examen citológico de las células presentes en la orina evacuada por sí solo no proporciona una alternativa segura para la detección cistoscopia debido a su baja sensibilidad, especialmente para la detección de tumores de bajo grado [9]. Del mismo modo, los ensayos basados en orina molecular actuales, tales como la hibridación fluorescente in situ (FISH), NMP22 y BTA tienen sensibilidades que son bajos para la detección de su mayoría de bajo grado y el estadio BC recurrente [10], [11]. Como resultado, un número de diferentes análisis moleculares de ADN aislado de células presentes en las muestras de orina evacuada se han desarrollado con el objetivo de mejorar la sensibilidad de la detección y reducir la frecuencia de los exámenes cistoscopia invasivos. Uno de esos ensayos implica la detección de mutaciones en el
FGFR3
de genes [12]. Las mutaciones en este gen son muy frecuentes en los tumores de vejiga pTa (hasta el 75% [13], [14]). Sin embargo, este ensayo no es una opción para la detección de tumores sin una mutación en este gen, sobre todo porque para los pacientes con un
FGFR3
tipo salvaje tumor primario, la frecuencia de
FGFR3
mutaciones en las recurrencias es mucho menor que para los pacientes con un
FGFR3
tumor primario mutante (19% y 81%, respectivamente) [15].
Muchos tumores mostrar alteraciones genómicas como las mutaciones genéticas y aberraciones numéricas que afectan a corto genómico regiones en los cromosomas enteros. Estas alteraciones genómicas específicas de tumor se pueden detectar mediante técnicas moleculares, tales como FISH [16], [17] o por análisis de microsatélites (MA). Los ensayos de detección de estas alteraciones están demostrando ser particularmente útil en la identificación de los pacientes de cáncer a través de métodos no invasivos o poco invasivos [18], [19], [20], [21]. En el cáncer de vejiga, por ejemplo, las pérdidas de partes del cromosoma o total de 9 se observan comúnmente a medida que surgen temprano en el desarrollo del tumor [22]. La progresión de la enfermedad por lo general se acompaña de alteraciones numéricas adicionales que implican el cromosoma 8p, 10 y 17p [23], [24], [25]. Nosotros y otros han demostrado previamente que la detección de cáncer de vejiga recurrente puede ser mejorada mediante el análisis de microsatélites de células obtenidas a partir de muestras de orina espontánea [4], [26].
Durante este trabajo se observó que los productos de la PCR de microsatélites con repeticiones de dinucleótidos menudo tenían múltiples (tartamudeo) picos debido a la disociación de las cadenas de ADN y reannealing aberrante. Además, muchos marcadores de microsatélites tenían proporciones aberrantes entre alturas de los picos en el ADN de control, posiblemente debido a variaciones del número de copia en el genoma. Por otra parte, la necesidad de analizar el ADN de la sangre de control hizo el ensayo de microsatélites (MA) caro [27]. Para hacer frente a estos problemas de manera más sistemática, hemos seleccionado tri- y tetranucleotide repite en las regiones genómicas comúnmente afectadas en el cáncer de vejiga y cebadores diseñados en torno a estas repeticiones para la amplificación [28]. Estos nuevos marcadores microsatélites fueron analizadas para las relaciones de la altura del pico constantes y rendimiento técnico (es decir, no hay picos tartamudeo, justo amplificación) en una serie de muestras de ADN de sangre. Las 12 mejores marcadores rendimiento se analizaron posteriormente en los ADN de orina de individuos sanos para determinar los valores de corte de la relación de las alturas de los picos con el fin de obtener una especificidad del 95%. Por último, se validó los marcadores de ADN de orina de pacientes con diagnóstico de un tumor de vejiga recurrente.
Materiales y Métodos
Se recogieron muestras de
Las muestras de sangre de 50 pacientes con cáncer de vejiga . Las muestras de orina se recogieron de 106 individuos sin antecedentes de enfermedad neoplásica. Estas muestras de tumores negativos se obtuvieron durante un estudio de cribado en los hombres de edad avanzada (más de 50 años de edad) sin signos previos de cáncer de vejiga [29]. ADN de 104 tumores primarios estaba disponible para el análisis de LOH. Todos los tumores fueron no músculo invasivo (89% Ta, T1 11%). Todos los tumores de grado 1 ó 2. muestras de orina de pacientes programados para TUR se recogieron antes de la resección de un tumor recurrente histológicamente probada en 102 pacientes. Consentimiento informado, se obtuvo de todos los pacientes, y los protocolos de investigación fue aprobado por las juntas de revisión institucional o comités de ética en los dos países involucrados (los Comités de Centro de Venezuela Dinamarca sobre Investigación Biomédica de Ética Dinamarca y el Comité Ético El médico del Centro Médico Erasmus (METC) , los Países Bajos). clinicopathological datos de estas muestras se dan en la Tabla S1.
extracción de ADN y análisis de LOH
Después de la recolección, la orina se analiza en cuanto a cantidad de leucocitos, eritrocitos y nitrito con una tira reactiva (Siemens Multistix ® 10 SG). Las células se sedimentaron por centrifugación a 3000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C. Los sedimentos celulares se lavaron dos veces con 10 ml de PBS, se resuspendieron en 1 ml PBS, se transfirió a un vial Eppendorf, y se recogieron por centrifugación durante 5 minutos a 6000 rpm. El sobrenadante se desechó y el sedimento celular se almacenó a -20 ° C hasta que el aislamiento de ADN. Se extrajo el ADN a partir de sangre, tejido tumoral (fijado con formalina en parafina (FFPE)) y en la orina y se purificaron con kits apropiados (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de ADN se midieron con un Quant-iT PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos). PCR de los diferentes marcadores de microsatélites se realizó con pares de cebadores separados de los cuales 1 oligonucleótido se marcó en el extremo 5 'con los tintes fluorescentes 6-FAM (Invitrogen). La amplificación de ADN específica se realizó en un volumen de reacción de 15 l incluyendo dNTPs 0,2 mM, MgCl2 2,5 mM, y 0,5 U AmpliTaq. Ciclo se realizó con un termociclador Biometra usando las siguientes condiciones de temperatura: 95 ° C durante 5 min, 28 ciclos a 95 ° C durante 45 s, 55 ° C durante 45 s, y 72 ° C durante 45 s, seguido de una extensión final paso de 10 min a 72 ° C. Los productos de PCR se desnaturalizaron a continuación durante 1 min a 95 ° C en formamida HiDi (Applied Biosystems) y se separaron en un ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer equipado con un conjunto de capilares 36 cm cargada con POP-7 de polímero. 500-Liz fue utilizado como estándar de tamaño interno (Applied Biosystems). El análisis de las muestras se llevó a cabo con la versión de software 1.7 de GeneMarker SoftGenetics (State College, PA).
El análisis estadístico
El paquete estadístico para las Ciencias Sociales 18 (SPSS, Inc.) se utilizó para el análisis de datos. Sensibilidad, especificidad y valores predictivos para cada marcador y para todos los marcadores. La precisión diagnóstica para el modelo con marcadores de metilación determinados por AUC (área bajo la curva). Los resultados se consideraron estadísticamente significativos valores de p. & Lt; 0,05
Resultados
Selección de microsatélites
Nuestro proyecto consistía en diferentes fases (Figura 1). anteriormente se utilizó un grupo de 20 marcadores microsatélites para la detección de cáncer de vejiga recurrente en la orina espontánea de los pacientes bajo vigilancia por posibles tumores recurrentes [4], [18], [30], [31], [32]. Sin embargo, con varios de estos marcadores que evaluaron alelo proporción era difícil debido a tartamudear picos. Además, estos marcadores no cubrieron con precisión las zonas más interesantes de LOH en tumores de vejiga. Además, en muchos pacientes la relación de alelo en el ADN de control varió posiblemente debido a las variaciones del número de copias genómicas como se muestra en la Figura 2A. Basándose en esta experiencia, decidimos seleccionar un nuevo panel de marcadores de microsatélites con una relación relativamente constante entre alelos borrando así la necesidad de una muestra de ADN de la sangre de control. Para reducir la posibilidad de formación de pico tartamudeo, se seleccionaron 49 tri- y tetranucleótido repetir que contienen microsatélites de la UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu), y el panel Généthon (http: //cedar.genetics. soton.ac.uk/pub) en las regiones de los cromosomas 8, 9, 10, 11 y 17 que muestran LOH en los cánceres de vejiga [28]. Los marcadores de microsatélites tenía que tener un nivel mínimo de heterocigosidad del 65% y una longitud de fragmentos de entre 100-300 pb para reducir las dificultades de amplificación de ADN cortado.
En el eje Y, la relación entre el se da dos alelos. En el eje X, se enumeran los diferentes marcadores de microsatélites. A. Los diagramas de caja muestran que algunos marcadores utilizados previamente tienen una gran variación en su relación de alelo basándose en un análisis de muestras de ADN de sangre de 50 individuos. B. Comportamiento de los 12 marcadores seleccionados, lo que indica que tienen muy poca variación en su relación de alelo cuando se prueba en la sangre normal y en la orina de individuos sanos. C. En el ADN del tumor primario del alelo proporción es mucho más variable debido a LOH /AI.
reproducibilidad técnica y valores límite para cada marcador
Los marcadores se ensayaron después de 50 se seleccionaron muestras de sangre y 12 microsatélites marcadores con el mayor porcentaje de heterocigosis y una relación máxima entre los alelos que estaba cerca de 1 para estudio adicional (Tabla 1, Figura 2B). Información sobre los otros 37 marcadores se da en la Tabla S2. La Figura 3 muestra electroferogramas de los marcadores. Se determinó la mejor configuración para la reproducibilidad mediante la variación de la concentración de ADN de entrada y el número de ciclos. En base a esta se optó por utilizar 5-10 ng de ADN de entrada en 28 ciclos de PCR para experimentos posteriores. Para determinar los valores de corte de tal manera que cada marcador sería del 95% específico en una prueba de orina de diagnóstico, que ellos analizaron por duplicado en los ADN de orina de 106 controles sin cáncer de 50 años. Los 12 marcadores con sus valores superior e inferior cortadas se enumeran en la Tabla 2. Tabla 2 también muestra que las desviaciones estándar son inferiores al 10%.
En el eje Y, se da la intensidad del pico. En el eje X, el tamaño de los fragmentos se da en pares de bases. En el lado izquierdo, se muestran los resultados a partir de tejido normal. Tenga en cuenta que estos marcadores tienen pocos o ningún tartamudeo picos y una proporción bastante constante (cercano a 1) entre las alturas de los dos alelos. En el lado derecho, se muestran los resultados de las muestras representativas del tumor con LOH.
Rendimiento del ensayo de microsatélites en tumores
A continuación, los marcadores fueron probados en el ADN de los tumores de vejiga primarios de 104 pacientes. Noventa y dos tumores fueron PTA, 11 eran pT1, y de 1 tumor no se disponía de información de los estadios. Veinticuatro tumores fueron de grado 1, grado 2 79, mientras que la información de grado faltaba en 1 caso. LOH o desequilibrio alélica se definió cuando la relación de los picos fue mayor que el borde superior o inferior al borde inferior, como se indica para cada marcador en la Tabla 2. LOH para uno o más marcadores se encontró en 59 tumores (57%), mientras 45 tumores no tenían LOH para cualquiera de los marcadores de la prueba. Los marcadores perdidas con mayor frecuencia fueron todos en el cromosoma 9, D9S299, D9S252, D9S752 y (LOH en 29 a 37% de todas las muestras) (Tabla 3). Cualquier LOH se encontró en 53/92 (58%) PTA, 6/11 (55%) pT1 y en 12/24 (50%) G1 y 47/79 (60%), los tumores G2. Las proporciones de los alelos en el ADN del tumor eran mucho más variable que en el ADN de la sangre o la orina normal, debido a la LOH /AI (Figura 2C).
Determinación de la sensibilidad de los marcadores para detectar recurrencias en separación de orina ADN derivado
a continuación, se determinó la sensibilidad de los marcadores para la detección de tumores recurrentes en los mismos pacientes de los cuales hemos analizado el tumor primario. Un total de 102 muestras de orina estaban disponibles, que se obtiene antes de la resección de un tumor recurrente en estos pacientes. ensayos de microsatélites se realizaron por duplicado. LOH se asumió cuando la relación de pico alelo de ambas pruebas estaba fuera de los valores de corte se muestran en la Tabla 2. Los marcadores D9S752, D9S252, D9S304, D9S299 y G10693 muestran LOH en aproximadamente el 20% de las muestras (Tabla 4). De las 102 muestras, 43 muestras no mostraron pérdida de cualquiera de los marcadores de la prueba. Si asumimos que las pruebas de falsos positivos no son posibles ya que todos los pacientes tenían una recurrencia, la sensibilidad de los 12 marcadores juntos es 58%. Sensibilidad de acuerdo con el grado del tumor primario se da en S1 Archivo. La especificidad de la prueba es, por definición, 100% porque todas las orinas se asociaron con un tumor recurrente. Si se seleccionaron muestras de orina de los pacientes cuyo tumor primario tenido LOH durante al menos 1 marcador, la sensibilidad para la detección de la recurrencia en el ADN de orina aumentó a 63%. Cuando se combina con los datos de citología, esta sensibilidad se incrementó a 80% (S2 Archivo).
Discusión
En este estudio se describe un método para seleccionar marcadores de microsatélites para determinar el número de copias y el tumor LOH -asociado que tienen un excelente rendimiento técnico. El enfoque se utilizó previamente por Frigerio et al., Que implementa umbrales-marcador específico mediante la evaluación de ADN normal de la sangre y tejido de control [1]. Sin embargo, nuestro enfoque difiere en que preseleccionado nuestros marcadores para relaciones de alelo constantes mejorando así la precisión y por el hecho de que se seleccionaron repeticiones tri- y tetranucleotide que tienen pocos o ningún picos tartamudeo. Por adelantado la evaluación de los valores de corte inferior y superior en base a un análisis de ADN de control, la necesidad de comparar las muestras de pacientes con la sangre que corresponde, por tanto, se evita. Este procedimiento de selección se puede aplicar a cualquier tipo de tumor. Este enfoque también facilita el análisis retrospectivo de muestras de tumor de archivo para alélica desequilibrio.
Hemos examinado la cantidad de ADN de entrada y el número óptimo de ciclos de PCR. La cantidad de ADN de entrada es importante porque concentraciones demasiado bajas pueden dar como resultado la amplificación preferencial de uno de los dos alelos que conducen a Lohs falsos positivos [33]. Los marcadores microsatélites son ideales para determinar la pérdida o la amplificación de regiones genómicas en el ADN derivado de FFPE debido a que ambos alelos de un marcador serán afectados de manera similar por la calidad del ADN (longitud), siempre que la diferencia de longitud entre los alelos no es demasiado grande. Análisis de microsatélites es barato con costas en el orden de alrededor de 1 euro por ensayo. Para un panel de 10 marcadores, costos, incluyendo el aislamiento de ADN, que equivaldría a menos de 15 euros. Una desventaja es que los microsatélites no son adecuados para la multiplexación. En nuestra experiencia, esto siempre conduce a una amplificación ineficiente de algunos de los marcadores y esto da lugar a grandes desviaciones estándar en experimentos duplicados.
Las pérdidas en los cromosomas 8, 9, 10, 11 y 17 son frecuentes en el cáncer de vejiga y puede ser detectados por análisis de microsatélites. Este estudio determina el potencial de detección de cáncer de vejiga mediante análisis de microsatélites en un conjunto de muestras de orina recogidas antes de la resección transuretral del tumor que lo acompaña (pre-TUR orina). El establecimiento de valores umbral-marcador específico basado en las mediciones de los coeficientes de los alelos en muestras de orina de 106 individuos sanos nos ha permitido definir la especificidad del método para el estudio posterior. Dado que los valores de umbral determinados individualmente garantizados especificidad óptima para cada uno de los marcadores analizados, se interpretó una LOH en 1 solo lugar ya como indicativo de la presencia de células tumorales. La aplicación de esta regla, se obtuvieron para muestras de orina pre-TUR una sensibilidad global del 58% para la detección de tumores recurrentes y 63% cuando los pacientes se estratificaron por LOH en su tumor primario. Esta sensibilidad es comparable a la sensibilidad que anteriormente nos encontramos con el primer conjunto de marcadores microsatélites a pesar de que el nuevo panel de marcadores fue diseñado específicamente para cubrir esas regiones genómicas que muestran LOH en tumores de vejiga invasivos no musculares (CVNMI). La precisión diagnóstica para el modelo con los 12 marcadores fue 73% tal como se determina por el AUC (área bajo la curva). Esta precisión era todavía el 73% cuando se probaron sólo seis marcadores (D9S252, D9S752, D9S304, D8S1125, D8S1130, G10693). Con esta selección, hemos sido capaces de identificar el 95% (56 de 59) de todas las muestras que muestran LOH en las pruebas para los 12 marcadores. La principal ventaja de utilizar una selección más pequeña de marcadores de microsatélites es, junto a una reducción de los costes, la reducción de la cantidad de ADN de entrada es necesario, haciendo de este ensayo también accesible para aquellas muestras en las que sólo una cantidad muy limitada de tejido está disponible.
en otros estudios se utilizó el análisis de la mutación
FGFR3
gen con el fin de diagnosticar los tumores recurrentes [34] [35].
FGFR3
mutaciones se encuentran en el 60-70% de CVNMI y por lo tanto proporcionan una herramienta ideal para la vigilancia de los pacientes ya que el ensayo de mutación es 100% específico. La sensibilidad, sin embargo, depende de la presencia de células tumorales suficientes en la orina y esto también es una advertencia para el ensayo de microsatélites. La sensibilidad aumenta cuando se analizan múltiples muestras de orina. Con una sensibilidad del 50% analizar 2 muestras aumentaría la sensibilidad al 75%, etc. Una combinación de análisis de microsatélites con los marcadores presentan aquí y el
FGFR3
prueba es el objeto de un estudio longitudinal sobre 800 muestras de orina de 147 pacientes (Zuiverloon et al., en preparación).
Apoyo a la Información
archivo S1.
LOH en pre-TUR orina de acuerdo al grado del tumor primario
doi:. 10.1371 /journal.pone.0043345.s001 gratis (DOCX)
archivo S2.
Comparación de LOH y Citología de muestras de orina-TUR pre
doi:. 10.1371 /journal.pone.0043345.s002 gratis (DOCX)
Tabla S1. .
Los datos del paciente
doi: 10.1371 /journal.pone.0043345.s003 gratis (XLSX)
Tabla S2.
detalles de los marcadores no se incluyeron en el estudio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0043345.s004 gratis (XLSX)